Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Yazarlar, Huck Enstitüsü'nün Akış Sitometri Çekirdek Tesisi'ne ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi, Veterinerlik ve Biyomedikal Bilimler Bölümü, Hayvan Teşhis Laboratuvarı'nın Histopatoloji Çekirdek Tesisi'ne zamanında teknik destek sağladıkları için teşekkür eder. Bu çalışma, Amerikan Kanser Araştırmaları Enstitüsü (KSP), Penn State Tarım Bilimleri Koleji, Penn State Kanser Enstitüsü, USDA-NIFA projesi 4771, K.S.P. ve R.F.P.'ye 00000005 katılım numarası ile desteklenmiştir.

Tüm deneyler, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından önceden onaylanmıştır.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Ampisilin takviyeli (AP) LB agar plakaları (steril 10 cm plakalar) hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 g LB suyunu agar ile 400 mL damıtılmış suda çözün, karıştırın ve hacmi 500 mL'ye çıkarın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, ardından çözeltinin soğuma...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Yukarıda tarif edilen bu çalışmalar, Lin- hücrelerinin transplantasyonunun 1 ° murin AML oluşumundaki LSK hücreleri ile karşılaştırılabilir olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ek olarak, mevcut veriler ayrıca i.p. enjeksiyonunun, intravenöz (veya ro) enjeksiyona kıyasla murin AML'yi oluşturmak için etkili ve uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.
LSK hücrelerine ek olarak, granülosit-monosit progenitör (GMP), ortak lenfoid progenitör (CLP)...

Akut miyeloid lösemi (AML), kötü prognozlu1 etiyolojisi olan çeşitli hematolojik malignitelerin bir türüdür. AML hayvan modellerinin oluşturulması, yeni tedavileri keşfetme çabasıyla karmaşık varyasyonlarının ve patobiyolojisinin anlaşılması için temel oluşturur2. Farelerde lösemigenez, insanlarda hastalığı taklit etmek için AML'yi güçlü bir şekilde indüklemek için karışık soy lösemi (MLL) genini içeren füzyonlar da dahil olmak üzere füzyon onkoproteinlerini eksprese eden donör hücrelerin transplantasyonunu içerir3. MLL geni ile ilişkili AML4'ün transplantasyonunda donör hücrelerin çeşitli hücresel kökenleri bildirilmiştir ve hastalığın kökeninden sorumlu hücreler hakkında çok az şey bilinmektedir.
Farelerde transplantasyon için birçok yol geliştirilmiştir; Mutant donör hücreleri doğrudan kemik iliği5'e sokan bir intra-femoral enjeksiyon yerine, venöz sinüs pleksus, kuyruk veni ve juguler veni kullanan intravenöz bir enjeksiyon, murin AML modelleri 6,7,8,9'u üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Retro-orbital (r.o.) enjeksiyon durumunda, hacim sınırlaması, yüksek teknik talep, tekrarlanan girişimler veya hatalar için az şans ve potansiyel oküler yaralanmalar gibi çeşitli doğal dezavantajlar, sınırlı veya hiç uygulanabilir alternatifi olmayan büyük tökezleyen bloklar olmuştur7. Kuyruk damarı enjeksiyonunda lokal yaralanmaların yanı sıra benzer sorunlar da olabilir; Prosedürü kolaylaştırmak için, farelerin kuyruk damarlarını genişletmek için genellikle ısıtılması gerekir10. Kuyruk damarını, özellikle C57BL / 6 fare suşunda, ek bir ışık kaynağı olmadan bulmak da zordur. Juguler ven enjeksiyonu için, araştırma personeli damarı bulmak ve olası komplikasyonları sınırlamak için yeterli eğitim gerektirir. Ek olarak, hem venöz sinüs hem de juguler ven enjeksiyonlarının anestezi altında yapılması gerekir, bu da başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bu nedenle, AML murin modellerinin oluşturulmasını kolaylaştırmak için transplantasyon için yeni yollar araştırmak caziptir.
İntra-peritoneal (i.p.) enjeksiyon yaygın olarak ilaçları, boyaları ve anestezikleri uygulamak için kullanılır 11,12,13,14,15; Ayrıca ektopik hematopoez16 için hematopoetik hücreleri tanıtmak ve çeşitli fare modellerinde kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri nakletmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21. Bununla birlikte, farelerde hematopoetik maligniteler oluşturmak için, özellikle AML hastalığının ilerlemesini incelemek için nadiren kullanılmıştır.
Bu çalışma, AML fare modellerinin üretiminde i.p. enjeksiyonunun fizibilitesini açıklamanın yanı sıra, soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) popülasyonlarının donör hücreler olarak transplantasyon verimliliğini karşılaştırmaktadır. Bu bulgular, AML ve ilişkili miyeloid lösemilerin deneysel modellerini oluşturmak için basit ve etkili bir yol sağlar. Böyle bir yöntem, hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamamızın yanı sıra deneysel tedavileri test etmek için nispeten kolay bir model sağlama potansiyeline sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Akut miyeloid lösemiyi (AML) ve kalıcı lösemi kök hücrelerini (LSC'ler) içeren ilişkili nüksleri tedavi etmek için yeni tedavilere karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Alıcı farelerde retro-orbital enjeksiyonlar yoluyla bu hücrelerin başarılı bir şekilde nakledilmesine dayanan terapileri test etmek için deneysel bir AML kemirgen modeli, zorluklarla doludur. Bu çalışmanın amacı, intraperitoneal bir yol kullanarak sağlam bir murin AML modeli oluşturmak için kolay, güvenilir ve tutarlı bir yöntem geliştirmektir. Mevcut protokolde, kemik iliği hücreleri, insan MLL-AF9 füzyon onkoproteinini eksprese eden bir retrovirüs ile dönüştürüldü. Primer AML gelişiminde donör LSC'ler olarak soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) popülasyonlarının etkinliği test edilmiş ve AML üretmek için yeni bir yöntem olarak intra-peritoneal enjeksiyon benimsenmiştir. Seri transplantasyonlarda intraperitoneal ve retro-orbital enjeksiyonlar arasında karşılaştırma yapılarak iki yöntemin karşılaştırılması ve karşılaştırılması sağlandı. İnsan MLL-AF9 virüsü ile transdübe edilen hem Lin- hem de LSK hücreleri, alıcıların kemik iliğine ve dalağına iyi aşılanmış ve tam gelişmiş bir AML'ye yol açmıştır. Donör hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu, seri transplantasyon üzerine alıcılarda AML oluşturdu ve akım sitometrisi, qPCR ve histolojik analizlerle AML hücrelerinin infiltrasyonu alıcıların kan, kemik iliği, dalak ve karaciğerinde tespit edildi. Bu nedenle, intraperitoneal enjeksiyon, donör lösemik hücrelerin seri transplantasyonu kullanılarak AML indüksiyonunun etkili bir yöntemidir.

Murin AML hücrelerinin transplantasyon etkinliğinin r.o. ve i.p. transplantasyon yolları kullanılarak karşılaştırılması Daha önce, MLL-AF9-transdüse LSK hücreleri ile retro-orbital olarak nakledilen alıcı farelerde 1° AML oluşumu bildirilmiş ve 1° AML hücrelerinin nakledilebilirliği seri transplantasyon30 ile gösterilmiştir. Bu çalışma, transplantasyon gerçekleştirmek için kemik iliği Lin-hücrelerinin kullanılma olasılığını değer...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Burada, farelerde akut miyeloid lösemiyi (AML) oluşturmak ve yaymak için lösemi hücrelerinin intra-peritoneal enjeksiyonu kullanılır. Bu yeni yöntem, AML hücrelerinin seri transplantasyonunda etkilidir ve farelerde intravenöz enjeksiyon ile zorluk ve tutarsızlık yaşayabilecek kişiler için bir alternatif olarak hizmet edebilir.

Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Bu protokol önemlidir, çünkü aynı donör farelerden izole edilen lin-negatif hücreler ve SK hücreleri, MLL-AF9 ile indüklenen AML oluşumunda belirgin bir fark göstermemiştir. Ayrıca, lösemik hücrelerin IP enjeksiyonu, AML'nin bir fare modelini başarıyla geliştirebilir. Geleneksel transplantasyon yöntemlerine kıyasla, bu teknik daha uygun ve daha ucuzdur.Başlamak için, 8 ila 10 haftalık CD45.1 dişi C57BL/6J fareyi %70 etanol ile sterilize edin. Fareyi strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin. Cildi orta hatta karın boşluğunun üzerinde kesin ve deri altı boşluğunu keskin uçlu steril makasla arka bacaklara doğru genişletin.Kesi karın orta hattından ayak bileklerine kadar uzatın ve keskin uçlu makas bıçaklarıyla arka bacakların altındaki deri altı boşluğunu genişletin. Aşil tendonunu keskin uçlu makasla kesin. Tendonu dişlerle forseps kullanarak tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı diğer ucu kesin.Diz üzerine tutturulmuş kuadriseps tendonunu keskin uçlu makasla kesin. Tendonu tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı kas kafasını kesin. Tibiaya bağlı sonunda femuru çevreleyen diğer kasları kesin.Daha sonra, ayak bileğini keskin uçlu makasla kesin ve tibianın bozulmadan kalmasını sağlayın. Femurun distal ucunu tutun ve kalça eklemini keskin uçlu makasla kesin, femur başının sağlam kalmasını sağlayın. Tibias ve femurları 15 mililitrelik bir tüpteki bir akış tamponuna aktarın.Tibia ve femuru diz elle kırarak ayırın. Tibial plato ve distal femuru ortaya çıkarmak için patella, kıkırdak ve femoral kondilleri çıkarın. Steril gazlı bez kullanarak kasları çıkarın ve kemikleri bir akış tamponuna batırın.Femur boynunu kesin ve kemik iliği hücrelerini, 23 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak femurun her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın. Daha sonra, tibial malleolusu kesin ve kemik iliği hücrelerini tibianın her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın. 18 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri dağıtın.Tek hücreli süspansiyonu üç dakika boyunca dört santigrat derece ve 400 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve RBC'leri üç dakika boyunca lize etmek için hücreleri beş mililitre kırmızı kan hücresi veya RBC, lizis tamponunda yeniden askıya alın. Lizisi durdurmak için beş mililitre akış tamponu ekleyin.Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve peletleri beş mililitre akış tamponunda yeniden askıya alın. 50 mililitrelik bir tüpe 70 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücreleri toplamak için süspansiyonu süzgeçten geçirin. Akış tamponu ile hücre konsantrasyonunu, yuvarlak tabanlı polipropilen tüplerde mililitre başına bir kez 10 ila sekiz arasında ayarlayın.Üreticinin talimatlarına göre bir fare hematopoetik hücre izolasyon kiti kullanarak soy negatif hücreleri seçin. Bir kez yapıldıktan sonra, sıralanmış hematopoetik kök hücreleri ve sıralanmamış soy-negatif hücreleri santrifüj edin ve retro-redüktan kaplı bir tabakta üç mililitre 2X sitokin, IMDM ortamı ve üç mililitre viral süpernatantta yeniden askıya alın. Çanağı nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede 6 veya 24 saat boyunca inkübe edin.Transdüksiyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Gerekirse, çanak tabanına bağlı hücreleri toplamak için tripsin kullanın. Supernatant'ı atın ve peleti önceden ısıtılmış PBS'de yeniden askıya alın.Hücreleri birincil alıcı fareye retro-orbital veya intraperitoneal olarak 27 gauge yarım iğne ile enjekte edin. Fareyi günlük olarak izleyin. Bir ay sonra, bir HEMAVET'teki tam kan sayımını değerlendirerek lökositozu izlemek için retro-orbital kanama ile haftalık kan toplayın.Gözü başparmak ve işaret parmağıyla proptozlayın, daha sonra venöz sinüs pleksusuna steril bir hematokrit kılcal tüp ile iç kanthustan nüfuz edin. Bir EDTA kan toplama tüpüne 20 ila 25 mikrolitre kan toplayın ve kanamayı durdurmak için göz kapaklarını kapatın. Göze bir damla gentamisin sülfat oftalmik çözeltisi uygulayın.Beyaz kan hücreleri mikrolitre başına dört kez 10'a ulaştığında, femurları ve tibiaları akış tamponu ile yıkayarak kemik iliği hücrelerini izole edin, ardından daha önce açıklandığı gibi RBC lizisi izleyin. Daha sonra, splenositleri hasat etmek için, fareyi strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin. Fareyi %70 etanol ile sterilize edin.Karın boşluğunu keskin uçlu steril makasla ortaya çıkarmak için orta hattaki cildi ve kası kesin. Dalağı izole edin ve 15 mililitrelik bir tüpte bir akış tamponuna koyun. Dalağı, üç mililitre akış tamponuna sahip altı santimetrelik bir tabakta 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin.Hücreleri çanaktan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından tek hücreli süspansiyonu santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti üç dakika boyunca beş mililitre RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Lizisi durdurmak ve hücre süspansiyonunu santrifüj etmek için beş mililitre akış tamponu ekleyin. Peletleri beş mililitrelik bir akış tamponunda tekrar askıya alın, karıştırın ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplamak için 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.Primer akut miyeloid lösemi veya AML hücrelerini, splenositleri ve kemik iliği hücrelerini FITC konjuge anti-fare CD45.1 antikoru ile boyayarak ve bir akış sitometresinde tespit ederek tanımlayın. Hücreler ilk önce FSC-A, FSC-H ve FSC-A SSC-A üzerine kapılıdır. CD45.1 pozitif popülasyonu, FL1 grafiği üzerinde, lekelenmemiş hücrelerle karşılaştırılarak kapılıdır.Sekonder transplantasyon için, PBS'deki birincil retro-orbital alıcılardan CD45.1 AML splenik hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları CD45.2 erkek fareye retro-orbital olarak enjekte edin. Anormal lökositoz varlığı ve kemik iliği ve dalakta lösemik hücrelerin artmış infiltrasyonu, primer AML üretmek için kemik iliği soy-negatif hücrelerin kullanılmasının fizibilitesini desteklemektedir. LSK veya soy-negatif hücrelerle çevrilen primer alıcılarda anlamlı bir fark gözlenmedi.AML hücreleri, primer alıcıların karın boşluğunda karışık soy lösemisi veya MLL-AF9 transdüe soy-negatif hücreler tarafından yayılır. Bu sonuçlar aynı zamanda lökositoz şeklinde MLL-AF9 transdüe kemik iliği soy-negatif hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla primer AML'nin oluşumunu ve alıcı farelerin kemik iliği ve dalağında AML hücrelerinin varlığını doğrulamıştır. Bununla birlikte, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla yapılan primer transplantasyonun, eşit sayıda donör hücreye rağmen AML'yi geliştirmesi, retro-orbital enjeksiyondan daha uzun sürdü.Sekonder alıcılarda transplantasyon sonrası bir aydan kısa bir sürede lökositoz ve belirgin hepatosplenomegali saptandı. AML hücreleri ayrıca periferik kan, kemik iliği ve dalakta ve ayrıca periton boşluğunda tespit edildi. Beş AML hücresine sekiz kez 10 intraperitoneal enjeksiyon, beş AML'ye sekiz kez 10'luk retro-orbital enjeksiyonla karşılaştırılabilir engraftmana ulaştı.Üçüncül alıcı fareler akut olarak lökositoz ve hepatosplenomegali, kan, kemik iliği ve dalakta lösemik hücrelerin varlığı, femur ve dalağın histolojik gözlemi gibi AML bulguları sergiledi ve lösemik hücrelerin infiltrasyonunu gösterdi. Sekonder ve üçüncül transplantasyonlarla karşılaştırıldığında üçüncül transplantasyon sekonder transplantasyondan çok daha hızlı ilerlemiştir. Geçerli model için LSK hücrelerini sıralamak gereksizdir.Lin-negatif hücreler AML virüsü ile 6 saat veya 24 saat boyunca dönüştürülebilir. Model kurulumunun verimliliğini etkilemeyecektir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Kronik Lenfositik Lösemi içinde immünglobulin Gene dizi analizi: Sıra yoruma hasta malzemeden

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Özofagus adenokarsinom organoidlerinin alt kültürü ve kriyoprezervasyonu: Tek hücreli sindirim için artıları ve eksileri

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...