Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Авторы благодарят Центр проточной цитометрии Института Гека и Центр гистопатологии Лаборатории диагностики животных Департамента ветеринарных и биомедицинских наук Университета штата Пенсильвания за своевременную техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами Американского института исследований рака (KSP), Колледжа сельскохозяйственных наук штата Пенсильвания, Института рака штата Пенсильвания, проекта USDA-NIFA 4771, номер присоединения 00000005 к K.S.P. и R.F.P.

Все эксперименты были предварительно одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Пенсильвания.
1. Приготовление буферов и реагентов
<ol><li>Приготовьте ампициллин с добавлением (AP) LB агаровые пластины (стери...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Эти вышеописанные исследования предоставляют подтверждающие доказательства того, что трансплантация Lin-клеток сопоставима с клетками LSK при генерации 1° мышиного ОМЛ. Кроме того, текущие данные также показывают, что внутривенная инъекция является эффективным и удобным методом у...

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) – это разновидность гематологических злокачественных новообразований различной этиологии с неблагоприятнымпрогнозом1. Генерация моделей животных ОМЛ закладывает основу для понимания его сложных вариаций и патобиологии в попытке открыть новые методы лечения2. Лейкемогенез у мышей включает трансплантацию донорских клеток, экспрессирующих слитые онкопротеины, включая слияния с участием гена лейкемии смешанной линии (MLL) для мощной индукции ОМЛ, чтобы имитировать заболевание у людей3. Сообщалось о различном клеточном происхождении донорских клеток при трансплантации AML4, связанного с геном MLL, при этом очень мало известно о клетках, ответственных за происхождение заболевания.
Было разработано несколько путей трансплантации мышам; вместо внутрибедренной инъекции, которая непосредственно вводит мутантные донорские клетки в костный мозг5, внутривенная инъекция, которая использует венозное синусовое сплетение, хвостовую вену и яремную вену, широко использовалась для создания мышиных моделей AML 6,7,8,9. В случае ретроорбитальной (р.о.) инъекции различные присущие ей недостатки, такие как ограничение объема, высокая техническая требовательность, малая вероятность повторных попыток или ошибок, а также потенциальные повреждения глаз, были основными камнями преткновения при ограниченных или отсутствующих жизнеспособных альтернативах7. Инъекция в хвостовую вену может иметь аналогичные проблемы, помимо местных травм; Чтобы облегчить процедуру, мышей часто нужно разогревать, чтобы расширить их хвостовые вены10. Также трудно определить местонахождение хвостовой вены без дополнительного источника света, особенно у штамма мышей C57BL/6. Для инъекции в яремную вену исследовательский персонал должен пройти достаточную подготовку, чтобы найти вену и ограничить возможные осложнения. Кроме того, инъекции в венозный синус и яремную вену необходимо проводить под наркозом, что добавляет еще один уровень сложности. Таким образом, заманчиво изучить новые пути трансплантации, чтобы облегчить создание мышиных моделей AML.
Внутрибрюшинная (внутривенная) инъекция обычно используется для введения лекарств, красителей и анестетиков 11,12,13,14,15; Он также использовался для введения гемопоэтических клеток для эктопического кроветворения16 и для трансплантации мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, на различных моделяхмышей 17,18,19,20,21. Тем не менее, он нечасто использовался для установления злокачественных новообразований кроветворения у мышей, особенно для изучения прогрессирования заболевания ОМЛ.
В настоящем исследовании описывается целесообразность внутривенной инъекции в поколении мышиных моделей AML, а также сравнивается эффективность трансплантации отрицательных (Lin-) и Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) популяций в качестве донорских клеток. Эти результаты обеспечивают простой и эффективный способ создания экспериментальных моделей ОМЛ и связанных с ним миелоидных лейкозов. Такой метод может способствовать дальнейшему пониманию механизмов заболевания, а также обеспечить относительно простую модель для тестирования экспериментальных методов лечения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Существует неудовлетворенная потребность в новых методах лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и связанного с ним рецидива, связанного с персистирующими лейкозными стволовыми клетками (LSC). Экспериментальная модель грызунов AML для тестирования терапии, основанной на успешной трансплантации этих клеток с помощью ретроорбитальных инъекций мышам-реципиентам, сопряжена с проблемами. Цель этого исследования состояла в том, чтобы разработать простой, надежный и последовательный метод создания надежной мышиной модели ОМЛ с использованием внутрибрюшинного пути. В настоящем протоколе клетки костного мозга трансдуцировали ретровирусом, экспрессирующим слитый онкопротеин MLL-AF9 человека. Была проверена эффективность отрицательных (Lin-) и Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) популяций в качестве донорских LSC в развитии первичного ОМЛ, и внутрибрюшинная инъекция была принята в качестве нового метода генерации ОМЛ. Сравнение между внутрибрюшинными и ретроорбитальными инъекциями проводилось при серийных трансплантациях, чтобы сравнить и сопоставить эти два метода. Клетки Lin- и LSK, трансдуцированные вирусом MLL-AF9 человека, хорошо приживались в костном мозге и селезенке реципиентов, что приводило к полномасштабному ОМЛ. Внутрибрюшинная инъекция донорских клеток установила ОМЛ у реципиентов при серийной трансплантации, а инфильтрация клеток ОМЛ была обнаружена в крови, костном мозге, селезенке и печени реципиентов с помощью проточной цитометрии, кПЦР и гистологических анализов. Таким образом, внутрибрюшинная инъекция является эффективным методом индукции ОМЛ с использованием серийной трансплантации донорских лейкозных клеток.

Сравнение эффективности трансплантации мышиных ОМЛ-клеток с использованием р.о. и в/путей трансплантации Ранее сообщалось об установлении 1° AML у мышей-реципиентов, которым ретроорбитально трансплантировали клетки LSK, трансдуцированные MLL-AF9, а трансплантируемость клеток 1° A...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Здесь внутрибрюшинная инъекция лейкозных клеток используется для установления и распространения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у мышей. Этот новый метод эффективен при серийной трансплантации клеток ОМЛ и может служить альтернативой для тех, кто может испытывать трудности и несоответствия при внутривенном введении мышам.

Внутрибрюшинная трансплантация при возникновении острого миелоидного лейкоза у мышей

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Этот протокол важен, потому что lin-отрицательные клетки и клетки SK, выделенные от одних и тех же мышей-доноров, не имели видимых различий в генерации MLL-AF9, индуцированного AML. Кроме того, IP-инъекция лейкозных клеток может успешно разработать мышиную модель ОМЛ. По сравнению с обычными методами трансплантации, эта методика более удобна и менее затратна.Для начала стерилизуйте мышь C57BL/6J женского пола CD45.1 в возрасте от 8 до 10 недель 70% этанолом. Поместите мышь на стерильную хирургическую подушечку на доске из пенополистирола и прижмите ноги к подушечкам лап мыши. Разрежьте кожу над брюшной полостью по средней линии и расширьте подкожное пространство к задним лапам стерильными ножницами с острым концом.Расширьте разрез от средней линии живота вниз до лодыжек и расширьте подкожное пространство ниже задних лап лезвиями ножниц с острым концом. Разрежьте ахиллово сухожилие ножницами с острым концом. Возьмитесь за сухожилие с помощью щипцов с зубами и отрежьте другой конец, прикрепленный к бедренной кости, чтобы удалить икроножную мышцу.Разрежьте сухожилие четырехглавой мышцы, прикрепленное к колену, ножницами с острым концом. Возьмитесь за сухожилие и разрежьте головку мышцы, прикрепленную к бедренной кости, чтобы удалить икроножную мышцу. Разрежьте другие мышцы, окружающие бедренную кость на конце, прикрепленном к большеберцовой кости.Затем разрежьте лодыжку ножницами с острым концом, следя за тем, чтобы большеберцовая кость оставалась целой. Возьмитесь за дистальный конец бедренной кости и разрежьте тазобедренный сустав ножницами с острым концом, следя за тем, чтобы головка бедренной кости оставалась неповрежденной. Перенесите большеберцовую кость и бедренную кость в буфер потока в 15-миллилитровой пробирке.Разделите большеберцовую и бедренную кости, сломав колено рукой. Удалите надколенник, хрящи и мыщелки бедренной кости, чтобы обнажить плато большеберцовой кости и дистальный отдел бедренной кости. Удалите мышцы с помощью стерильной марли и замочите кости в буфере потока.Разрежьте шейку бедренной кости и промойте клетки костного мозга буфером потока с обоих концов бедренной кости с помощью шприца объемом 10 миллилитров с иглой 23 калибра. Затем разрежьте лодыжку большеберцовой кости и промойте клетки костного мозга буфером потока с обоих концов большеберцовой кости. Диспергируйте клетки, пипеткой вверх и вниз с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 18-го калибра.Центрифугируйте одноячеистую суспензию при четырех градусах Цельсия и 400 G в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах эритроцитов или эритроцитов, буфера для лизиса эритроцитов в течение трех минут. Добавьте пять миллилитров буфера потока, чтобы остановить лизис.Затем центрифугируют клеточную суспензию и ресуспендируют гранулу в пяти миллилитрах проточного буфера. Поместите 70-микронный клеточный фильтр на 50-миллилитровую пробирку и пропустите суспензию через сетчатый фильтр для сбора клеток. Отрегулируйте концентрацию ячеек с буфером потока до 10 раз до восьми на миллилитр в полипропиленовых пробирках с круглым дном.Выберите клетки с отрицательным происхождением, используя набор для выделения гемопоэтических клеток мыши в соответствии с инструкциями производителя. После этого центрифугируют отсортированные гемопоэтические стволовые клетки и несортированные клетки с отрицательной линией и ресуспендируют в трех миллилитрах 2X цитокинов, сред IMDM и трех миллилитров вирусной надосадочной жидкости в чашке, покрытой ретро-восстановителем. Инкубируйте блюдо в увлажненном 5%-ном инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение 6 или 24 часов.После трансдукции собирают клетки центрифугированием. При необходимости используйте трипсин для сбора клеток, прикрепленных к дну чашки. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулы в предварительно разогретом PBS.Вводите клетки в мышь-реципиента ретроорбитально или внутрибрюшинно с помощью полуиглы 27-го калибра. Ежедневно следите за мышью. Через месяц еженедельно собирайте кровь с помощью ретроорбитального кровотечения для мониторинга лейкоцитоза путем оценки общего анализа крови на ГЕМАВЕТ.Проптоузируйте глаз большим и указательным пальцами, затем проникните в венозное синусовое сплетение стерильной гематокритной капиллярной трубкой через внутренний кантус. Соберите от 20 до 25 микролитров крови в пробирку для сбора крови ЭДТА и закройте веки, чтобы остановить кровотечение. Нанесите одну каплю офтальмологического раствора гентамицина сульфата на глаз.Когда лейкоциты достигают четырех раз от 10 до четырех клеток на микролитр, изолируют клетки костного мозга, промывая бедренные кости и большеберцовые кости буфером потока с последующим лизисом эритроцитов, как описано ранее. Затем, чтобы собрать спленоциты, поместите мышь на стерильную хирургическую подушечку на доске из пенополистирола и закрепите ноги через подушечки лап мыши. Стерилизуйте мышь 70% этанолом.Разрежьте кожу и мышцы по средней линии, чтобы обнажить брюшную полость стерильными ножницами с острым концом. Изолируйте селезенку и поместите ее в проточный буфер в 15-миллилитровой пробирке. Пропустите селезенку через 70-микронное ситечко в шестисантиметровой чашке с тремя миллилитрами буфера потока.Перенесите клетки из чашки в 15-миллилитровую пробирку, затем центрифугируйте одноклеточную суспензию, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов в течение трех минут. Добавьте пять миллилитров буфера потока, чтобы остановить лизис, и центрифугируйте клеточную суспензию. Ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах проточного буфера, перемешайте и пропустите через 70-микронный сетчатый фильтр, чтобы собрать ячейки в 50-миллилитровую пробирку.Идентификация клеток первичного острого миелоидного лейкоза или ОМЛ путем окрашивания спленоцитов и клеток костного мозга конъюгированным антителом FITC против мыши CD45.1 и обнаружения на проточном цитометре. Клетки сначала закрываются на FSC-A, FSC-H и FSC-A SSC-A для получения синглетов. CD45.1-положительная популяция закрывается на графике FL1 путем сравнения его с неокрашенными клетками.Для вторичной трансплантации ресуспендируют клетки селезенки CD45.1 AML от первичных реципиентов ретроорбитальной области в PBS и вводят их ретроорбитально мышам-самцам CD45.2. Наличие аберрантного лейкоцитоза и повышенной инфильтрации лейкозных клеток в костном мозге и селезенке подтверждает возможность использования отрицательных клеток линии костного мозга для генерации первичного ОМЛ. Не наблюдалось существенных различий у первичных реципиентов, транслируемых с помощью LSK или клеток с отрицательной линией.Клетки ОМЛ распространяются в брюшной полости первичных реципиентов лейкозом смешанной линии или клетками, трансдуцированными MLL-AF9. Эти результаты также подтвердили установление первичного ОМЛ посредством внутрибрюшинной инъекции трансдуцированных MLL-AF9 клеток костного мозга, отрицательных по линии костного мозга в форме лейкоцитоза и присутствия клеток AML в костном мозге и селезенке мышей-реципиентов. Однако первичная трансплантация с помощью внутрибрюшинной инъекции заняла больше времени для развития ОМЛ, чем с помощью ретроорбитальной инъекции, несмотря на равное количество донорских клеток.Вторичные реципиенты показали лейкоцитоз и значительную гепатоспленомегалию менее чем через месяц после трансплантации. Клетки ОМЛ также были обнаружены в периферической крови, костном мозге и селезенке, а также в брюшной полости. Внутрибрюшинная инъекция восьми раз по 10 пяти клеткам ОМЛ достигала сопоставимого приживления с ретроорбитальной инъекцией в восемь раз по 10 к пяти ОМЛ.У мышей-реципиентов третичного уровня остро проявлялись признаки ОМЛ, включая лейкоцитоз и гепатоспленомегалию, наличие лейкозных клеток в крови, костном мозге и селезенке, гистологическое наблюдение бедренной кости и селезенки дополнительно продемонстрировало инфильтрацию лейкозных клеток. По сравнению с вторичной и третичной трансплантацией, третичная трансплантация прогрессировала намного быстрее, чем вторичная трансплантация. Для текущей модели сортировка ячеек LSK не нужна.Lin-отрицательные клетки могут быть трансдуцированы вирусом AML в течение 6 часов или 24 часов. Это не повлияет на эффективность создания модели.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Анализ последовательности гена иммуноглобулинов в хронический лимфоцитарный лейкоз: От пациента материала для интерпретации последовательности

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Assay иммунопреципитации Chromatin для выявления роман NFAT2 целевых генов в хронический лимфоцитарный лейкоз

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Трансплантация опухоли для оценки динамики инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток у мышей

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Субкультура и криоконсервация органоидов аденокарциномы пищевода: плюсы и минусы одноклеточного пищеварения

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...