Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Los autores agradecen a la Instalación Central de Citometría de Flujo del Instituto Huck y a la Instalación Central de Histopatología del Laboratorio de Diagnóstico Animal, Departamento de Ciencias Veterinarias y Biomédicas, Universidad Estatal de Pensilvania, por brindar apoyo técnico oportuno. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Americano para la Investigación del Cáncer (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, Número de Acceso 00000005 a K.S.P. y R.F.P.

Todos los experimentos fueron aprobados previamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania.
1. Preparación de tampones y reactivos
<ol><li>Preparar ampicilina suplementada (AP) con placas de agar LB (placas estériles de 10 cm). Para hacer esto, disuelva 10 g de caldo LB con agar en 400 ml de agua destilada, revuelva y lleve el volumen hasta 500 ml. Esterilice la solución en autoclave, luego deje que la solución ...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Estos estudios descritos anteriormente proporcionan evidencia de apoyo de que el trasplante de células Lin es comparable a las células LSK en la generación de LMA murina de 1°. Además, los datos actuales también muestran que la inyección i.p. es un método eficiente y conveniente para establecer la LMA murina en comparación con la inyección intravenosa (o r.o.).
Además de las células LSK, se ha informado que otras poblaciones como el progenitor granulocítico-monocitos (G...

La leucemia mieloide aguda (LMA) es un tipo de neoplasia maligna hematológica de etiología diversa con mal pronóstico1. La generación de modelos animales de LMA sienta las bases para la comprensión de sus complejas variaciones y patobiología en un esfuerzo por descubrir nuevas terapias2. La leucemogénesis en ratones implica el trasplante de células donantes que expresan oncoproteínas de fusión, incluidas las fusiones que involucran el gen de la leucemia de linaje mixto (MLL) para inducir potentemente la LMA, para imitar la enfermedad en humanos3. Se han reportado varios orígenes celulares de células de donantes en el trasplante de LMA4 asociada al gen MLL, y se sabe muy poco sobre las células responsables del origen de la enfermedad.
Se han desarrollado múltiples vías para el trasplante en ratones; en lugar de una inyección intrafemoral, que introduce directamente células mutantes del donante en la médula ósea5, una inyección intravenosa que utiliza el plexo sinusal venoso, la vena de la cola y la vena yugular se ha utilizado ampliamente para generar modelos murinos de LMA 6,7,8,9. En el caso de la inyección retroorbitaria (r.o.), varias desventajas inherentes, como la limitación de volumen, la alta demanda técnica, las pocas posibilidades de repetidos intentos o errores, y las posibles lesiones oculares, han sido grandes obstáculos con alternativas limitadas o inviables7. La inyección de venas de la cola puede tener problemas similares además de las lesiones locales; Para facilitar el procedimiento, los ratones a menudo necesitan ser calentados para dilatar sus venas de la cola10. También es difícil localizar la vena de la cola sin una fuente de luz adicional, particularmente en la cepa de ratones C57BL / 6. Para la inyección de vena yugular, el personal de investigación requiere suficiente capacitación para localizar la vena y limitar las posibles complicaciones. Además, tanto las inyecciones de seno venoso como las de venas yugulares deben realizarse bajo anestesia, lo que agrega otro nivel de complejidad. Por lo tanto, es tentador explorar nuevas rutas de trasplante para facilitar el establecimiento de modelos murinos de LMA.
La inyección intraperitoneal (i.p.) se usa comúnmente para administrar medicamentos, colorantes y anestésicos 11,12,13,14,15; También se ha utilizado para introducir células hematopoyéticas para la hematopoyesis ectópica16 y para trasplantar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea en varios modelos de ratón17,18,19,20,21. Sin embargo, se ha utilizado con poca frecuencia para establecer neoplasias malignas hematopoyéticas en ratones, particularmente para estudiar la progresión de la enfermedad de LMA.
El presente estudio describe la viabilidad de la inyección i.p. en la generación de modelos de ratón LMA, además de comparar la eficiencia del trasplante de poblaciones de linaje negativo (Lin-) y Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como células donantes. Estos hallazgos proporcionan una manera simple y eficiente de generar modelos experimentales de AML y leucemias mieloides relacionadas. Tal método tiene el potencial de ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad, así como proporcionar un modelo relativamente fácil para probar terapias experimentales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Existe una necesidad insatisfecha de nuevas terapias para tratar la leucemia mieloide aguda (LMA) y la recaída asociada que involucra células madre de leucemia persistente (LSC). Un modelo experimental de roedores AML para probar terapias basadas en el trasplante exitoso de estas células a través de inyecciones retroorbitarias en ratones receptores está lleno de desafíos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método fácil, confiable y consistente para generar un modelo murino robusto de LMA utilizando una ruta intraperitoneal. En el presente protocolo, las células de la médula ósea se transdujeron con un retrovirus que expresa la oncoproteína de fusión MLL-AF9 humana. Se probó la eficiencia de las poblaciones de linaje negativo (Lin-) y Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSC de donantes en el desarrollo de LMA primaria, y se adoptó la inyección intraperitoneal como un nuevo método para generar LMA. La comparación entre las inyecciones intraperitoneales y retroorbitarias se realizó en trasplantes seriados para comparar y contrastar los dos métodos. Tanto las células Lin como las LSK transducidas con el virus MLL-AF9 humano se injertaron bien en la médula ósea y el bazo de los receptores, lo que llevó a una LMA en toda regla. La inyección intraperitoneal de células del donante estableció la LMA en los receptores tras el trasplante seriado, y la infiltración de células de LMA se detectó en la sangre, la médula ósea, el bazo y el hígado de los receptores mediante citometría de flujo, qPCR y análisis histológicos. Por lo tanto, la inyección intraperitoneal es un método eficiente de inducción de LMA mediante el trasplante en serie de células leucémicas de donantes.

Comparación de la eficiencia del trasplante de células murinas de LMA mediante las vías de trasplante r.o. e i.p. Anteriormente, se informó el establecimiento de 1° LMA en ratones receptores trasplantados retroorbitalmente con células LSK transducidas por MLL-AF9, y la capacidad de trasplante de células de LMA de 1° se demostró mediante trasplante seriado30. El presente estudio es el primero en evaluar la posibilidad de utilizar células Lin- de médula óse...

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Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Aquí, la inyección intraperitoneal de células leucémicas se utiliza para establecer y propagar la leucemia mieloide aguda (LMA) en ratones. Este nuevo método es eficaz en el trasplante seriado de células de LMA y puede servir como una alternativa para aquellos que pueden experimentar dificultades e inconsistencias con la inyección intravenosa en ratones.

Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Este protocolo es significativo porque las células lin-negativas y las células SK aisladas de los mismos ratones donantes no tuvieron diferencias aparentes en la generación de LMA inducida por MLL-AF9. Además, la inyección IP de células leucémicas puede desarrollar con éxito un modelo de ratón de AML. En comparación con los métodos de trasplante convencionales, esta técnica es más conveniente y menos costosa.Para comenzar, esterilice el ratón hembra CD45.1 C57BL / 6J de 8 a 10 semanas de edad con 70% de etanol. Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica estéril en una tabla de espuma de poliestireno y fije las patas a través de las almohadillas de las patas del ratón. Corte la piel por encima de la cavidad abdominal en la línea media y amplíe el espacio subcutáneo hacia las patas traseras con tijeras estériles afiladas.Extienda la incisión desde la línea media abdominal hasta los tobillos y amplíe el espacio subcutáneo debajo de las patas traseras con las hojas de tijeras afiladas. Corte el tendón de Aquiles con tijeras afiladas. Sostenga el tendón con fórceps con dientes y corte el otro extremo unido al fémur para extraer el músculo gastrocnemio.Corte el tendón del cuádriceps unido a la rodilla con tijeras afiladas. Sostenga el tendón y corte la cabeza muscular unida al fémur para extirpar el músculo gastrocnemio. Corte los otros músculos que rodean el fémur en el extremo unido a la tibia.A continuación, corte el tobillo con tijeras afiladas, asegurándose de que la tibia permanezca intacta. Sostenga el extremo distal del fémur y corte la articulación de la cadera con tijeras de punta afilada, asegurando que la cabeza femoral permanezca intacta. Transfiera las tibias y los fémures a un tampón de flujo en un tubo de 15 mililitros.Separe la tibia y el fémur rompiendo la rodilla con la mano. Retire la rótula, el cartílago y los cóndilos femorales para exponer la meseta tibial y el fémur distal. Retire los músculos con una gasa estéril y remoje los huesos en un tampón de flujo.Corte el cuello femoral y enjuague las células de la médula ósea con tampón de flujo desde ambos extremos del fémur con una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 23. A continuación, corte el maléolo tibial y enjuague las células de la médula ósea con amortiguador de flujo desde ambos extremos de la tibia. Dispersar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo usando una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18.Centrifugar la suspensión unicelular a cuatro grados centígrados y 400 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cinco mililitros de glóbulos rojos, o RBC, tampón de lisis para lisar los glóbulos rojos durante tres minutos. Agregue cinco mililitros de tampón de flujo para detener la lisis.Luego centrifugar la suspensión celular y resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón de flujo. Coloque un filtro de células de 70 micras en un tubo de 50 mililitros y pase la suspensión a través del filtro para recoger las células. Ajuste la concentración de la celda con tampón de flujo a una vez de 10 a ocho por mililitro en tubos de polipropileno de fondo redondo.Seleccione células de linaje negativo utilizando un kit de aislamiento de células hematopoyéticas de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez hecho esto, centrifugar las células madre hematopoyéticas clasificadas y las células negativas de linaje no clasificadas y resuspender en tres mililitros de 2X de citoquinas, medios IMDM y tres mililitros de sobrenadante viral en un plato recubierto retrorreductor. Incubar el plato en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 6 o 24 horas.Después de la transducción, cosechar las células por centrifugación. Si es necesario, use tripsina para recolectar las células adheridas al fondo del plato. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en PBS precalentado.Inyecte células en el ratón receptor primario retroorbital o intraperitonealmente con una media aguja de calibre 27. Monitoree el mouse diariamente. Después de un mes, recolectar sangre semanalmente por sangrado retroorbitario para controlar la leucocitosis mediante la evaluación del hemograma completo en un HEMAVET.Propólta el ojo con el pulgar y el índice, luego penetre el plexo sinusal venoso con un tubo capilar de hematocrito estéril a través del canto interno. Recoja de 20 a 25 microlitros de sangre en un tubo de recolección de sangre EDTA y cierre los párpados para detener el sangrado. Aplique una gota de solución oftálmica de sulfato de gentamicina en el ojo.Cuando los glóbulos blancos alcancen cuatro veces 10 a cuatro células por microlitro, aísle las células de la médula ósea enjuagando los fémures y las tibias con tampón de flujo, seguido de lisis de glóbulos rojos como se describió anteriormente. Luego, para cosechar los esplenocitos, coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica estéril en una tabla de espuma de poliestireno y fije las patas a través de las almohadillas de las patas del ratón. Esterilizar el ratón con etanol al 70%.Corte la piel y el músculo en la línea media para exponer la cavidad abdominal con tijeras estériles de punta afilada. Aísle el bazo y colóquelo en un tampón de flujo en un tubo de 15 mililitros. Engranar el bazo a través de un colador de 70 micras en un plato de seis centímetros con tres mililitros de tampón de flujo.Transfiera las células del plato a un tubo de 15 mililitros, luego centrifugue la suspensión de una sola celda, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de lisis RBC durante tres minutos. Agregue cinco mililitros de tampón de flujo para detener la lisis y centrifugar la suspensión celular. Resuspenda el pellet en cinco mililitros de tampón de flujo, mezcle y pase a través de un filtro de células de 70 micras para recoger las células en un tubo de 50 mililitros.Identificar las células primarias de leucemia mieloide aguda, o LMA, tiñendo los esplenocitos y las células de la médula ósea con el anticuerpo anti-ratón CD45.1 conjugado FITC y detectando en un citómetro de flujo. Las células se bloquean primero en FSC-A FSC-H y FSC-A SSC-A para adquirir singletes. La población CD45.1 positiva se cierra en la gráfica FL1 comparándola con células no teñidas.Para el trasplante secundario, resuspender las células esplénicas de LMA CD45.1 de receptores retroorbitarios primarios en PBS e inyectarlas retroorbitalmente en ratones machos CD45.2. La presencia de leucocitosis aberrante y el aumento de la infiltración de células leucémicas en la médula ósea y el bazo apoyan la viabilidad de utilizar células negativas para el linaje de la médula ósea para generar LMA primaria. No se observaron diferencias significativas en los receptores primarios traducidos con LSK o células negativas para linaje.Las células de LMA se diseminan en la cavidad abdominal de los receptores primarios mediante leucemia de linaje mixto o células de linaje negativo transducidas MLL-AF9. Estos resultados también confirmaron el establecimiento de LMA primaria mediante inyección intraperitoneal de células negativas de linaje de médula ósea transducidas MLL-AF9 en forma de leucocitosis y la presencia de células de LMA en la médula ósea y el bazo de ratones receptores. Sin embargo, el trasplante primario mediante inyección intraperitoneal tardó más en desarrollar LMA que mediante inyección retroorbitaria a pesar del mismo número de células del donante.Los receptores secundarios mostraron leucocitosis y hepatoesplenomegalia significativa en menos de un mes después del trasplante. Las células de AML también se detectaron en la sangre periférica, la médula ósea y el bazo, así como en la cavidad peritoneal. La inyección intraperitoneal de ocho veces 10 a las cinco células de LMA logró un injerto comparable a la inyección retroorbitaria de ocho veces 10 a las cinco LMA.Los ratones receptores terciarios exhibieron agudamente signos de LMA que incluyen leucocitosis y hepatoesplenomegalia, la presencia de células leucémicas en la sangre, la médula ósea y el bazo, la observación histológica del fémur y el bazo demostraron aún más la infiltración de células leucémicas. En comparación con los trasplantes secundarios y terciarios, el trasplante terciario progresó mucho más rápido que el trasplante secundario. Para el modelo actual, no es necesario ordenar las celdas LSK.Las células lin-negativas se pueden transducir con el virus de la AML durante 6 horas o 24 horas. No afectará la eficiencia del establecimiento del modelo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Análisis de secuencia del Gene de inmunoglobulina en leucemia linfocítica crónica: Paciente material de interpretación de la secuencia

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma esofágico: pros y contras para la digestión unicelular

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...