Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Huck Institute's Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, for å gi rettidig teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA prosjekt 4771, tiltredelsesnummer 00000005 til KSP og RFP

Alle eksperimenter ble forhåndsgodkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Pennsylvania State University.
1. Fremstilling av buffere og reagenser
<ol><li>Forbered ampicillin supplert (AP) LB agarplater (sterile 10 cm plater). For å gjøre dette, oppløs 10 g LB-buljong med agar i 400 ml destillert vann, rør og bring volumet opp til 500 ml. Steriliser oppløsningen ved autoklavering, la deretter oppløsningen avkjøles, tilsett 0,5 ml ampicillin (lager: 150...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Disse ovenfor beskrevne studiene gir støttende bevis på at transplantasjon av Lin-celler er sammenlignbar med LSK-celler i genereringen av 1° murine AML. I tillegg viser de nåværende dataene også at i.p. injeksjon er en effektiv og praktisk metode for å etablere murine AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injeksjon.
I tillegg til LSK-celler har andre populasjoner som granulocytt-monocytt-stamfar (GMP), vanlig lymfoid stamfar (CLP) og vanlig myeloid stamfar (CMP) blit...

Akutt myelogen leukemi (AML) er en type hematologisk malignitet av ulik etiologi med dårlig prognose1. Genereringen av AML-dyremodeller legger grunnlaget for forståelsen av dens komplekse variasjoner og patobiologi i et forsøk på å oppdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantasjon av donorceller som uttrykker fusjonsonkoproteiner, inkludert fusjoner som involverer genet blandet avstamningsleukemi (MLL) for å indusere AML, for å etterligne sykdommen hos mennesker3. Ulike cellulære opprinnelser av donorceller har blitt rapportert ved transplantasjon av MLL-genassosiert AML4, med svært lite kjent om cellene som er ansvarlige for sykdommens opprinnelse.
Flere ruter er utviklet for transplantasjon hos mus; I stedet for en intrafemoral injeksjon, som direkte introduserer mutante donorceller i benmarg5, har en intravenøs injeksjon som benytter venøs sinus plexus, hale vene og jugularvenen blitt mye brukt til å generere murine AML-modeller 6,7,8,9. Når det gjelder retro-orbital (r.o.) injeksjon, har ulike iboende ulemper, som volumbegrensning, høy teknisk etterspørsel, få sjanser for gjentatte forsøk eller feil, og potensielle okulære skader, vært store snublesteiner med begrensede eller ingen levedyktige alternativer7. Tail vein injeksjon kan ha lignende problemer i tillegg til lokale skader; For å lette prosedyren, må mus ofte varmes opp for å utvide haleårene10. Det er også vanskelig å lokalisere halevenen uten en ekstra lyskilde, spesielt i C57BL/6-stammen til mus. For jugularveneinjeksjon krever forskningspersonell tilstrekkelig trening for å lokalisere venen og begrense mulige komplikasjoner. I tillegg må både venøs sinus og jugularveninjeksjoner utføres under anestesi, noe som legger til et annet nivå av kompleksitet. Det er derfor fristende å utforske nye transplantasjonsveier for å lette etableringen av AML-murinmodeller.
Intraperitoneal (i.p.) injeksjon brukes ofte til å administrere medisiner, fargestoffer og anestetika 11,12,13,14,15; Det har også blitt brukt til å introdusere hematopoietiske celler for ektopisk hematopoiesis16 og å transplantere benmargsavledede mesenkymale stamceller i forskjellige musemodeller 17,18,19,20,21. Det har imidlertid blitt sjelden brukt til å etablere hematopoietiske maligniteter hos mus, spesielt for å studere AML sykdomsprogresjon.
Denne studien beskriver gjennomførbarheten av i.p. injeksjon i genereringen av AML-musemodeller, i tillegg til å sammenligne transplantasjonseffektiviteten av avstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populasjoner som donorceller. Disse funnene gir en enkel og effektiv måte å generere eksperimentelle modeller av AML og relaterte myelogen leukemier. En slik metode har potensial til å fremme vår forståelse av sykdomsmekanismene, samt gi en relativt enkel modell for å teste eksperimentelle terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Det er et udekket behov for nye terapier for å behandle akutt myelogen leukemi (AML) og tilhørende tilbakefall som involverer vedvarende leukemi stamceller (LSCs). En eksperimentell AML-gnagermodell for å teste terapier basert på vellykket transplantasjon av disse cellene via retro-orbitale injeksjoner hos mottakermus er full av utfordringer. Målet med denne studien var å utvikle en enkel, pålitelig og konsistent metode for å generere en robust murine modell av AML ved hjelp av en intraperitoneal rute. I denne protokollen ble benmargsceller transdusert med et retrovirus som uttrykker humant MLL-AF9-fusjonsonkoprotein. Effektiviteten av populasjoner av lineage negative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) som donor-LSC i utviklingen av primær AML ble testet, og intraperitoneal injeksjon ble tatt i bruk som en ny metode for å generere AML. Sammenligning mellom intraperitoneale og retroorbitale injeksjoner ble gjort i serietransplantasjoner for å sammenligne og kontrastere de to metodene. Både Lin- og LSK-celler transducert med humant MLL-AF9-virus innpodet godt i benmarg og milt hos mottakere, noe som førte til en fullblåst AML. Intraperitoneal injeksjon av donorceller etablerte AML hos mottakere ved serietransplantasjon, og infiltrasjon av AML-celler ble påvist i blod, benmarg, milt og lever hos mottakere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Dermed er intraperitoneal injeksjon en effektiv metode for AML-induksjon ved bruk av seriell transplantasjon av donor leukemiske celler.

Sammenligning av transplantasjonseffektiviteten til murine AML-celler ved bruk av r.o. og i.p. transplantasjonsveier Tidligere ble etablering av 1° AML rapportert hos mottakermus retroorbitalt transplantert med MLL-AF9-transduserte LSK-celler, og transplanterbarheten av 1° AML-celler ble demonstrert ved serietransplantasjon30. Denne studien er den første som evaluerer muligheten for å bruke benmarg Lin-celler til å utføre transplantasjon. Funn av avvikende leuk...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Her brukes intraperitoneal injeksjon av leukemiceller for å etablere og forplante akutt myelogen leukemi (AML) hos mus. Denne nye metoden er effektiv i seriell transplantasjon av AML-celler og kan tjene som et alternativ for de som kan oppleve vanskeligheter og inkonsekvenser med intravenøs injeksjon hos mus.

Intraperitoneal transplantasjon for generering av akutt myelogen leukemi hos mus

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Denne protokollen er signifikant fordi lin-negative celler og SK-celler isolert fra de samme donormusene ikke hadde noen åpenbar forskjell i genereringen av MLL-AF9-indusert AML. IP-injeksjon av leukemiske celler kan også med hell utvikle en musemodell av AML. Sammenlignet med konvensjonelle transplantasjonsmetoder er denne teknikken mer praktisk og billigere.For å begynne, steriliser den 8 til 10 uker gamle CD45.1 kvinnelige C57BL/6J-musen med 70% etanol. Plasser musen på en steril kirurgisk pute på et styrofoambrett og fest bena gjennom musepoteputene. Klipp huden over bukhulen på midtlinjen og utvid det subkutane rommet mot bakbenene med skarp ende steril saks.Forleng snittet fra den abdominale midtlinjen ned til anklene og utvid det subkutane rommet under bakbenene med bladene på skarp saks. Klipp akillessenen med skarp saks. Hold senen med tang med tenner og kutt den andre enden festet til lårbenet for å fjerne gastrocnemius-muskelen.Klipp quadriceps-senen festet til kneet med skarp saks. Hold senen og kutt muskelhodet festet til lårbenet for å fjerne gastrocnemius-muskelen. Klipp de andre musklene rundt lårbenet på enden festet til tibia.Deretter kutter du ankelen med skarp saks, slik at tibia forblir intakt. Hold den distale enden av lårbenet og klipp hofteleddet med skarp saks, slik at lårhodet forblir intakt. Overfør tibias og femurs til en strømningsbuffer i et 15 milliliter rør.Separat tibia og lårben ved å bryte kneet for hånd. Fjern patella, brusk og femorale kondyler for å avsløre tibialplatået og distale lårben. Fjern musklene ved hjelp av sterilt gasbind og suge beinene i en strømningsbuffer.Klipp lårhalsen og skyll benmargcellene med strømningsbuffer fra begge ender av lårbenet ved hjelp av en 10 milliliter sprøyte med en 23 gauge nål. Deretter kutter du tibial malleolus og skyll benmargcellene med strømningsbuffer fra begge ender av tibia. Spre cellene ved å pipettere opp og ned ved hjelp av en 10 milliliter sprøyte med en 18 gauge nål.Sentrifuger encellesuspensjonen ved fire grader Celsius og 400 G i tre minutter. Kast supernatanten og resuspender cellene i fem milliliter røde blodlegemer, eller RBC, lysisbuffer for å lyse RBCene i tre minutter. Legg til fem milliliter strømningsbuffer for å stoppe lysis.Deretter sentrifugerer cellesuspensjonen og resuspenderer pelleten i fem milliliter strømningsbuffer. Plasser en 70 mikron celle sil på et 50 milliliter rør og pass suspensjonen gjennom silen for å samle cellene. Juster cellekonsentrasjonen med strømningsbuffer til en ganger 10 til åtte per milliliter i rundbunns polypropylenrør.Velg avstamningsnegative celler ved hjelp av et musehematopoietisk celleisolasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner. Når det er gjort, sentrifugerer du de sorterte hematopoietiske stamceller og usorterte avstamningsnegative celler og resuspenderer i tre milliliter 2X cytokiner, IMDM-medier og tre milliliter viral supernatant i en retro-redukant belagt tallerken. Inkuber parabolen i en fuktet 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i 6 eller 24 timer.Etter transduksjon, høst cellene ved sentrifugering. Bruk om nødvendig trypsin til å samle cellene som er festet til parabolbunnen. Kast supernatanten og resuspender pelleten i forvarmet PBS.Injiser celler i den primære mottakermusen retro-orbitalt eller intraperitonealt med en 27 gauge halv nål. Overvåk musen daglig. Etter en måned, samle blod ukentlig ved retro-orbital blødning for å overvåke leukocytose ved å evaluere fullstendig blodtelling på en HEMAVET.Proptose øyet med tommelen og pekefingeren, og penetrer deretter venøs sinus plexus med et sterilt hematokrit kapillærrør gjennom den indre canthus. Samle 20 til 25 mikroliter blod inn i et EDTA-blodoppsamlingsrør og lukk øyelokkene for å stoppe blødningen. Påfør en dråpe gentamycinsulfat oftalmisk løsning til øyet.Når de hvite blodcellene når fire ganger 10 til de fire cellene per mikroliter, isolerer benmargcellene ved å skylle lårbenene og tibias med strømningsbuffer, etterfulgt av RBC-lyse som beskrevet tidligere. Neste, for å høste splenocytter, legg musen på en steril kirurgisk pute på et styrofoambrett og fest bena gjennom musepoteputene. Steriliser musen med 70% etanol.Klipp huden og muskelen på midtlinjen for å eksponere bukhulen med skarp ende steril saks. Isoler milten og legg den i en strømningsbuffer i et 15 milliliter rør. Mesh milten gjennom en 70 mikron sil i en seks centimeter tallerken med tre milliliter strømningsbuffer.Overfør cellene fra parabolen til et 15 milliliter rør, sentrifuge deretter enkeltcellesuspensjonen, kast supernatanten og resuspender pelleten i fem milliliter RBC-lysisbuffer i tre minutter. Legg til fem milliliter strømningsbuffer for å stoppe lysis og sentrifugere cellesuspensjonen. Resuspender pelleten i fem milliliter strømningsbuffer, bland og pass gjennom en 70 mikron cellesil for å samle celler i et 50 milliliter rør.Identifiser primære akutte myelogen leukemi, eller AML, celler ved å flekke splenocytter og benmargceller med FITC konjugert anti-mus CD45.1 antistoff og detektere på et flowcytometer. Cellene styres først på FSC-A, FSC-H og FSC-A, SSC-A for å skaffe singleter. Den CD45.1-positive populasjonen er inngjerdet på FL1-plottet ved å sammenligne den med ufargede celler.For sekundær transplantasjon, resuspender CD45.1 AML miltceller fra primære retro-orbitale mottakere i PBS og injiser dem retro-orbitalt i CD45.2 mannlig mus. Tilstedeværelsen av avvikende leukocytose og økt infiltrasjon av leukemiske celler i benmarg og milt støtter muligheten for å bruke benmargslinje-negative celler for å generere primær AML. Ingen signifikante forskjeller ble observert hos primære mottakere oversatt med LSK eller avstamningsnegative celler.AML-cellene spres i bukhulen hos primære mottakere ved blandet leukemi eller MLL-AF9-transduserte avstamningsnegative celler. Disse resultatene bekreftet også etableringen av primær AML via intraperitoneal injeksjon av MLL-AF9-transduserte benmargslinje-negative celler i form av leukocytose og tilstedeværelse av AML-celler i benmarg og milt hos mottakermus. Primærtransplantasjon via intraperitoneal injeksjon tok imidlertid lengre tid å utvikle AML enn via retroorbital injeksjon til tross for like mange donorceller.De sekundære mottakerne viste leukocytose og signifikant hepatosplenomegali mindre enn én måned etter transplantasjonen. AML-cellene ble også påvist i perifert blod, benmarg og milt samt i bukhulen. Den intraperitoneale injeksjonen av åtte ganger 10 til de fem AML-cellene oppnådde sammenlignbar engraftment til retro-orbital injeksjon på åtte ganger 10 til de fem AML.De tertiære mottakermusene viste akutt AML-tegn, inkludert leukocytose og hepatosplenomegali, tilstedeværelsen av leukemiske celler i blod, benmarg og milt, histologisk observasjon av lårben og milt viste videre infiltrasjon av leukemiske celler. Sammenliknet med sekundær- og tertiærtransplantasjonene gikk tertiærtransplantasjonen mye raskere enn sekundærtransplantasjonen. For dagens modell er sortering av LSK-celler unødvendig.Lin-negative celler kan transduseres med AML-virus i 6 timer eller 24 timer. Det vil ikke påvirke effektiviteten til modelletableringen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

En detaljert protokoll for å karakterisere Murine C1498 Cell Line og dens Associated leukemi Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Fra pasienten materiale til sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En Chromatin Immunoprecipitation analysen identifisere romanen NFAT2 målet gener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

To flowcytometriske tilnærminger til NKG2D Ligand overflatedeteksjon for å skille stamceller fra bulk subpopulations i akutt myeloid leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantasjon for å vurdere dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler hos mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur og kryopreservering av Esophageal Adenocarcinoma Organoider: Fordeler og ulemper for fordøyelsen med én celle

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...