Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Les auteurs remercient le Flow Cytometry Core Facility du Huck Institute et l’Histopathology Core Facility du Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, pour leur soutien technique en temps opportun. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Institute for Cancer Research (KSP), du Penn State College of Agricultural Sciences, du Penn State Cancer Institute, du projet USDA-NIFA 4771, numéro d’acquisition 00000005 à K.S.P. et R.F.P.

Toutes les expériences ont été préapprouvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie.
1. Préparation des tampons et des réactifs
<ol><li>Préparer des plaques de gélose LB supplémentées en ampicilline (AP) (plaques stériles de 10 cm). Pour ce faire, dissoudre 10 g de bouillon LB avec de la gélose dans 400 mL d’eau distillée, remuer et porter le volume à 500 mL. Stériliser la solution p...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Ces études décrites ci-dessus fournissent des preuves à l’appui que la transplantation de cellules Lin- est comparable à celle de cellules LSK dans la génération de LAM murine de 1°. En outre, les données actuelles montrent également que l’injection intraveineuse est une méthode efficace et pratique pour établir la LAM murine par rapport à l’injection intraveineuse (ou r.o.).
En plus des cellules LSK, d’autres populations telles que le progéniteur granulocytaire...

La leucémie myéloïde aiguë (LAM) est un type d’hémopathie maligne d’étiologie diverse avec un mauvais pronostic1. La génération de modèles animaux de LAM jette les bases de la compréhension de ses variations complexes et de sa pathobiologie dans le but de découvrir de nouvelles thérapies2. La leucémogenèse chez la souris implique la transplantation de cellules de donneurs exprimant des oncoprotéines de fusion, y compris des fusions impliquant le gène de la leucémie de lignée mixte (MLL) pour induire puissamment la LAM, afin d’imiter la maladie chez l’homme3. Diverses origines cellulaires de cellules de donneurs ont été rapportées lors de la transplantation de LAM4 associée au gène LAM, et on sait très peu de choses sur les cellules responsables de l’origine de la maladie.
Plusieurs voies ont été développées pour la transplantation chez la souris; plutôt qu’une injection intra-fémorale, qui introduit directement des cellules donneuses mutantes dans la moelle osseuse5, une injection intraveineuse qui utilise le plexus du sinus veineux, la veine de la queue et la veine jugulaire a été largement utilisée pour générer des modèles murins de LAM 6,7,8,9. Dans le cas de l’injection rétro-orbitale (r.o.), divers inconvénients inhérents, tels que la limitation du volume, la forte demande technique, le peu de risques de tentatives répétées ou d’erreurs, et les lésions oculaires potentielles, ont été des pierres d’achoppement majeures avec peu ou pas d’alternatives viables7. L’injection de veines de queue peut avoir des problèmes similaires en plus des blessures locales; Pour faciliter la procédure, les souris ont souvent besoin d’être réchauffées pour dilater leurs veines de la queue10. Il est également difficile de localiser la veine de la queue sans source de lumière supplémentaire, en particulier chez la souche C57BL / 6 de souris. Pour l’injection de la veine jugulaire, le personnel de recherche a besoin d’une formation suffisante pour localiser la veine et limiter les complications possibles. De plus, les injections du sinus veineux et de la veine jugulaire doivent être effectuées sous anesthésie, ce qui ajoute un autre niveau de complexité. Ainsi, il est tentant d’explorer de nouvelles voies de transplantation pour faciliter l’établissement de modèles murins de LMA.
L’injection intrapéritonéale (i.p.) est couramment utilisée pour administrer des médicaments, des colorants et des anesthésiques 11,12,13,14,15; Il a également été utilisé pour introduire des cellules hématopoïétiques pour l’hématopoïèse ectopique16 et pour transplanter des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse dans divers modèles murins 17,18,19,20,21. Cependant, il a été rarement utilisé pour établir des tumeurs malignes hématopoïétiques chez la souris, en particulier pour étudier la progression de la LMA.
La présente étude décrit la faisabilité de l’injection intraveineuse dans la génération de modèles murins AML, en plus de comparer l’efficacité de transplantation des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que cellules donneuses. Ces résultats fournissent un moyen simple et efficace de générer des modèles expérimentaux de LAM et de leucémies myéloïdes connexes. Une telle méthode a le potentiel d’approfondir notre compréhension des mécanismes de la maladie et de fournir un modèle relativement facile pour tester des thérapies expérimentales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Il existe un besoin non satisfait de nouvelles thérapies pour traiter la leucémie myéloïde aiguë (LAM) et la rechute associée qui implique des cellules souches leucémiques persistantes (LSC). Un modèle expérimental de rongeurs AML pour tester des thérapies basées sur la transplantation réussie de ces cellules par injections rétro-orbitales chez des souris receveuses est semé d’embûches. L’objectif de cette étude était de développer une méthode simple, fiable et cohérente pour générer un modèle murin robuste de LAM en utilisant une voie intrapéritonéale. Dans le protocole actuel, les cellules de la moelle osseuse ont été transduites avec un rétrovirus exprimant l’oncoprotéine de fusion MLL-AF9 humaine. L’efficacité des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que CLL donneurs dans le développement de la LAM primaire a été testée, et l’injection intrapéritonéale a été adoptée comme nouvelle méthode pour générer la LAM. La comparaison entre les injections intra-péritonéales et rétro-orbitales a été faite dans des transplantations en série pour comparer et contraster les deux méthodes. Les cellules Lin- et LSK transduites avec le virus MLL-AF9 humain bien greffé dans la moelle osseuse et la rate des receveurs, conduisant à une LAM à part entière. L’injection intrapéritonéale de cellules de donneur a établi la LAM chez les receveurs lors de la transplantation en série, et l’infiltration de cellules de LAM a été détectée dans le sang, la moelle osseuse, la rate et le foie des receveurs par cytométrie en flux, qPCR et analyses histologiques. Ainsi, l’injection intrapéritonéale est une méthode efficace d’induction de la LAM utilisant la transplantation en série de cellules leucémiques de donneur.

Comparaison de l’efficacité de transplantation de cellules de LAM murines par les voies de transplantation r.o. et i.p. Auparavant, l’établissement de 1° AML a été rapporté chez des souris receveuses transplantées rétro-orbitalement avec des cellules LSK transduites MLL-AF9, et la transplantabilité de cellules AML 1° a été démontrée par transplantation en série30. La présente étude est la première à évaluer la possibilité d’utiliser des cellules Lin<s...

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Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Ici, l’injection intrapéritonéale de cellules leucémiques est utilisée pour établir et propager la leucémie myéloïde aiguë (LAM) chez la souris. Cette nouvelle méthode est efficace dans la transplantation en série de cellules AML et peut servir d’alternative pour ceux qui peuvent éprouver des difficultés et des incohérences avec l’injection intraveineuse chez la souris.

Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Ce protocole est significatif parce que les cellules lin-négatives et les cellules SK isolées des mêmes souris donneuses n’avaient aucune différence apparente dans la génération de LAM induite par MLL-AF9. En outre, l’injection IP de cellules leucémiques peut développer avec succès un modèle murin de LAM. Par rapport aux méthodes de transplantation conventionnelles, cette technique est plus pratique et moins coûteuse.Pour commencer, stérilisez la souris C57BL/6J femelle CD45.1 âgée de 8 à 10 semaines avec de l’éthanol à 70 %. Placez la souris sur un tampon chirurgical stérile sur un panneau de polystyrène et épinglez les jambes à travers les coussinets de la souris. Coupez la peau au-dessus de la cavité abdominale à la ligne médiane et élargissez l’espace sous-cutané vers les pattes postérieures avec des ciseaux stériles à extrémité pointue.Étendez l’incision de la ligne médiane abdominale jusqu’aux chevilles et élargissez l’espace sous-cutané sous les pattes postérieures avec les lames de ciseaux à extrémité tranchante. Couper le tendon d’Achille avec des ciseaux à extrémité pointue. Tenez le tendon à l’aide d’une pince avec des dents et coupez l’autre extrémité attachée au fémur pour enlever le muscle gastrocnémien.Coupez le tendon du quadriceps attaché au genou avec des ciseaux à extrémité pointue. Tenez le tendon et coupez la tête musculaire attachée au fémur pour enlever le muscle gastrocnémien. Coupez les autres muscles entourant le fémur à l’extrémité attachée au tibia.Ensuite, coupez la cheville avec des ciseaux tranchants, en veillant à ce que le tibia reste intact. Tenez l’extrémité distale du fémur et coupez l’articulation de la hanche avec des ciseaux à extrémité tranchante, en veillant à ce que la tête fémorale reste intacte. Transférer les tibias et les fémurs dans un tampon d’écoulement dans un tube de 15 millilitres.Séparez le tibia et le fémur en brisant le genou à la main. Retirez la rotule, le cartilage et les condyles fémoraux pour exposer le plateau tibial et le fémur distal. Retirez les muscles à l’aide d’une gaze stérile et faites tremper les os dans un tampon d’écoulement.Couper le col du fémur et rincer les cellules de la moelle osseuse avec un tampon d’écoulement des deux extrémités du fémur à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 23. Ensuite, coupez la malléole tibiale et rincez les cellules de la moelle osseuse avec un tampon d’écoulement des deux extrémités du tibia. Disperser les cellules en pipetant de haut en bas à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18.Centrifuger la suspension unicellulaire à quatre degrés Celsius et 400 G pendant trois minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de globules rouges, ou RBC, tampon de lyse pour lyser les globules rouges pendant trois minutes. Ajouter cinq millilitres de tampon de débit pour arrêter la lyse.Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de débit. Placez une passoire cellulaire de 70 microns sur un tube de 50 millilitres et passez la suspension à travers la crépine pour recueillir les cellules. Ajustez la concentration de la cellule avec tampon de débit à une fois 10 à huit par millilitre dans les tubes en polypropylène à fond rond.Sélectionnez les cellules de lignée négative à l’aide d’un kit d’isolation de cellules hématopoïétiques de souris conformément aux instructions du fabricant. Une fois cela fait, centrifuger les cellules souches hématopoïétiques triées et les cellules négatives de lignée non triées et les remettre en suspension dans trois millilitres de cytokines 2X, de milieux IMDM et de trois millilitres de surnageant viral dans une boîte enrobée de rétro-réducteur. Incuber le plat dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 6 ou 24 heures.Après la transduction, récolter les cellules par centrifugation. Si nécessaire, utilisez de la trypsine pour recueillir les cellules attachées au fond du plat. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans du PBS préchauffé.Injecter des cellules dans la souris receveuse principale rétro-orbitalement ou intrapéritonéale avec une demi-aiguille de calibre 27. Surveillez la souris quotidiennement. Après un mois, prélever du sang chaque semaine par saignement rétro-orbitaire pour surveiller la leucocytose en évaluant la numération globulaire complète sur un HEMAVET.Proptose l’œil avec le pouce et l’index, puis pénètre dans le plexus du sinus veineux avec un tube capillaire hématocrite stérile à travers le canthus interne. Recueillir 20 à 25 microlitres de sang dans un tube de prélèvement sanguin EDTA et fermer les paupières pour arrêter le saignement. Appliquez une goutte de solution ophtalmique de sulfate de gentamycine sur l’œil.Lorsque les globules blancs atteignent quatre fois 10 à quatre cellules par microlitre, isoler les cellules de la moelle osseuse en rinçant les fémurs et les tibias avec un tampon d’écoulement, suivi d’une lyse des globules rouges comme décrit précédemment. Ensuite, pour récolter les splénocytes, placez la souris sur un tampon chirurgical stérile sur un panneau de polystyrène et épinglez les pattes à travers les coussinets de la souris. Stérilisez la souris avec de l’éthanol à 70%.Coupez la peau et les muscles à la ligne médiane pour exposer la cavité abdominale avec des ciseaux stériles à extrémité pointue. Isolez la rate et placez-la dans un tampon d’écoulement dans un tube de 15 millilitres. Mailler la rate à travers une passoire de 70 microns dans une boîte de six centimètres avec trois millilitres de tampon de débit.Transférer les cellules de la capsule dans un tube de 15 millilitres, puis centrifuger la suspension unicellulaire, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant trois minutes. Ajouter cinq millilitres de tampon d’écoulement pour arrêter la lyse et centrifuger la suspension cellulaire. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de débit, mélangez et passez à travers une crépine cellulaire de 70 microns pour recueillir les cellules dans un tube de 50 millilitres.Identifier les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primitive, ou LAM, en colorant les splénocytes et les cellules de la moelle osseuse avec l’anticorps CD45.1 anti-souris conjugué FITC et en les détectant sur un cytomètre en flux. Les cellules sont d’abord fermées sur FSC-A FSC-H et FSC-A SSC-A pour acquérir des singlets. La population CD45.1 positive est fermée sur le graphique FL1 en la comparant à des cellules non colorées.Pour la transplantation secondaire, remettre en suspension les cellules spléniques de la LAM CD45.1 provenant de receveurs rétroorbitaires primaires dans le PBS et les injecter rétro-orbitalement à la souris mâle CD45.2. La présence d’une leucocytose aberrante et l’infiltration accrue de cellules leucémiques dans la moelle osseuse et la rate appuient la faisabilité de l’utilisation de cellules négatives de la lignée de la moelle osseuse pour générer une LAM primaire. Aucune différence significative n’a été observée chez les receveurs primaires traduits avec LSK ou cellules de lignée négative.Les cellules de LAM se propagent dans la cavité abdominale des receveurs primaires par leucémie de lignée mixte ou cellules MLL-AF9 transduites de lignée négative. Ces résultats ont également confirmé l’établissement de la LAM primaire par injection intrapéritonéale de cellules MLL-AF9 de la lignée de moelle osseuse négatives sous forme de leucocytose et la présence de cellules de LAM dans la moelle osseuse et la rate des souris receveuses. Cependant, la greffe primaire par injection intrapéritonéale a pris plus de temps à développer une LAM que par injection rétro-orbitale malgré le nombre égal de cellules de donneur.Les receveurs secondaires ont présenté une leucocytose et une hépatosplénomégalie significative moins d’un mois après la transplantation. Les cellules AML ont également été détectées dans le sang périphérique, la moelle osseuse et la rate, ainsi que dans la cavité péritonéale. L’injection intrapéritonéale de huit fois 10 aux cinq cellules de LAM a permis d’obtenir une greffe comparable à l’injection rétro-orbitale de huit fois 10 aux cinq cellules de LAM.Les souris receveuses tertiaires présentaient des signes aigus de LMA, notamment une leucocytose et une hépatosplénomégalie, la présence de cellules leucémiques dans le sang, la moelle osseuse et la rate, l’observation histologique du fémur et de la rate a également démontré l’infiltration de cellules leucémiques. Par rapport aux transplantations secondaires et tertiaires, la transplantation tertiaire a progressé beaucoup plus rapidement que la transplantation secondaire. Pour le modèle actuel, le tri des cellules LSK n’est pas nécessaire.Les cellules Lin-négatives peuvent être transduites avec le virus AML pendant 6 heures ou 24 heures. Cela n’affectera pas l’efficacité de l’établissement modèle.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Analyse des séquences de gène immunoglobuline dans la leucémie lymphoïde chronique : Patient matériel d’interprétation de la séquence

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Sous-culture et cryoconservation des organoïdes de l’adénocarcinome œsophagien: avantages et inconvénients de la digestion unicellulaire

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...