Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Författarna tackar Huck Institute's Flow Cytometry Core Facility och Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Pennsylvania State University, för att ge snabb teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA-projekt 4771, anslutningsnummer 00000005 till K.S.P. och RFP.

Alla experiment godkändes i förväg av Institutional Animal Care and Use Committee vid Pennsylvania State University.
1. Beredning av buffertar och reagenser
<ol><li>Förbered ampicillinkompletterade (AP) LB-agarplattor (sterila 10 cm plattor). För att göra detta, lösa upp 10 g LB-buljong med agar i 400 ml destillerat vatten, rör om och sätt volymen upp till 500 ml. Sterilisera lösningen genom autoklavering, låt sedan lösningen svalna, tillsätt 0,5 ml ampicillin (...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Dessa ovan beskrivna studier ger stödjande bevis för att transplantationen av linceller är jämförbar med LSK-celler vid generering av 1° murin AML. Dessutom visar aktuella data också att intravenös (eller r.o.) injektion är en effektiv och bekväm metod för att fastställa murin AML jämfört med intravenös (eller r.o.) injektion.
Förutom LSK-celler har andra populationer såsom granulocytmonocytprogenitor (GMP), vanlig lymfoid stamfader (CLP) och vanlig myeloisk stamfad...

Akut myeloisk leukemi (AML) är en typ av hematologisk malignitet av olika etiologi med dålig prognos1. Genereringen av AML-djurmodeller lägger grunden för förståelsen av dess komplexa variationer och patobiologi i ett försök att upptäcka nya terapier2. Leukemogenes hos möss involverar transplantation av donatorceller som uttrycker fusions-onkoproteiner, inklusive fusioner som involverar genen blandad härstamningsleukemi (MLL) för att kraftigt inducera AML, för att efterlikna sjukdomen hos människor3. Olika cellulära ursprung av donatorceller har rapporterats vid transplantation av MLL-genassocierad AML4, med mycket lite känt om cellerna som är ansvariga för sjukdomens ursprung.
Flera vägar har utvecklats för transplantation på möss; I stället för en intrafemoral injektion, som direkt introducerar mutanta donatorceller i benmärg5, har en intravenös injektion som använder venös sinusplexus, svansven och halsvenen använts i stor utsträckning för att generera murina AML-modeller 6,7,8,9. När det gäller retroorbital injektion (r.o.) har olika inneboende nackdelar, såsom volymbegränsning, hög teknisk efterfrågan, få chanser till upprepade försök eller fel och potentiella ögonskador, varit stora stötestenar med begränsade eller inga genomförbara alternativ7. Svansveninjektion kan ha liknande problem förutom lokala skador; För att underlätta proceduren måste möss ofta värmas upp för att utvidga svansvenerna10. Det är också svårt att lokalisera svansvenen utan en extra ljuskälla, särskilt i C57BL/6-stammen hos möss. För injektion av halsvenen kräver forskningspersonal tillräcklig utbildning för att lokalisera venen och begränsa eventuella komplikationer. Dessutom måste både venösa sinus- och halsveninjektioner utföras under anestesi, vilket ger en annan nivå av komplexitet. Därför är det frestande att utforska nya vägar för transplantation för att underlätta upprättandet av AML-murina modeller.
Intraperitoneal (i.p.) injektion används ofta för att administrera läkemedel, färgämnen och anestetika 11,12,13,14,15; Det har också använts för att introducera hematopoetiska celler för ektopisk hematopoes16 och för att transplantera benmärgshärledda mesenkymala stamceller i olika musmodeller 17,18,19,20,21. Det har dock sällan använts för att etablera hematopoetiska maligniteter hos möss, särskilt för att studera AML-sjukdomsprogression.
Den aktuella studien beskriver genomförbarheten av i.p. injektion i genereringen av AML-musmodeller, förutom att jämföra transplantationseffektiviteten hos härstamningsnegativa (Lin-) och Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populationer som donatorceller. Dessa fynd ger ett enkelt och effektivt sätt att generera experimentella modeller av AML och relaterade myeloida leukemier. En sådan metod har potential att öka vår förståelse av sjukdomsmekanismerna samt ge en relativt enkel modell för att testa experimentella terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Det finns ett ouppfyllt behov av nya terapier för att behandla akut myeloisk leukemi (AML) och tillhörande återfall som involverar ihållande leukemistamceller (LSC). En experimentell AML-gnagarmodell för att testa terapier baserade på framgångsrik transplantation av dessa celler via retroorbitala injektioner i mottagarmöss är full av utmaningar. Syftet med denna studie var att utveckla en enkel, tillförlitlig och konsekvent metod för att generera en robust murin modell av AML med hjälp av en intraperitoneal väg. I det nuvarande protokollet transducerades benmärgsceller med ett retrovirus som uttrycker humant MLL-AF9-fusionsonkoprotein. Effektiviteten hos härstamningsnegativa (Lin-) och Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donator-LSC vid utvecklingen av primär AML testades och intraperitoneal injektion antogs som en ny metod för att generera AML. Jämförelse mellan intraperitoneala och retroorbitala injektioner gjordes i serietransplantationer för att jämföra och kontrastera de två metoderna. Både Lin- och LSK-celler transducerade med humant MLL-AF9-virus transplanterade väl i benmärgen och mjälten hos mottagare, vilket ledde till en fullblåst AML. Den intraperitoneala injektionen av donatorceller etablerade AML hos mottagare vid serietransplantation, och infiltration av AML-celler detekterades i blod, benmärg, mjälte och lever hos mottagare genom flödescytometri, qPCR och histologiska analyser. Således är intraperitoneal injektion en effektiv metod för AML-induktion med seriell transplantation av donatorleukemiska celler.

Jämförelse av transplantationseffektiviteten hos murina AML-celler med hjälp av r.o. och i.p. transplantationsvägar Tidigare rapporterades etablering av 1° AML hos mottagarmöss retroorbitalt transplanterade med MLL-AF9-transducerade LSK-celler, och transplanterbarheten hos 1° AML-celler visades genom serietransplantation30. Den aktuella studien är den första som utvärderar möjligheten att använda benmärgs linceller för att utföra transplantation. Före...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Här används intraperitoneal injektion av leukemiceller för att etablera och sprida akut myeloisk leukemi (AML) hos möss. Denna nya metod är effektiv vid serietransplantation av AML-celler och kan fungera som ett alternativ för dem som kan uppleva svårigheter och inkonsekvenser med intravenös injektion hos möss.

Intraperitoneal transplantation för att generera akut myeloisk leukemi hos möss

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Detta protokoll är signifikant eftersom linnegativa celler och SK-celler isolerade från samma donatormöss inte hade någon uppenbar skillnad i genereringen av MLL-AF9-inducerad AML. Dessutom kan IP-injektion av leukemiska celler framgångsrikt utveckla en musmodell av AML. Jämfört med konventionella transplantationsmetoder är denna teknik bekvämare och billigare.För att börja, sterilisera den 8 till 10 veckor gamla CD45.1 kvinnliga C57BL / 6J-musen med 70% etanol. Placera musen på en steril kirurgisk kudde på en styrofoambräda och stift benen genom muspoten. Skär huden ovanför bukhålan vid mittlinjen och vidga det subkutana utrymmet mot bakbenen med en steril sax med skarpa ändar.Förläng snittet från bukens mittlinje ner till anklarna och bredda det subkutana utrymmet under bakbenen med knivarna på vassa saxar. Klipp hälsenan med en sax. Håll senan med pincett med tänder och skär den andra änden fäst vid lårbenet för att ta bort gastrocnemiusmuskeln.Klipp quadriceps-senan fäst vid knäet med sax med skarp sax. Håll senan och skär muskelhuvudet fäst vid lårbenet för att ta bort gastrocnemiusmuskeln. Skär de andra musklerna som omger lårbenet i slutet fäst vid skenbenet.Skär sedan fotleden med sax med skarpa ändar, så att skenbenet förblir intakt. Håll den distala änden av lårbenet och skär höftleden med vassa saxar, se till att lårbenshuvudet förblir intakt. Överför skenbenet och lårbenet till en flödesbuffert i ett 15 ml rör.Separera skenbenet och lårbenet genom att bryta knäet för hand. Ta bort patella, brosk och femorala kondyler för att exponera tibialplatån och distala lårbenet. Ta bort musklerna med steril gasväv och blötlägg benen i en flödesbuffert.Skär lårbenshalsen och spola benmärgscellerna med flödesbuffert från båda ändarna av lårbenet med en 10 ml spruta med en 23 gauge nål. Därefter skär tibial malleolus och spola benmärgscellerna med flödesbuffert från båda ändarna av tibia. Sprid cellerna genom pipettering upp och ner med en 10 ml spruta med en 18 gauge nål.Centrifugera encellssuspensionen vid fyra grader Celsius och 400 G i tre minuter. Kassera supernatanten och resuspendera cellerna i fem milliliter röda blodkroppar, eller RBC, lyseringsbuffert för att lysera RBC: erna i tre minuter. Tillsätt fem milliliter flödesbuffert för att stoppa lysen.Centrifugera sedan cellsuspensionen och återsuspendera pelleten i fem milliliter flödesbuffert. Placera en 70 mikron cellsil på ett 50 ml rör och passera suspensionen genom silen för att samla cellerna. Justera cellkoncentrationen med flödesbuffert till en gånger 10 till åtta per milliliter i polypropenrör med rund botten.Välj härstamningsnegativa celler med hjälp av ett hematopoetiskt cellisoleringssats för möss enligt tillverkarens instruktioner. När du är klar, centrifugera de sorterade hematopoetiska stamcellerna och osorterade härstamningsnegativa celler och resuspendera i tre milliliter 2X cytokiner, IMDM-media och tre milliliter viral supernatant i en retro-reduktant belagd skål. Inkubera skålen i en fuktad 5% koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i 6 eller 24 timmar.Efter transduktion, skörda cellerna genom centrifugering. Om det behövs, använd trypsin för att samla cellerna fästa vid skålbotten. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i förvärmd PBS.Injicera celler i den primära mottagarmusen retroorbitalt eller intraperitonealt med en 27 gauge halv nål. Övervaka musen dagligen. Efter en månad, samla blod varje vecka genom retroorbital blödning för att övervaka leukocytos genom att utvärdera det fullständiga blodtalet på en HEMAVET.Proptose ögat med tummen och pekfingret och träng sedan in i venös sinus plexus med ett sterilt hematokritkapillärrör genom den inre canthusen. Samla 20 till 25 mikroliter blod i ett EDTA-bloduppsamlingsrör och stäng ögonlocken för att stoppa blödningen. Applicera en droppe gentamycinsulfat oftalmisk lösning på ögat.När de vita blodkropparna når fyra gånger 10 till de fyra cellerna per mikroliter, isolera benmärgscellerna genom att spola lårbenen och skenbenet med flödesbuffert, följt av RBC-lys som beskrivits tidigare. Därefter, för att skörda splenocyterna, placera musen på en steril kirurgisk kudde på en styrofoambräda och stift benen genom muspoten. Sterilisera musen med 70% etanol.Skär huden och muskeln vid mittlinjen för att exponera bukhålan med steril sax med skarpa ändar. Isolera mjälten och lägg den i en flödesbuffert i ett 15 ml rör. Mesh mjälten genom en 70 mikron sil i en sex centimeter skål med tre milliliter flödesbuffert.Överför cellerna från skålen till ett 15 ml rör, centrifugera sedan encellssuspensionen, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i fem milliliter RBC-lysbuffert i tre minuter. Tillsätt fem milliliter flödesbuffert för att stoppa lysen och centrifugera cellsuspensionen. Återsuspendera pelleten i fem milliliter flödesbuffert, blanda och passera genom en 70 mikron cellsil för att samla celler i ett 50 ml rör.Identifiera primära akuta myeloida leukemi- eller AML-celler genom att fläcka splenocyterna och benmärgscellerna med FITC-konjugerad CD45.1-antikropp mot mus och detektera på en flödescytometer. Cellerna är först gated på FSC-A, FSC-H och FSC-A SSC-A för att förvärva singlets. Den CD45.1-positiva populationen är gated på FL1-diagrammet genom att jämföra den med ofärgade celler.För sekundär transplantation, resuspendera CD45.1 AML-mjältceller från primära retroorbitala mottagare i PBS och injicera dem retroorbitalt i CD45.2 hanmus. Förekomsten av avvikande leukocytos och ökad infiltration av leukemiska celler i benmärgen och mjälten stöder möjligheten att använda benmärgslinjenegativa celler för att generera primär AML. Inga signifikanta skillnader observerades hos primära mottagare översatta med LSK eller härstamningsnegativa celler.AML-cellerna sprids i bukhålan hos primära mottagare genom blandad härstamningsleukemi eller MLL-AF9-transducerade härstamningsnegativa celler. Dessa resultat bekräftade också etableringen av primär AML via intraperitoneal injektion av MLL-AF9-transducerade benmärgslinjenegativa celler i form av leukocytos och närvaron av AML-celler i benmärgen och mjälten hos mottagarmöss. Primärtransplantation via intraperitoneal injektion tog dock längre tid att utveckla AML än via retroorbital injektion trots lika många donatorceller.De sekundära mottagarna visade leukocytos och signifikant hepatosplenomegali mindre än en månad efter transplantationen. AML-cellerna detekterades också i perifert blod, benmärg och mjälte, liksom i bukhålan. Den intraperitoneala injektionen av åtta gånger 10 till de fem AML-cellerna uppnådde jämförbar engraftment med retroorbital injektion av åtta gånger 10 till de fem AML.De tertiära mottagarmössen uppvisade akut AML-tecken inklusive leukocytos och hepatosplenomegali, närvaron av leukemiska celler i blodet, benmärgen och mjälten, histologisk observation av lårbenet och mjälten visade vidare infiltrationen av leukemiska celler. Jämfört med sekundära och tertiära transplantationer framskred tertiärtransplantationen mycket snabbare än den sekundära transplantationen. För den nuvarande modellen är sortering av LSK-celler onödig.Linnegativa celler kan transduceras med AML-virus i 6 timmar eller 24 timmar. Det kommer inte att påverka effektiviteten i modelletableringen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Ett detaljerat protokoll för att karakterisera Murine C1498 cellinje och dess associerade leukemi musmodell

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Beredning av primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser av Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Från patientmaterial sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analysen identifiera roman NFAT2 målgener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Två flödescytometriska metoder för NKG2D Ligand Ytdetektering för att skilja stamceller från bulkunderpopulationer i akut myeloisk leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumörtransplantation för att bedöma dynamiken hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler hos möss

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur och kryokonservering av esofagusadenokarcinomorganoider: Fördelar och nackdelar för encellsförtunning

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...