Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Os autores agradecem ao Flow Cytometry Core Facility do Instituto Huck e ao Histopathology Core Facility do Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, por fornecer suporte técnico oportuno. Este trabalho foi apoiado por subsídios do American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, número de adesão 00000005 ao K.S.P. e R.F.P.

Todos os experimentos foram pré-aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual da Pensilvânia.
1. Preparação de tampões e reagentes
<ol><li>Preparar placas de ágar LB suplementadas com ampicilina (AP) (placas estéreis de 10 cm). Para isso, dissolva 10 g de caldo LB com ágar em 400 mL de água destilada, mexa e leve o volume até 500 mL. Esterilizar a solução por autoclavagem, em seguida, deixar a solução arrefecer, adic...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Esses estudos descritos acima fornecem evidências de suporte de que o transplante de células Lin- é comparável às células LSK na geração de 1° de LMA murina. Além disso, os dados atuais também mostram que a injeção i.p. é um método eficiente e conveniente para estabelecer LMA murina em comparação com a injeção intravenosa (ou r.o.).
Além das células LSK, outras populações, como o progenitor de granulócitos monócitos (GMP), o progenitor linfoide comum (CLP) e...

A leucemia mieloide aguda (LMA) é um tipo de neoplasia hematológica de etiologia diversa e de mau prognóstico1. A geração de modelos animais de LMA estabelece as bases para a compreensão de suas complexas variações e patobiologia em um esforço para descobrir novas terapias2. A leucemogênese em camundongos envolve o transplante de células doadoras expressando oncoproteínas de fusão, incluindo fusões envolvendo o gene da leucemia de linhagem mista (MLL) para induzir potentemente a LMA, para mimetizar a doença em humanos3. Várias origens celulares de células de doadores têm sido relatadas no transplante de LMA4 associada ao gene MLL, sendo pouco conhecido sobre as células responsáveis pela origem da doença.
Múltiplas vias têm sido desenvolvidas para transplante em camundongos; em vez de uma injeção intrafemoral, que introduz diretamente células doadoras mutantes na medulaóssea5, uma injeção intravenosa que utiliza o plexo sinusal venoso, a veia caudal e a veia jugular tem sido amplamente utilizada para gerar modelos murinos de LMA 6,7,8,9. No caso da injeção retro-orbitária (r.o.), várias desvantagens inerentes, como limitação de volume, alta demanda técnica, poucas chances de tentativas repetidas ou erro e possíveis lesões oculares, têm sido grandes obstáculos com alternativas limitadas ou inviáveis7. A injeção da veia caudal pode ter problemas semelhantes, além de lesões locais; Para facilitar o procedimento, os camundongos muitas vezes precisam ser aquecidos para dilatar as veias da cauda10. Também é difícil localizar a veia da cauda sem uma fonte de luz adicional, particularmente na linhagem C57BL/6 de camundongos. Para a injeção da veia jugular, o pessoal da pesquisa requer treinamento suficiente para localizar a veia e limitar possíveis complicações. Além disso, tanto as injeções do seio venoso quanto da veia jugular precisam ser realizadas sob anestesia, o que acrescenta outro nível de complexidade. Assim, é tentador explorar novas rotas de transplante para facilitar o estabelecimento de modelos murinos de LMA.
A injeção intraperitoneal (i.p.) é comumente utilizada para administração de fármacos, corantes e anestésicos 11,12,13,14,15; Também tem sido utilizada na introdução de células hematopoéticas para hematopoese ectópica16 e no transplante de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea em vários modelos murinos 17,18,19,20,21. No entanto, tem sido pouco utilizada para estabelecer neoplasias hematopoéticas em camundongos, particularmente para estudar a progressão da doença da LMA.
O presente estudo descreve a viabilidade da injeção i.p. na geração de modelos de LMA em camundongos, além de comparar a eficiência do transplante de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como células doadoras. Esses achados fornecem uma maneira simples e eficiente de gerar modelos experimentais de LMA e leucemias mieloides relacionadas. Tal método tem o potencial de aprofundar nossa compreensão dos mecanismos da doença, bem como fornecer um modelo relativamente fácil para testar terapias experimentais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Há uma necessidade não atendida de novas terapias para tratar a leucemia mieloide aguda (LMA) e a recaída associada que envolve células-tronco de leucemia persistente (LSCs). Um modelo experimental de roedores com LMA para testar terapias baseadas no transplante bem-sucedido dessas células via injeções retroorbitais em camundongos receptores é repleto de desafios. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método fácil, confiável e consistente para gerar um modelo murino robusto de LMA usando uma via intraperitoneal. No presente protocolo, células da medula óssea foram transduzidas com um retrovírus expressando oncoproteína de fusão MLL-AF9 humana. A eficiência de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSCs doadoras no desenvolvimento de LMA primária foi testada, e a injeção intraperitoneal foi adotada como um novo método para gerar LMA. A comparação entre as injeções intraperitoneais e retro-orbitárias foi feita em transplantes seriados para comparar e contrastar os dois métodos. As células de Lin e LSK transduzidas com o vírus MLL-AF9 humano enxertado bem na medula óssea e no baço dos receptores, levando a uma LMA completa. A injeção intraperitoneal de células doadoras estabeleceu LMA em receptores após transplante seriado, e a infiltração de células de LMA foi detectada no sangue, medula óssea, baço e fígado dos receptores por citometria de fluxo, qPCR e análises histológicas. Assim, a injeção intraperitoneal é um método eficiente de indução de LMA utilizando transplante seriado de células leucêmicas de doadores.

Comparação da eficiência do transplante de células murinas de LMA utilizando as vias de transplante r.o. e i.p. Previamente, o estabelecimento de 1° AML foi relatado em camundongos receptores transplantados retroorbitalmente com células LSK transduzidas por MLL-AF9, e a transplantabilidade de 1° de células AML foi demonstrada por transplante seriado30. O presente estudo é o primeiro a avaliar a possibilidade de utilização de células de Lin- da medula óss...

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Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Aqui, a injeção intraperitoneal de células leucêmicas é utilizada para estabelecer e propagar a leucemia mieloide aguda (LMA) em camundongos. Este novo método é eficaz no transplante seriado de células da LMA e pode servir como uma alternativa para aqueles que podem experimentar dificuldades e inconsistências com a injeção intravenosa em camundongos.

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Esse protocolo é significativo porque células lin-negativas e células SK isoladas do mesmo camundongo doador não tiveram diferença aparente na geração de LMA-MLL-AF9. Além disso, a injeção IP de células leucêmicas pode desenvolver com sucesso um modelo de LMA em camundongos. Comparada aos métodos convencionais de transplante, essa técnica é mais conveniente e menos dispendiosa.Para começar, esterilize o camundongo fêmea C57BL/6J CD45.1 de 8 a 10 semanas de idade com etanol 70%. Coloque o mouse em uma almofada cirúrgica estéril em uma placa de isopor e fixe as pernas através das almofadas da pata do rato. Corte a pele acima da cavidade abdominal na linha média e amplie o espaço subcutâneo em direção às patas traseiras com uma tesoura estéril afiada.Estender a incisão da linha média abdominal até os tornozelos e ampliar o espaço subcutâneo abaixo das patas traseiras com as lâminas de tesoura afiada. Corte o tendão de Aquiles com uma tesoura afiada. Segure o tendão usando pinças com dentes e corte a outra extremidade presa ao fêmur para remover o músculo gastrocnêmio.Corte o tendão do quadríceps preso ao joelho com uma tesoura afiada. Segure o tendão e corte a cabeça do músculo preso ao fêmur para remover o músculo gastrocnêmio. Corte os outros músculos ao redor do fêmur na extremidade presa à tíbia.Em seguida, corte o tornozelo com uma tesoura afiada, garantindo que a tíbia permaneça intacta. Segure a extremidade distal do fêmur e corte a articulação do quadril com uma tesoura afiada, garantindo que a cabeça femoral permaneça intacta. Transfira as tíbias e fêmures para um tampão de fluxo em um tubo de 15 mililitros.Separe a tíbia e o fêmur quebrando o joelho com a mão. Remova a patela, cartilagem e côndilos femorais para expor o platô tibial e o fêmur distal. Retire os músculos usando gaze estéril e mergulhe os ossos em um tampão de fluxo.Corte o colo femoral e lave as células da medula óssea com tampão de fluxo de ambas as extremidades do fêmur usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 23. Em seguida, corte o maléolo tibial e lave as células da medula óssea com tampão de fluxo de ambas as extremidades da tíbia. Disperse as células pipetando para cima e para baixo usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 18.Centrifugar a suspensão de célula única a quatro graus Celsius e 400 G durante três minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de tampão de lise de hemácias, ou hemácias, para lisar as hemácias por três minutos. Adicione cinco mililitros de tampão de fluxo para parar a lise.Em seguida, centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em cinco mililitros de tampão de fluxo. Coloque um filtro de células de 70 mícrons em um tubo de 50 mililitros e passe a suspensão pelo filtro para coletar as células. Ajuste a concentração celular com tampão de fluxo para uma vez 10 a oito por mililitro em tubos de polipropileno de fundo redondo.Selecione células negativas de linhagem usando um kit de isolamento de células hematopoiéticas de camundongo de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez feito, centrifugar as células-tronco hematopoéticas selecionadas e as células negativas de linhagem não selecionadas e ressuspender em três mililitros de 2X de citocinas, meios IMDM e três mililitros de sobrenadante viral em uma placa revestida retro-redutora. Incube o prato em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por 6 ou 24 horas.Após a transdução, colher as células por centrifugação. Se necessário, use tripsina para coletar as células ligadas ao fundo do prato. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS pré-aquecido.Injetar células no camundongo receptor primário retro-orbital ou intraperitonealmente com uma meia agulha de calibre 27. Monitore o mouse diariamente. Após um mês, coletar sangue semanalmente por sangramento retro-orbital para monitorar a leucocitose avaliando o hemograma completo em um HEMAVET.Proponha o olho com o polegar e o indicador e, em seguida, penetre no plexo do seio venoso com um tubo capilar de hematócrito estéril através do canto interno. Colete de 20 a 25 microlitros de sangue em um tubo de coleta de sangue EDTA e feche as pálpebras para parar o sangramento. Aplique uma gota de solução oftálmica de sulfato de gentamicina no olho.Quando os glóbulos brancos atingirem quatro vezes 10 a quatro células por microlitro, isole as células da medula óssea lavando os fêmures e tíbias com tampão de fluxo, seguido de lise eritrocitária, como descrito anteriormente. Em seguida, para colher os esplenócitos, coloque o mouse em uma almofada cirúrgica estéril em uma placa de isopor e fixe as pernas através das almofadas da pata do rato. Esterilizar o rato com etanol a 70%.Corte a pele e o músculo na linha média para expor a cavidade abdominal com uma tesoura estéril afiada. Isole o baço e coloque-o em um tampão de fluxo em um tubo de 15 mililitros. Malha o baço através de um filtro de 70 mícrons em um prato de seis centímetros com três mililitros de tampão de fluxo.Transfira as células da placa para um tubo de 15 mililitros, centrifugar a suspensão de célula única, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de hemácias por três minutos. Adicione cinco mililitros de tampão de fluxo para parar a lise e centrifugar a suspensão celular. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de fluxo, misture e passe através de um filtro de células de 70 mícrons para coletar células em um tubo de 50 mililitros.Identificar células primárias de leucemia mieloide aguda, ou LMA, corando os esplenócitos e as células da medula óssea com o anticorpo anti-camundongo CD45.1 conjugado FITC e detectando em um citômetro de fluxo. As células são primeiramente acopladas em FSC-A FSC-H e FSC-A SSC-A para adquirir singletes. A população CD45.1 positiva é limitada na parcela FL1 comparando-a com células não coradas.Para transplante secundário, ressuspenda as células esplênicas CD45.1 da LMA de receptores retroorbitários primários em PBS e injete-as retroorbitalmente em camundongos machos CD45.2. A presença de leucocitose aberrante e o aumento da infiltração de células leucêmicas na medula óssea e no baço apoiam a viabilidade do uso de células negativas para linhagem da medula óssea para gerar LMA primária. Não foram observadas diferenças significativas em receptores primários traduzidos com LSK ou células negativas para linhagem.As células AML disseminaram-se na cavidade abdominal dos receptores primários por leucemia de linhagem mista ou células transduzidas de linhagem MLL-AF9 negativas. Esses resultados também confirmaram o estabelecimento da LMA primária via injeção intraperitoneal de células negativas para linhagem da medula óssea transduzidas por MLL-AF9 na forma de leucocitose e a presença de células de LMA na medula óssea e no baço de camundongos receptores. No entanto, o transplante primário por injeção intraperitoneal levou mais tempo para desenvolver LMA do que por injeção retroorbitária, apesar do igual número de células doadoras.Os receptores secundários apresentaram leucocitose e hepatoesplenomegalia significativa em menos de um mês pós-transplante. As células da LMA também foram detectadas no sangue periférico, medula óssea e baço, bem como na cavidade peritoneal. A injeção intraperitoneal de oito vezes 10 para as cinco células de LMA obteve enxertia comparável à injeção retro-orbitária de oito vezes 10 para as cinco LMA.Os camundongos receptores terciários exibiram agudamente sinais de LMA, incluindo leucocitose e hepatoesplenomegalia, presença de células leucêmicas no sangue, medula óssea e baço, observação histológica do fêmur e baço demonstrou ainda a infiltração de células leucêmicas. Comparado aos transplantes secundário e terciário, o transplante terciário progrediu muito mais rápido que o transplante secundário. Para o modelo atual, a classificação de células LSK é desnecessária.As células lin-negativas podem ser transduzidas com o vírus da LMA por 6 horas ou 24 horas. Isso não afetará a eficiência do estabelecimento do modelo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Pesquisa do câncer

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Análise de sequência do Gene da imunoglobulina na leucemia linfocítica crônica: Do paciente Material para interpretação de sequência

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subcultura e Criopreservação de Organoides Adenocarcinoma Esofágico: Prós e Contras para Digestão Celular Única

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...