Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Gli autori ringraziano la Flow Cytometry Core Facility dell'Huck Institute e la Histopathology Core Facility dell'Animal Diagnostic Laboratory, Dipartimento di Scienze Veterinarie e Biomediche, The Pennsylvania State University, per aver fornito un supporto tecnico tempestivo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, numero di adesione 00000005 a K.S.P. e R.F.P.

Tutti gli esperimenti sono stati preapprovati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Pennsylvania State University.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
<ol><li>Preparare piastre di agar LB con ampicillina integrata (AP) (piastre sterili da 10 cm). Per fare questo, sciogliere 10 g di brodo LB con agar in 400 ml di acqua distillata, mescolare e portare il volume fino a 500 ml. Sterilizzare la soluzione in autoclave, quindi lasciare raffreddare la soluzion...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Questi studi sopra descritti forniscono prove a sostegno del fatto che il trapianto di cellule Lin- è paragonabile alle cellule LSK nella generazione di LMA murina 1°. Inoltre, i dati attuali mostrano anche che l'iniezione i.p. è un metodo efficiente e conveniente per stabilire la LMA murina rispetto all'iniezione endovenosa (o r.o.).
Oltre alle cellule LSK, altre popolazioni come il progenitore granulocitario-monocitario (GMP), il progenitore linfoide comune (CLP) e il progenito...

La leucemia mieloide acuta (LMA) è un tipo di tumore ematologico di diversa eziologia con prognosi infausta1. La generazione di modelli animali AML pone le basi per la comprensione delle sue complesse variazioni e patobiologia nel tentativo di scoprire nuove terapie2. La leucemogenesi nei topi comporta il trapianto di cellule donatrici che esprimono oncoproteine di fusione, comprese le fusioni che coinvolgono il gene della leucemia a linea mista (MLL) per indurre potentemente la LMA, per imitare la malattia nell'uomo3. Varie origini cellulari di cellule donatrici sono state riportate nel trapianto di AML4 associata al gene MLL, con pochissime conoscenze sulle cellule responsabili dell'origine della malattia.
Sono state sviluppate molteplici vie per il trapianto nei topi; piuttosto che un'iniezione intra-femorale, che introduce direttamente cellule donatrici mutanti nel midollo osseo5, un'iniezione endovenosa che utilizza il plesso del seno venoso, la vena caudale e la vena giugulare è stata ampiamente utilizzata per generare modelli murini di LMA 6,7,8,9. Nel caso dell'iniezione retroorbitale (r.o.), vari svantaggi intrinseci, come la limitazione del volume, l'elevata richiesta tecnica, le poche possibilità di ripetuti tentativi o errori e potenziali lesioni oculari, sono stati importanti ostacoli con alternative limitate o non praticabili7. L'iniezione della vena caudale può avere problemi simili oltre alle lesioni locali; Per facilitare la procedura, i topi spesso devono essere riscaldati per dilatare le vene della coda10. È anche difficile individuare la vena caudale senza una fonte di luce aggiuntiva, in particolare nel ceppo C57BL / 6 dei topi. Per l'iniezione della vena giugulare, il personale di ricerca richiede una formazione sufficiente per localizzare la vena e limitare le possibili complicanze. Inoltre, sia le iniezioni di seno venoso che di vena giugulare devono essere eseguite in anestesia, il che aggiunge un altro livello di complessità. Pertanto, si è tentati di esplorare nuove vie per il trapianto per facilitare la creazione di modelli murini AML.
L'iniezione intraperitoneale (i.p.) è comunemente usata per somministrare farmaci, coloranti e anestetici 11,12,13,14,15; È stato anche usato per introdurre cellule ematopoietiche per l'ematopoiesi ectopica16 e per trapiantare cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo in vari modelli murini 17,18,19,20,21. Tuttavia, è stato usato raramente per stabilire neoplasie ematopoietiche nei topi, in particolare per studiare la progressione della malattia AML.
Il presente studio descrive la fattibilità dell'iniezione di i.p. nella generazione di modelli murini AML, oltre a confrontare l'efficienza del trapianto di popolazioni di lignaggio negativo (Lin-) e Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) come cellule donatrici. Questi risultati forniscono un modo semplice ed efficiente per generare modelli sperimentali di LMA e leucemie mieloidi correlate. Tale metodo ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi della malattia e fornire un modello relativamente facile per testare terapie sperimentali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

C'è un bisogno insoddisfatto di nuove terapie per trattare la leucemia mieloide acuta (LMA) e la ricaduta associata che coinvolge le cellule staminali persistenti della leucemia (LSC). Un modello sperimentale di roditore AML per testare terapie basate sul trapianto di successo di queste cellule tramite iniezioni retro-orbitali nei topi riceventi è irto di sfide. Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo semplice, affidabile e coerente per generare un robusto modello murino di LMA utilizzando una via intra-peritoneale. Nel presente protocollo, le cellule del midollo osseo sono state trasdotte con un retrovirus che esprime oncoproteina di fusione umana MLL-AF9. È stata testata l'efficienza delle popolazioni di lignaggio negativo (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) come LSC donatrici nello sviluppo della LMA primaria ed è stata adottata l'iniezione intraperitoneale come nuovo metodo per generare LMA. Il confronto tra iniezioni intra-peritoneali e retro-orbitali è stato fatto in trapianti seriali per confrontare e contrastare i due metodi. Entrambe le cellule Lin e LSK trasdotte con il virus umano MLL-AF9 si sono innestate bene nel midollo osseo e nella milza dei riceventi, portando a una LMA conclamata. L'iniezione intra-peritoneale di cellule donatrici ha stabilito la LMA nei riceventi dopo il trapianto seriale e l'infiltrazione delle cellule AML è stata rilevata nel sangue, nel midollo osseo, nella milza e nel fegato dei riceventi mediante citometria a flusso, qPCR e analisi istologiche. Pertanto, l'iniezione intraperitoneale è un metodo efficiente di induzione della LMA utilizzando il trapianto seriale di cellule leucemiche del donatore.

Confronto dell'efficienza del trapianto di cellule LMA murine utilizzando vie di trapianto r.o. e i.p. In precedenza, l'istituzione di 1° AML è stata riportata in topi riceventi trapiantati retroorbitalmente con cellule LSK trasdotte MLL-AF9 e la trapiantabilità di 1° cellule AML è stata dimostrata mediante trapianto seriale30. Il presente studio è il primo a valutare la possibilità di utilizzare le cellule Lin- del midollo osseo per eseguire il trapianto. La ...

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Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Qui, l'iniezione intra-peritoneale delle cellule leucemiche viene utilizzata per stabilire e propagare la leucemia mieloide acuta (LMA) nei topi. Questo nuovo metodo è efficace nel trapianto seriale di cellule LMA e può servire come alternativa per coloro che possono sperimentare difficoltà e incongruenze con l'iniezione endovenosa nei topi.

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Questo protocollo è significativo perché le cellule lin-negative e le cellule SK isolate dagli stessi topi donatori non avevano alcuna differenza apparente nella generazione di LMA indotta da MLL-AF9. Inoltre, l'iniezione IP di cellule leucemiche può sviluppare con successo un modello murino di LMA. Rispetto ai metodi di trapianto convenzionali, questa tecnica è più conveniente e meno costosa.Per iniziare, sterilizzare il topo femmina CD45.1 C57BL/6J di 8-10 settimane con etanolo al 70%. Posizionare il mouse su un tampone chirurgico sterile su una tavola di polistirolo e fissare le gambe attraverso le zampe del mouse. Tagliare la pelle sopra la cavità addominale sulla linea mediana e allargare lo spazio sottocutaneo verso le zampe posteriori con forbici sterili affilate.Estendere l'incisione dalla linea mediana addominale fino alle caviglie e allargare lo spazio sottocutaneo sotto le zampe posteriori con le lame delle forbici affilate. Tagliare il tendine d'Achille con forbici affilate. Tenere il tendine usando una pinza con i denti e tagliare l'altra estremità attaccata al femore per rimuovere il muscolo gastrocnemio.Tagliare il tendine del quadricipite attaccato al ginocchio con forbici affilate. Tenere il tendine e tagliare la testa muscolare attaccata al femore per rimuovere il muscolo gastrocnemio. Tagliare gli altri muscoli che circondano il femore all'estremità attaccata alla tibia.Quindi, tagliare la caviglia con forbici affilate, assicurandosi che la tibia rimanga intatta. Tenere l'estremità distale del femore e tagliare l'articolazione dell'anca con forbici affilate, assicurandosi che la testa del femore rimanga intatta. Trasferire le tibie e i femori in un tampone di flusso in un tubo da 15 millilitri.Separare la tibia e il femore rompendo il ginocchio a mano. Rimuovere la rotula, la cartilagine e i condili femorali per esporre il plateau tibiale e il femore distale. Rimuovere i muscoli con una garza sterile e immergere le ossa in un tampone di flusso.Tagliare il collo del femore e lavare le cellule del midollo osseo con tampone di flusso da entrambe le estremità del femore utilizzando una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 23. Quindi, tagliare il malleolo tibiale e lavare le cellule del midollo osseo con tampone di flusso da entrambe le estremità della tibia. Disperdere le cellule pipettando su e giù usando una siringa da 10 millilitri con un ago da 18 gauge.Centrifugare la sospensione monocellulare a quattro gradi Celsius e 400 G per tre minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di globuli rossi, o RBC, tampone di lisi per lisare i globuli rossi per tre minuti. Aggiungere cinque millilitri di tampone di flusso per fermare la lisi.Quindi centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di flusso. Posizionare un filtro cellulare da 70 micron su un tubo da 50 millilitri e passare la sospensione attraverso il filtro per raccogliere le celle. Regolare la concentrazione della cella con tampone di flusso a una volta 10 all'otto per millilitro in tubi di polipropilene a fondo tondo.Selezionare le cellule negative del lignaggio utilizzando un kit di isolamento delle cellule ematopoietiche del topo secondo le istruzioni del produttore. Una volta fatto, centrifugare le cellule staminali ematopoietiche selezionate e le cellule negative del lignaggio non selezionate e risospendere in tre millilitri di 2X di citochine, mezzi IMDM e tre millilitri di surnatante virale in un piatto rivestito retro-riducente. Incubare il piatto in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 6 o 24 ore.Dopo la trasduzione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Se necessario, utilizzare la tripsina per raccogliere le cellule attaccate al fondo del piatto. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS preriscaldato.Iniettare cellule nel topo ricevente primario retroorbitalmente o intraperitonealmente con un mezzo ago calibro 27. Monitorare il mouse ogni giorno. Dopo un mese, raccogliere il sangue settimanalmente mediante sanguinamento retroorbitale per monitorare la leucocitosi valutando l'emocromo completo su un HEMAVET.Proptose l'occhio con il pollice e l'indice, quindi penetrare nel plesso del seno venoso con un tubo capillare ematocrito sterile attraverso il canto interno. Raccogliere da 20 a 25 microlitri di sangue in un tubo di raccolta del sangue EDTA e chiudere le palpebre per fermare l'emorragia. Applicare una goccia di soluzione oftalmica di gentamicina solfato sull'occhio.Quando i globuli bianchi raggiungono quattro volte 10 alle quattro cellule per microlitro, isolare le cellule del midollo osseo lavando i femori e le tibie con tampone di flusso, seguito da lisi dei globuli rossi come descritto in precedenza. Successivamente, per raccogliere gli splenociti, posizionare il mouse su un tampone chirurgico sterile su una tavola di polistirolo e fissare le gambe attraverso le zampe del topo. Sterilizzare il mouse con etanolo al 70%.Tagliare la pelle e il muscolo sulla linea mediana per esporre la cavità addominale con forbici sterili affilate. Isolare la milza e metterla in un buffer di flusso in un tubo da 15 millilitri. Mescolare la milza attraverso un filtro da 70 micron in un piatto di sei centimetri con tre millilitri di buffer di flusso.Trasferire le cellule dal piatto a un tubo da 15 millilitri, quindi centrifugare la sospensione monocellulare, scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di lisi RBC per tre minuti. Aggiungere cinque millilitri di tampone di flusso per fermare la lisi e centrifugare la sospensione cellulare. Risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di flusso, mescolare e passare attraverso un filtro a celle da 70 micron per raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri.Identificare le cellule della leucemia mieloide acuta primaria, o LMA, colorando gli splenociti e le cellule del midollo osseo con l'anticorpo CD45.1 coniugato FITC e rilevando su un citometro a flusso. Le cellule vengono prima controllate su FSC-A FSC-H e FSC-A SSC-A per acquisire singoletti. La popolazione CD45.1 positiva è controllata sul grafico FL1 confrontandolo con le cellule non colorate.Per il trapianto secondario, risospendere le cellule spleniche LMA CD45.1 da riceventi retroorbitali primari in PBS e iniettarle retroorbitalmente nel topo maschio CD45.2. La presenza di leucocitosi aberrante e una maggiore infiltrazione di cellule leucemiche nel midollo osseo e nella milza supporta la fattibilità dell'utilizzo di cellule negative del midollo osseo per generare LMA primaria. Non sono state osservate differenze significative nei riceventi primari tradotti con LSK o cellule negative per il lignaggio.Le cellule AML si diffondono nella cavità addominale dei riceventi primari dalla leucemia a linea mista o dalle cellule negative trasdotte della linea MLL-AF9. Questi risultati hanno anche confermato l'istituzione di LMA primaria tramite iniezione intraperitoneale di cellule negative della linea del midollo osseo trasdotte MLL-AF9 sotto forma di leucocitosi e la presenza di cellule LMA nel midollo osseo e nella milza dei topi riceventi. Tuttavia, il trapianto primario tramite iniezione intraperitoneale ha richiesto più tempo per sviluppare AML rispetto all'iniezione retro-orbitale nonostante lo stesso numero di cellule donatrici.I riceventi secondari hanno mostrato leucocitosi ed epatosplenomegalia significativa in meno di un mese dopo il trapianto. Le cellule AML sono state rilevate anche nel sangue periferico, nel midollo osseo e nella milza, nonché nella cavità peritoneale. L'iniezione intraperitoneale di otto volte 10 alle cinque cellule AML ha ottenuto un attecchimento paragonabile all'iniezione retro-orbitale di otto volte 10 alle cinque AML.I topi riceventi terziari mostravano acutamente segni di LMA tra cui leucocitosi ed epatosplenomegalia, presenza di cellule leucemiche nel sangue, nel midollo osseo e nella milza, l'osservazione istologica del femore e della milza dimostravano ulteriormente l'infiltrazione delle cellule leucemiche. Rispetto ai trapianti secondari e terziari, il trapianto terziario è progredito molto più velocemente del trapianto secondario. Per il modello corrente, l'ordinamento delle celle LSK non è necessario.Le cellule Lin-negative possono essere trasdotte con il virus AML per 6 ore o 24 ore. Non influirà sull'efficienza dell'istituzione del modello.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Analisi di sequenza di Gene dell'immunoglobulina nella leucemia linfocitaria cronica: Da materiale paziente all'interpretazione di sequenza

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo: pro e contro per la digestione a cellula singola

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...