Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

نشكر الدكتورة إيريكا ب. كاي والدكتورة يوكي إيشيكاوا على تطوير الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول (انظر المرجع 11). يتم دعم الأبحاث في مختبرات S.K. و PE بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01DK120445 ، P30DK036836) ، JDRF ، معهد هارفارد للخلايا الجذعية ، ومؤسسة بيتسون. تم دعم T.S. من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) (T32 DK007260-45) ، وتم دعم K.B. جزئيا من خلال زمالة من مؤسسة Mary K. Iacocca.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> الشكل 1: سير العمل لزراعة الطعوم وتصويرها في نموذج النقل بالتبني لمرض السكري في الفئران. يتم زرع خلايا NIT-1 التي تعبر عن اليراع الناقل الجيني لوسيفيراز (luc2) تحت الجلد في الفئران NOD-scid. يتم حقن ?...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

T1D هو مرض مدمر لا يوجد علاج له حاليا. يقدم العلاج ببدائل خلايا بيتا علاجا واعدا للمرضى الذين يعانون من هذا المرض ، ولكن العائق الحاسم أمام هذه الاستراتيجية هو احتمال حدوث هجوم مناعي ذاتي متكرر ضد خلايا بيتا المزروعة. الهندسة الوراثية لخلايا SC-beta لتقليل ظهورها المناعي أو قابليتها للتأثر هي ?...

يحدث مرض السكري من النوع الأول (T1D) بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا المنتجة للأنسولين في البنكرياس. يؤدي فقدان كتلة خلايا بيتا إلى نقص الأنسولين وارتفاع السكر في الدم. يعتمد مرضى T1D على الحقن اليومية المتعددة للأنسولين الخارجي ويعانون من نوبات من ارتفاع السكر في الدم الشديد ونقص السكر في الدم طوال حياتهم. تشمل المضاعفات المرتبطة بهذه الحلقات اعتلال الشبكية السكري ، وانخفاض وظائف الكلى ، والاعتلال العصبي1.
حقن الأنسولين هي علاج ولكن ليس علاجا ل T1D. ومع ذلك ، فإن استبدال كتلة خلايا بيتا المفقودة لديه القدرة على عكس المرض من خلال تمكين المرضى من إنتاج الأنسولين الخاص بهم. ومع ذلك ، فإن المعروض من الجزر المانحة للجثث محدود2. قد توفر الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية (SC-islets) إمدادات غير محدودة تقريبا من خلايا بيتا للزراعة. أثبتت عدة مجموعات أنه يمكن تمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) لتوليد خلايا وظيفية شبيهة ببيتا3،4،5. تشير بيانات التجارب السريرية المبكرة الواعدة إلى أن هذه الخلايا تحافظ على وظيفتها بعد الزرع وقد تمكن المرضى من أن يصبحوا مستقلين عن الأنسولين6. ومع ذلك ، فإن كبت المناعة المزمن مطلوب ، مما يزيد من تعرضهم للإصابة بالسرطان والعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون العوامل المثبطة للمناعة سامة للخلايا للطعوم على المدىالطويل 7. للقضاء على الحاجة إلى كبت المناعة ، يمكن تعديل الجزر SC وراثيا لحمايتها من المناعة الذاتية المتكررة وكذلك المناعة الخيفية بعد الزرع.
أبحاث الخلايا الجذعية تتطلب الكثير من حيث التكاليف والعمالة. تعد خطوط خلايا الفأر والنماذج الحيوانية أدوات مفيدة للتحديد الأولي والتحقق التجريبي من استراتيجيات حماية الخلايا المزروعة من المناعة الذاتية. يصاب فأر NOD بمرض السكري المناعي الذاتي العفوي مع العديد من أوجه التشابه مع T1D8 البشري ، ويشترك خط خلايا الورم الأنسوليني NIT-1 في خلفية وراثية مع سلالة الفأر9. يمكن نقل مرض السكري بالتبني إلى سلالة الفئران NOD-scid ذات الصلة التي تعاني من نقص المناعة عن طريق حقن خلايا الطحال السكرية من فئران NOD من أجل مزامنة ظهور مرض السكري مؤقتا في الفئران التجريبيةالمكررة 10. يمكن استخدام هذا النموذج لتحديد الأهداف الجينية بسرعة نسبية وبتكلفة زهيدة لمزيد من التحقق في الجزر SC. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق الطريقة لتحديد والتحقق من صحة RNLS ، وهو هدف تم العثور عليه لحماية الجزر البشرية الأولية من المناعة الذاتية في الجسم الحي والجزر المشتقة من iPSC من إجهاد خلايا بيتا في المختبر11. الموصوف هنا هو بروتوكول مباشر لزرع خلايا NIT-1 المعدلة وراثيا ومراقبة بقائها على قيد الحياة بشكل غير جراحي في نموذج نقل بالتبني لمرض السكري المناعي الذاتي في الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

يتميز مرض السكري من النوع 1 بتدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا المنتجة للأنسولين في البنكرياس. العلاج الواعد لهذا المرض هو زرع خلايا بيتا المشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، قد تكون التعديلات الجينية ضرورية لحماية الخلايا المزروعة من المناعة الذاتية المستمرة. تعد نماذج الفئران المصابة بالسكري أداة مفيدة للتقييم الأولي لاستراتيجيات حماية الخلايا المزروعة من هجوم المناعة الذاتية. الموصوفة هنا هي طريقة طفيفة التوغل لزرع وتصوير الطعوم الخلوية في نموذج نقل بالتبني لمرض السكري في الفئران. في هذا البروتوكول ، يتم زرع خلايا من خط خلايا بيتا البنكرياس NIT-1 الذي يعبر عن اليراع luciferase transgene luc2 تحت الجلد في الفئران المصابة بنقص المناعة غير البدينة (NOD) - شديدة النقص المناعي المشترك (scid). يتم حقن هذه الفئران في وقت واحد عن طريق الوريد مع خلايا الطحال من الفئران NOD السكري تلقائيا لنقل المناعة الذاتية. يتم تصوير الطعوم على فترات منتظمة عبر التصوير الحيوي غير الجراحي لمراقبة بقاء الخلية. تتم مقارنة بقاء الخلايا الطافرة مع بقاء الخلايا الضابطة المزروعة في نفس الفأر.

ويرد في الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول. يمكن مقارنة بقاء خطين خلويين ، مثل عنصر تحكم متحور وغير مستهدف ، أو يمكن قياس بقاء خط خلية واحد في مجموعات متعددة من الفئران ، مثل الفئران المعالجة بالعقاقير مقابل الضوابط المعالجة بالمركبات. يوضح الشكل 3 أ ثلاث إناث ...

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة وطفيفة التوغل لزرع وتصوير خلايا NIT-1 في الفئران المصابة بالسكري غير البدينة (NOD) التي تعاني من نقص المناعة الشديد والتي تم تحديها مع خلايا الطحال المنقاة من فئران NOD المصابة بالسكري تلقائيا.

مراقبة التوهج الحيوي لبقاء الكسب غير المشروع في نموذج نقل بالتبني لمرض السكري المناعي الذاتي في الفئران

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في فهم آليات الحماية من هجمات المناعة الذاتية وتحديد الأهداف العلاجية لاستبدال خلايا بيتا في مرض السكري من النوع الأول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التكلفة المنخفضة نسبيا ، وبساطة زراعة الخلايا ، وطرق الزرع والتصوير ، فضلا عن الحد الأدنى من غزو تقنيات الماوس. الأفراد الذين لم يسبق لهم إجراء حقن الوريد الذيل من قبل قد يكافحون لإدخال الإبرة في الوريد.اطلب عرضا توضيحيا من قبل خبير قبل الحقن الأول. للبدء ، خذ الفأر المخدر وقم بإزالة الشعر من جانبه الظهري باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية مع واقي ، مما يعرض ما يقرب من بوصة واحدة في بوصتين من الجلد. أعد الماوس المحلوق إلى غرفة الضربة القاضية.قبل عملية الزرع ، انقل فأرا واحدا في كل مرة من الغرفة إلى سطح نظيف مجهز بمخروط أنف إيزوفلوران وقم بتوجيه رأس الماوس برفق إلى مخروط الأنف. امسح المنطقة المحلوقة بوسادة تحضير كحول الأيزوبروبيل لإزالة الشعر المتساقط وتطهير الجلد. بعد ذلك ، اسحب أكثر من 300 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة معقمة سعة ملليلتر واحدة مزودة بإبرة قياس 26.قم بإزالة أي فقاعات من المحقنة واحتفظ ب 300 ميكرولتر من تعليق الخلية أثناء دفع الفائض. باستخدام زوج من الملقط المنحني المثبت في اليد غير المهيمنة ، ارفع الجلد برفق على جانب واحد من ظهر الماوس للسماح بوصول أسهل إلى المساحة تحت الجلد. ثم باستخدام اليد المهيمنة ، ضع المحقنة بالتوازي مع السهول الإكليلية والسهمية لجسم الماوس.مع توجيه الإبرة نحو رأس الفأر ، أدخلها في الجلد بالقرب من الأرباع الخلفية وقم بتوجيهها إلى الفضاء تحت الجلد مع التأكد من بقاء الإبرة بأكملها تحت الجلد وعدم اختراقها. اضبط الملقط لتثبيت الجلد حول قاعدة الإبرة. استغني ببطء عن أقل من 50 ميكرولتر من تعليق الخلية وتأكد من تكوين انتفاخ صغير تحت الجلد في موقع الحقن.استمر في حقن ما يصل إلى 200 ميكرولتر من تعليق الخلية تحت الجلد. ثم أمسك الملقط في مكانه وحافظ على الإبرة موازية لجسم الماوس ، اسحب الإبرة. بمجرد إزالة الإبرة ، أغلق الجلد بالملقط لبضع ثوان لمنع الخلايا من التسرب من جرح البزل.بعد عملية الزرع ، انقل كل فأر إلى قفص جديد واسمح للحيوان بالتعافي تماما من التخدير قبل إضافة فئران إضافية إلى القفص. عند وضع الفأر الرحيم على ظهره ، استخدم المقص الجراحي لعمل شق عمودي بطول بوصتين تقريبا في الجلد. قطع فتح الجانب الأيمن من الماوس وتحديد موقع الطحال الأحمر مشرق.قطع الطحال بلطف بعيدا عن البنكرياس الوردي ونقله إلى طبق بتري معقم 10 سم يحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم. يهرس الطحال مع الجزء العلوي المسطح من مكبس حقنة معقمة. ضع مصفاة 40 أو 70 ميكرون على أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وقم بتزويدها بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.نقل تعليق الطحال إلى مصفاة وهرسها بلطف. اغسل الطبق ب 10 ملليلتر من PBS وانقل الغسيل إلى المصفاة. استمر في الهرس حتى لا يبقى لون أحمر على المصفاة.ثم قم بتدوير الأنبوب بسرعة 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة شفط قبل تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من محلول تحلل ACK الذي تم تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة لأداء تحلل خلايا الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. قم بإخماد التفاعل بخمسة ملليلتر من وسائط الخلية NIT-1 لكل خمسة ملليلتر من محلول التحلل ومرر تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر من خلال مصفاة جديدة لإزالة الكتل. أدر الأنبوب عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 ملليلتر من PBS قبل عد الخلايا. بعد العد ، قم بتدوير الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في برنامج تلفزيوني معقم في أنبوب تفاعل قفل آمن سعة 1.5 ملليلتر.إما أن تحقن على الفور أو تخزن الخلايا على الثلج لمدة أقصاها ساعة واحدة. قم بتسخين جسم الفئران NOD SCID المتلقية البالغة باستخدام مصباح حراري لمدة خمس إلى 10 دقائق لتوسيع الأوردة وعاء. أعد تعليق محلول الخلايا الطحالية قبل كل حقنة.لكل ماوس ، ارسم 100 ميكرولتر من تعليق الطحال المسخن مسبقا في المحقنة ، وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. بعد ذلك ، ضع الماوس في جهاز ضبط النفس قبل التقاط ذيله باليد غير المهيمنة. حدد موقع أحد أوردة الذيل الجانبية.قم بتدوير الذيل برفق إذا لزم الأمر. امسح الذيل بمناديل تطهير تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل. باستخدام اليد المهيمنة ، أدخل الإبرة بزاوية حادة في المنطقة الوسطى من الذيل.مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى ، حرك الإبرة بضعة ملليمترات عبر الجلد. ثم اضغط برفق على المحقنة لحقن تعليق الطحال. لا تسمح للإبرة بالتحرك أكثر للداخل أو للخارج عند الحقن.لا تؤدي الحقن الناجحة إلى ضغط الظهر أثناء الحقن ويشار إليها بتدفق الدم الشفاف أو الأبيض مباشرة بعد الحقن. بعد الحقن ، حرر الإبرة برفق من الوريد واضغط ضغطا خفيفا على الذيل بمسح التطهير حتى يتوقف النزيف. حرر الماوس من جهاز ضبط النفس وانقله برفق إلى قفص معد حديثا.قبل التصوير بخمس دقائق على الأقل ، قم بحقن الماوس داخل الصفاق بالجرعة المناسبة من محلول D-luciferin باستخدام حقنة واحدة ملليلتر وإبرة قياس 26. بعد تسجيل الدخول إلى برنامج التصوير ، في لوحة التحكم ، حدد تهيئة. للحفظ التلقائي لبيانات التصوير ، انقر فوق اكتساب متبوعا بالحفظ التلقائي إلى وإنشاء المجلدات المناسبة في الكمبيوتر.بمجرد انتهاء تهيئة الجهاز ، اضبط وقت التعرض على دقيقة واحدة. ضع الماوس على أداة التصوير في وضع الانبطاح مع بسط أطرافه وتوجيه رأسه إلى مخروط الأنف. قم بتسطيح الماوس برفق عن طريق الضغط على منتصف ظهره بكلتا يديه ثم نشر اليدين للخارج وبعيدا عن بعضهما البعض.ثم في برنامج التصوير ، حدد الحصول على أي تفاصيل ذات صلة بالتجربة وتسجيلها في النافذة المنبثقة. في اثنين من الفئران الثلاثة التي تمت دراستها ، تم تدمير طعم التحكم بحلول اليوم 18 كما يتضح من فقدان إشارات التوهج الحيوي المعنية. ومع ذلك ، في الفأر الآخر ، تم تدمير الكسب غير المشروع الطافر بينما نجا طعم التحكم ، مما يسلط الضوء على التباين البيولوجي بين الحيوانات.تم تحديد إشارة التوهج الحيوي وتم الإبلاغ عن بقاء الكسب غير المشروع كنسبة مئوية لإشارة التوهج الحيوي المتبقية مقارنة بالإشارة في النقطة الزمنية الأولى. تم استخدام نسبة إشارات الإنارة من الكسب غير المشروع الطافر إلى طعم التحكم لكل فأر لتصور الاختلاف بين الحيوانات. قبل نقل المرض ، قد تتكاثر الخلايا المزروعة مما يؤدي إلى توسيع الطعوم المرئية من خلال الجلد.عند التصوير ، أظهرت هذه الطعوم إشارات مضيئة بيولوجيا مشبعة لا يمكن قياسها بدقة. يمكن عزل الطعوم في نقاط زمنية مختلفة لتوصيف الخلايا المناعية المتسللة عن طريق ، على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي للتحقيق في آليات هجوم المناعة الذاتية وحماية الكسب غير المشروع.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

وظيفية التصوير الشحوم البنية في الفئران مع micro-PET/CT FDG

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

قياس الوقت البقاء على قيد الحياة في<em&gt; Brachionus</em&gt; الروتيفيرا: التزامن من شروط صحة الأم

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

نموذج مورين من جرح حرق أعيد بناؤها مع الكسب غير المشروع الجلد الجيني

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...