Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

המחברים מודים למתקן הליבה של ציטומטריית זרימה של מכון האק ולמתקן הליבה להיסטופתולוגיה של המעבדה לאבחון בעלי חיים, המחלקה למדעי הווטרינריה והביו-רפואה, אוניברסיטת פנסילבניה, על מתן תמיכה טכנית בזמן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון האמריקאי לחקר הסרטן (KSP), מכללת פן סטייט למדעי החקלאות, מכון הסרטן פן סטייט, פרויקט USDA-NIFA 4771, הצטרפות מספר 00000005 ל- K.S.P. ו- R.F.P.

כל הניסויים אושרו מראש על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פנסילבניה.
1. הכנת מאגרים וריאגנטים
<ol><li>הכינו צלחות אגר LB בתוספת אמפיצילין (AP) (צלחות סטריליות בקוטר 10 ס"מ). כדי לעשות זאת, להמיס 10 גרם של מרק LB עם אגר ב 400 מ"ל של מים מזוקקים, לערבב, ולהב?...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

מחקרים אלה המתוארים לעיל מספקים ראיות תומכות לכך שהשתלת תאי לין דומה לתאי LSK בדור של AML מורין 1°. בנוסף, הנתונים הנוכחיים מראים גם כי הזרקת I.P. היא שיטה יעילה ונוחה לביסוס AML מורין בהשוואה להזרקה תוך ורידית (או r.o.).
בנוסף לתאי LSK, אוכלוסיות אחרות כגון אב גרנולוציטים-מונוציט...

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא סוג של ממאירות המטולוגית של אטיולוגיה מגוונת עם פרוגנוזה גרועה1. דור המודלים של AML בבעלי חיים מניח את היסודות להבנת הווריאציות המורכבות והפתולוגיה שלו במאמץ לגלות טיפולים חדשניים2. לוקמוגנזה בעכברים כוללת השתלה של תאי תורם המבטאים אונקופרוטאינים היתוך, כולל איחוי המערב את הגן לוקמיה שושלת מעורבת (MLL) כדי לגרום ל- AML בעוצמה, כדי לחקות את המחלה בבני אדם3. מקורות תאיים שונים של תאי תורם דווחו בהשתלת AML4 הקשור לגן MLL, כאשר מעט מאוד ידוע על התאים האחראים למקור המחלה.
פותחו מסלולים רבים להשתלה בעכברים; במקום זריקה תוך-פמורלית, המחדירה ישירות תאי תורם מוטנטיים למח עצם5, נעשה שימוש נרחב בזריקה תוך-ורידית המשתמשת במקלעת הסינוסים הוורידית, וריד הזנב ווריד הצוואר ליצירת מודלים 6,7,8,9 של AML. במקרה של הזרקת רטרו-אורביטל (r.o.), חסרונות מובנים שונים, כגון הגבלת נפח, ביקוש טכני גבוה, סיכויים מעטים לניסיונות חוזרים או טעויות, ופגיעות עיניים פוטנציאליות, היו אבני נגף עיקריות עם חלופות מוגבלות או ללא קיימות7. הזרקת ורידים זנב יכולה להיות בעיות דומות מלבד פציעות מקומיות; כדי להקל על ההליך, עכברים לעתים קרובות צריך להיות מחומם כדי להרחיב את ורידי הזנב שלהם10. כמו כן, קשה לאתר את וריד הזנב ללא מקור אור נוסף, במיוחד בזן C57BL/6 של עכברים. עבור הזרקת ורידים Jugular, אנשי המחקר דורשים הכשרה מספקת כדי לאתר את הווריד ולהגביל סיבוכים אפשריים. בנוסף, הן סינוס ורידי זריקות ורידים jugular צריך להתבצע תחת הרדמה, אשר מוסיף רמה נוספת של מורכבות. לכן, מפתה לחקור מסלולים חדשים להשתלה כדי להקל על הקמת מודלים של AML murine.
הזרקה תוך צפקית (i.p.) משמשת בדרך כלל למתן תרופות, צבעים והרדמה 11,12,13,14,15; הוא שימש גם להחדרת תאים המטופויטיים להמטופויזיס חוץ רחמי16 ולהשתלת תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח עצם במודלים שונים של עכברים 17,18,19,20,21. עם זאת, הוא שימש לעתים רחוקות כדי לבסס ממאירויות hematopoietic בעכברים, במיוחד כדי לחקור את התקדמות מחלת AML.
המחקר הנוכחי מתאר את ההיתכנות של הזרקת i.p. בדור של מודלים של עכברי AML, בנוסף להשוואת יעילות ההשתלה של אוכלוסיות שליליות בשושלת (Lin-) ו- Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) כתאי תורם. ממצאים אלה מספקים דרך פשוטה ויעילה ליצור מודלים ניסיוניים של AML ולוקמיה מיאלואידית קשורה. לשיטה כזו יש פוטנציאל לקדם את הבנתנו את מנגנוני המחלה, כמו גם לספק מודל קל יחסית לבדיקת טיפולים ניסיוניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

קיים צורך בלתי מסופק בטיפולים חדשניים לטיפול בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) והישנות הנלווית הכוללת תאי גזע לוקמיה מתמשכת (LSCs). מודל ניסיוני של מכרסמים AML לבדיקת טיפולים המבוססים על השתלה מוצלחת של תאים אלה באמצעות זריקות רטרו-מסלוליות בעכברים מושתלים טומן בחובו אתגרים. מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה קלה, אמינה ועקבית ליצירת מודל מורין חזק של AML באמצעות מסלול תוך פריטוניאלי. בפרוטוקול הנוכחי, תאי מח עצם הומרו עם רטרו-וירוס המבטא אונקופרוטאין היתוך MLL-AF9 אנושי. נבדקה יעילותן של אוכלוסיות שליליות בשושלת (Lin-) ו- Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) כ- LSCs תורמים בפיתוח AML ראשוני, והזרקה תוך צפקית אומצה כשיטה חדשה ליצירת AML. השוואה בין זריקות תוך פריטוניאליות ורטרו-אורביטליות נעשתה בהשתלות סדרתיות כדי להשוות ולהשוות בין שתי השיטות. תאי לין ו-LSK שהותמרו עם נגיף MLL-AF9 אנושי הושתלו היטב במח העצם ובטחול של המושתלים, מה שהוביל ל-AML במלוא מובן המילה. הזרקה תוך-צפקית של תאי תורם ביססה AML במושתלים לאחר השתלה סדרתית, וחדירת תאי AML זוהתה בדם, במח העצם, בטחול ובכבד של המושתלים על ידי ציטומטריית זרימה, qPCR וניתוחים היסטולוגיים. לפיכך, הזרקה תוך צפקית היא שיטה יעילה להשראת AML באמצעות השתלה סדרתית של תאים לוקמיים מתורם.

השוואה של יעילות ההשתלה של תאי AML מורין באמצעות r.o. ו- I.P. נתיבי השתלה בעבר, דווח על הקמת AML של 1° בעכברים מושתלים שהושתלו רטרו עם תאי LSK מומרים MLL-AF9, ויכולת ההשתלה של תאי AML 1° הודגמה על ידי השתלה סדרתית30. המחקר הנוכחי הוא הראשון להעריך את האפשרות להשתמש בתאי מח עצם ל...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

כאן, הזרקה תוך פריטוניאלית של תאי לוקמיה מנוצלת כדי לבסס ולהפיץ לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בעכברים. שיטה חדשה זו יעילה בהשתלה סדרתית של תאי AML ויכולה לשמש חלופה למי שעלול לחוות קשיים וחוסר עקביות עם הזרקה תוך ורידית בעכברים.

השתלה תוך צפקית ליצירת לוקמיה מיאלואידית חריפה בעכברים

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שלתאים שליליים לין ותאי SK שבודדו מאותם עכברים תורמים לא היה הבדל נראה לעין ביצירת AML המושרה על ידי MLL-AF9. כמו כן, הזרקת IP של תאים לוקמיים יכולה לפתח בהצלחה מודל עכבר של AML. בהשוואה לשיטות השתלה קונבנציונליות, טכניקה זו נוחה יותר וזולה יותר.כדי להתחיל, לעקר את העכבר CD45.1 נקבה C57BL/6J בן 8 עד 10 שבועות עם 70% אתנול. הניחו את העכבר על כרית ניתוחים סטרילית על לוח קלקר ונעצו את הרגליים דרך כריות כפות העכבר. חותכים את העור מעל חלל הבטן בקו האמצע ומרחיבים את החלל התת עורי לכיוון הרגליים האחוריות בעזרת מספריים סטריליים חדים.האריכו את החתך מקו האמצע של הבטן עד לקרסוליים והרחיבו את החלל התת עורי מתחת לרגליים האחוריות בעזרת להבי מספריים חדים. חותכים את גיד אכילס עם מספריים חדים. החזיקו את הגיד באמצעות מלקחיים עם שיניים וחתכו את הקצה השני המחובר לעצם הירך כדי להסיר את שריר הגסטרוקנמיוס.חותכים את גיד הארבע ראשי המחובר לברך בעזרת מספריים חדים. החזיקו את הגיד וחתכו את ראש השריר המחובר לעצם הירך כדי להסיר את שריר הגסטרוקנמיוס. חותכים את השרירים האחרים המקיפים את עצם הירך בקצה המחובר לשוקה.לאחר מכן, לחתוך את הקרסול עם מספריים חדים, להבטיח כי השוקה נשאר שלם. החזיקו את הקצה הדיסטלי של עצם הירך וחתכו את מפרק הירך במספריים חדים, כדי להבטיח שראש עצם הירך יישאר שלם. מעבירים את עצם העצם ואת עצם הירך לחיץ זרימה בצינור של 15 מיליליטר.להפריד את השוקה ואת עצם הירך על ידי שבירת הברך ביד. הסר את הפטלה, הסחוס וקונדיל הירך כדי לחשוף את הרמה הטיביאלית ואת עצם הירך הדיסטלית. הסר את השרירים באמצעות גזה סטרילית והשרה את העצמות בחיץ זרימה.חותכים את צוואר הירך ושוטפים את תאי מח העצם עם חיץ זרימה משני קצוות עצם הירך באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 23 מד. לאחר מכן, לחתוך את malleolus tibial ולשטוף את תאי מח העצם עם חיץ זרימה משני הקצוות של השוקה. לפזר את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18 מד.צנטריפוגו את המתלה החד-תאי בארבע מעלות צלזיוס וב-400 גרם למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של תאי דם אדומים, או RBC, חיץ ליזיס כדי לשכב את RBCs למשך שלוש דקות. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ זרימה כדי לעצור את הליזה.לאחר מכן צנטריפוגו את מתלה התא והשהו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ זרימה. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרון על צינור של 50 מיליליטר ומעבירים את המתלה דרך המסננת כדי לאסוף את התאים. כוונן את ריכוז התא עם חיץ זרימה לאחת פעמים 10 לשמונה למיליליטר בצינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים.בחר תאים שליליים לשושלת באמצעות ערכת בידוד תאים המטופויטיים של עכבר בהתאם להוראות היצרן. לאחר שסיימתם, צנטריפוגו את תאי הגזע ההמטופויטיים הממוינים ואת התאים השליליים של השושלת הלא ממוינת והשהו מחדש בשלושה מיליליטר של פי 2 ציטוקינים, מדיה IMDM, ושלושה מיליליטר של סופרנאטנט ויראלי בצלחת מצופה רטרו-רדוקציה. לדגור על המנה באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 או 24 שעות.לאחר הטרנסדוקציה, קצרו את התאים בצנטריפוגה. במידת הצורך, השתמש טריפסין כדי לאסוף את התאים המחוברים לתחתית הצלחת. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-PBS שחומם מראש.הזריקו תאים לעכבר המושתל הראשי רטרו-אורביטלית או תוך צפקית עם חצי מחט של 27 מד. נטר את העכבר מדי יום. לאחר חודש, לאסוף דם מדי שבוע על ידי דימום רטרו-אורביטלי כדי לפקח על לויקוציטוזה על ידי הערכת ספירת הדם המלאה על HEMAVET.Proptose את העין עם האגודל ואת האצבע המורה, ולאחר מכן לחדור את מקלעת הסינוס ורידי עם צינור נימי hematocrit סטרילי דרך canthus הפנימי. לאסוף 20 עד 25 מיקרוליטר של דם לתוך צינור איסוף דם EDTA ולסגור את העפעפיים כדי לעצור את הדימום. החל טיפה אחת של תמיסה אופתלמית ג gentamycin סולפט על העין.כאשר תאי הדם הלבנים מגיעים ארבע פעמים 10 לארבעת התאים למיקרוליטר, בודדו את תאי מח העצם על ידי שטיפת עצם הירך והטיביאס עם חיץ זרימה, ואחריו ליזה RBC כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, כדי לקצור את הטחול, הניחו את העכבר על כרית כירורגית סטרילית על לוח קלקר ונעצו את הרגליים דרך כריות כפות העכבר. לעקר את העכבר עם 70% אתנול.חותכים את העור והשריר בקו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן עם מספריים סטריליים חדים. בודדו את הטחול והכניסו אותו למאגר זרימה בצינור של 15 מיליליטר. ערבבו את הטחול דרך מסננת של 70 מיקרון בצלחת של שישה סנטימטרים עם שלושה מיליליטר של חיץ זרימה.מעבירים את התאים מהצלחת לצינור של 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגו את המתלה החד-תאי, משליכים את הסופרנטנט ומשעיפים מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ ליזיס RBC למשך שלוש דקות. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ זרימה כדי לעצור את הליזיס וצנטריפוגה את מתלה התא. השהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ זרימה, ערבב ועבור דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי לאסוף תאים לתוך צינור 50 מיליליטר.זיהוי תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה ראשונית, או AML, על ידי צביעת הטחול ותאי מח העצם עם נוגדן CD45.1 מצומד נגד עכבר FITC וזיהוי על ציטומטר זרימה. התאים מגודרים תחילה על FSC-A, FSC-H ו- FSC-A, SSC-A, כדי לרכוש סינגלטים. האוכלוסייה החיובית CD45.1 מגודרת על חלקת FL1 על ידי השוואתה לתאים לא מוכתמים.להשתלה שניונית, השהה מחדש תאים ספלניים CD45.1 AML ממושתלים רטרו-אורביטליים ראשוניים ב- PBS והזריק אותם רטרו-אורביטלית לעכבר זכר CD45.2. נוכחות של לויקוציטוזה חריגה וחדירה מוגברת של תאים לוקמיים במח העצם ובטחול תומכת בהיתכנות של שימוש בתאים שליליים לשושלת מח העצם ליצירת AML ראשוני. לא נצפו הבדלים משמעותיים בנמענים ראשוניים שתורגמו עם LSK או תאים שליליים לשושלת.תאי AML התפשטו בחלל הבטן של מושתלים ראשוניים על ידי לוקמיה מעורבת של שושלת או תאים שליליים לשושלת MLL-AF9. תוצאות אלה גם אישרו את הקמתו של AML ראשוני באמצעות הזרקה תוך צפקית של תאים שליליים לשושלת מח עצם MLL-AF9 בצורה של לויקוציטוזה ונוכחות של תאי AML במח העצם ובטחול של עכברים מושתלים. עם זאת, השתלה ראשונית באמצעות הזרקה תוך צפקית לקחה זמן רב יותר לפתח AML מאשר באמצעות הזרקה רטרו-אורביטלית למרות מספר זהה של תאי תורם.המושתלים המשניים הראו לויקוציטוזה והפטוספלנומגליה משמעותית תוך פחות מחודש לאחר ההשתלה. תאי AML התגלו גם בדם ההיקפי, במח העצם ובטחול, כמו גם בחלל הצפק. הזרקה תוך-צפקית של שמונה פעמים 10 לחמשת תאי AML השיגה קליטה דומה להזרקה רטרו-אורביטלית של שמונה פעמים 10 לחמש AML.העכברים המושתלים השלישוניים הציגו סימני AML חריפים כולל לויקוציטוזה והפטוספלנומגליה, נוכחות תאים לוקמיים בדם, מח העצם והטחול, תצפית היסטולוגית של עצם הירך והטחול הדגימה עוד יותר את חדירת התאים הלוקמיים. בהשוואה להשתלות השניוניות והשלישוניות, ההשתלה השלישונית התקדמה הרבה יותר מהר מההשתלה השניונית. עבור המודל הנוכחי, מיון תאי LSK הוא מיותר.תאים שליליים לין יכול להיות מומר עם וירוס AML במשך 6 שעות או 24 שעות. זה לא ישפיע על היעילות של הקמת המודל.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

ניתוח רצף גנטי בנוגדנים בלוקמיה לימפוציטית כרונית: מחומר החולה לפרשנות רצף

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

תת-תרבות ושימור בהקפאה של אורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט: יתרונות וחסרונות לעיכול תאים בודדים

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...