Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Vi takker Dr. Erica P. Cai og Dr. Yuki Ishikawa for at udvikle metoden beskrevet i denne protokol (se ref. 11). Forskning i S.K. og P.Y.'s laboratorier støttes af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute og Beatson Foundation. T.S. blev støttet af et postdoc-stipendium fra National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), og K.B. blev delvist støttet af et stipendium fra Mary K. Iacocca Foundation.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> Figur 1: Arbejdsprocessen for transplantation og billeddannelse af transplantater i en adoptiv overførselsmodel af diabetes hos mus. NIT-1-celler, der udtrykker ildfluetransgenet luciferase (luc2), transplanteres subkutant i NOD-scidmus. Musene injiceres samtidigt med autoreaktive splenocytter isoleret fra en spontant diabetisk NOD-mus. Tr...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

T1D er en ødelæggende sygdom, som der i øjeblikket ikke findes nogen kur mod. Betacellesubstitutionsterapi tilbyder en lovende behandling for patienter med denne sygdom, men den kritiske barriere for denne strategi er potentialet for tilbagevendende autoimmune angreb mod de transplanterede betaceller. Gensplejsning af SC-beta-celler for at reducere deres immunsynlighed eller modtagelighed er en potentiel løsning på dette problem. Beskrevet her er en protokol for ikke-invasivt billeddannelse transplanterede betacelle...

Type 1-diabetes (T1D) er forårsaget af autoimmun ødelæggelse af de insulinproducerende betaceller i bugspytkirtlen. Tabet af betacellemasse resulterer i insulinmangel og hyperglykæmi. T1D-patienter er afhængige af flere daglige injektioner af eksogent insulin og oplever episoder med alvorlig hyperglykæmi og hypoglykæmi gennem hele deres liv. Komplikationerne relateret til disse episoder omfatter diabetisk retinopati, nedsat nyrefunktion og neuropati1.
Insulininjektioner er en behandling, men ikke en kur mod T1D. Udskiftning af den tabte betacellemasse har imidlertid potentiale til at vende sygdommen ved at gøre det muligt for patienter at producere deres eget insulin. Udbuddet af kadaveriske donorøer er dog begrænset2. Stamcelleafledte øer (SC-øer) kan give en næsten ubegrænset forsyning af betaceller til transplantation. Flere grupper har vist, at humane embryonale stamceller (ESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) kan differentieres for at generere funktionelle beta-lignende celler 3,4,5. Lovende tidlige kliniske forsøgsdata indikerer, at disse celler bevarer deres funktion efter transplantation og kan gøre det muligt for patienter at blive insulinuafhængige6. Kronisk immunsuppression er imidlertid påkrævet, hvilket øger deres modtagelighed for kræft og infektion. Derudover kan immunsuppressive midler være cytotoksiske for transplantater på lang sigt7. For at eliminere behovet for immunsuppression kan SC-øer genetisk modificeres for at beskytte dem mod tilbagevendende autoimmunitet samt alloimmunitet efter transplantation.
Stamcelleforskning er meget krævende i omkostninger og arbejdskraft. Musecellelinjer og dyremodeller er nyttige værktøjer til indledende identifikation og eksperimentel validering af strategier til beskyttelse af transplanterede celler mod autoimmunitet. NOD-musen udvikler spontan autoimmun diabetes med mange ligheder med human T1D8, og NIT-1-insulinomcellelinjen deler en genetisk baggrund med denne musestamme9. Diabetes kan adoptivt overføres til den relaterede immundeficiente NOD-scid musestamme via injektion af diabetiske splenocytter fra NOD-mus for midlertidigt at synkronisere begyndelsen af diabetes i replikate eksperimentelle mus10. Denne model kan bruges til at identificere genetiske mål relativt hurtigt og billigt til yderligere validering i SC-holme. For nylig blev metoden anvendt til at identificere og validere RNLS, et mål, der viste sig at beskytte primære humane øer mod autoimmunitet in vivo og iPSC-afledte øer fra betacellestress in vitro11. Beskrevet her er en ligetil protokol til transplantation af genetisk manipulerede NIT-1-celler og ikke-invasivt overvåge deres overlevelse i en adoptiv overførselsmodel af autoimmun diabetes hos mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

Type 1-diabetes er karakteriseret ved autoimmun ødelæggelse af de insulinproducerende betaceller i bugspytkirtlen. En lovende behandling for denne sygdom er transplantation af stamcelleafledte betaceller. Genetiske modifikationer kan dog være nødvendige for at beskytte de transplanterede celler mod vedvarende autoimmunitet. Diabetiske musemodeller er et nyttigt værktøj til foreløbig evaluering af strategier til beskyttelse af transplanterede celler mod autoimmune angreb. Her beskrives en minimalt invasiv metode til transplantation og billeddannelse af celletransplantater i en adoptiv overførselsmodel af diabetes hos mus. I denne protokol transplanteres celler fra den murin pancreas beta-cellelinje NIT-1, der udtrykker ildfluen luciferase transgen luc2 , subkutant i immunodeficiente ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -alvorlige kombinerede immundeficiente (scid) mus. Disse mus injiceres samtidigt intravenøst med splenocytter fra spontant diabetiske NOD-mus for at overføre autoimmunitet. Transplantaterne afbildes med jævne mellemrum via ikke-invasiv bioluminescerende billeddannelse for at overvåge cellens overlevelse. Overlevelsen af mutante celler sammenlignes med overlevelsen af kontrolceller transplanteret i den samme mus.

En oversigt over protokollen er skitseret i figur 1. Overlevelsen af to cellelinjer, såsom en mutant og en ikke-målrettet kontrol, kan sammenlignes, eller overlevelsen af en cellelinje kan måles i flere grupper af mus, såsom lægemiddelbehandlede mus versus køretøjsbehandlede kontroller. Figur 3A viser tre 8 uger gamle kvindelige NOD-scid mus transplanteret med en ikke-målrettet kontrol (venstre) og en mutant (højre) cellelinje. Musene blev også injicer...

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Denne protokol beskriver en ligetil og minimalt invasiv metode til transplantation og billeddannelse af NIT-1-celler i ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -alvorlige kombinerede immundeficiente mus udfordret med splenocytter oprenset fra spontant diabetiske NOD-mus.

Bioluminescerende overvågning af transplantatoverlevelse i en adoptiv overførselsmodel af autoimmun diabetes hos mus

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Denne protokol kan hjælpe med at forstå mekanismerne til beskyttelse mod autoimmune angreb og identificere terapeutiske mål for betacelleudskiftning i type et-diabetes. Den største fordel ved denne teknik er den relativt lave pris, enkelheden af cellekulturen, transplantations- og billeddannelsesmetoderne samt minimal invasivitet af museteknikkerne. Personer, der aldrig har udført en haleveneinjektion før, kan kæmpe for at indsætte nålen i venen.Bed om en demonstration af en ekspert før din første injektion. Til at begynde med skal du tage den bedøvede mus og fjerne hår fra sin dorsale side ved hjælp af en elektrisk barbermaskine med en vagt, der udsætter cirka en tomme med to inches af huden. Sæt den barberede mus tilbage i knockdown-kammeret.Før transplantationen overføres en mus ad gangen fra kammeret til en ren overflade udstyret med en isofluran næsekegle og forsigtigt føres musens hoved ind i næsekeglen. Tør det barberede område af med en isopropylalkoholpude for at fjerne løse hår og desinficere huden. Træk derefter mere end 300 mikroliter cellesuspension i en en milliliter steril sprøjte udstyret med en 26 gauge nål.Fjern eventuelle bobler fra sprøjten, og behold 300 mikroliter cellesuspension, mens du skubber det overskydende ud. Brug en buet tang i den ikke-dominerende hånd til forsigtigt at løfte huden på den ene side af musens ryg for at give lettere adgang til det subkutane rum. Brug derefter den dominerende hånd til at placere sprøjten parallelt med de koronale og sagittale sletter i musens krop.Med nålen rettet mod musens hoved indsættes den i huden nær bagfjerdingen og føres ind i det subkutane rum, samtidig med at det sikres, at hele nålen forbliver under huden og ikke stikker igennem. Juster pincetten, så den holder huden omkring kanylens bund. Dispenser langsomt mindre end 50 mikroliter af cellesuspensionen og bekræft dannelsen af en lille bule under huden på injektionsstedet.Fortsæt med at injicere op til 200 mikroliter af cellesuspensionen subkutant. Hold derefter pincetten på plads og hold nålen parallelt med musens krop, træk nålen ud. Når nålen er fjernet, skal du holde huden lukket med tang i et par sekunder for at forhindre, at cellerne lækker ud af punkteringssåret.Efter transplantationen overføres hver mus til et frisk bur og lader dyret komme sig helt efter anæstesi, før du tilføjer yderligere mus til buret. Placer den aflivede mus på ryggen, brug kirurgisk saks til at lave et cirka to inches langt lodret snit i huden. Skær højre side af musen op, og find den knaldrøde milt.Skær forsigtigt milten væk fra den lyserøde bugspytkirtel og overfør den til en steril 10 centimeter petriskål indeholdende fem ml steril PBS. Mos milten med den flade top af et sterilt sprøjtestempel. Placer en 40 eller 70 mikron sil på et 50 ml konisk rør og prime det med fem ml PBS.Overfør miltophænget til silen og mos det forsigtigt. Vask fadet med 10 ml PBS og overfør vasken til silen. Fortsæt med at mose, indtil der ikke er nogen rød farve tilbage på silen.Derefter drejes røret med en hastighed på 500 G i fem minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes med en aspirerende pipette, inden cellepelleten resuspenderes i fem ml ACK-lysisbuffer, der er forvarmet til stuetemperatur, for at udføre lysis af de røde blodlegemer ved stuetemperatur i fire minutter. Sluk reaktionen med fem ml NIT-1-cellemedier pr. Fem ml lysisbuffer, og før cellesuspensionen ind i et 50 ml centrifugerør gennem en frisk sil for at fjerne klumper. Drej røret ved 500 G i fem minutter ved stuetemperatur.Derefter resuspenderes cellepillen i 20 ml PBS, inden cellerne tælles. Efter tælling drejes cellerne ned ved 500 G i fem minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellepelleten i steril PBS i et 1,5 ml safe-lock reaktionsrør.Injicer enten straks eller opbevar cellerne på is i højst en time. Opvarm kroppen af den voksne modtager NOD SCID-mus ved hjælp af en varmelampe i fem til 10 minutter for at vasodilere venerne. Splenocytopløsningen resuspenderes før hver injektion.For hver mus trækkes 100 mikroliter af den forvarmede splenocytsuspension i sprøjten, og sørg for, at der ikke er luftbobler til stede. Placer derefter musen i fastholdelsesanordningen, før du fanger halen med den ikke-dominerende hånd. Find en af de to laterale haleårer.Drej forsigtigt halen, hvis det er nødvendigt. Tør halen af med en desinfektionsserviet, der indeholder 70% isopropylalkohol. Brug den dominerende hånd til at indsætte nålen i en spids vinkel i det centrale område af halen.Med nålens skråning opad skubbes nålen et par millimeter gennem huden. Tryk derefter let på sprøjten for at injicere splenocytsuspensionen. Lad ikke nålen bevæge sig længere ind eller ud, når du injicerer.Vellykkede injektioner giver ikke anledning til modtryk under injektionen og indikeres ved gennemsigtig eller hvid blodgennemstrømning umiddelbart efter injektionen. Efter injektion slippes nålen forsigtigt ud af venen og påføres let tryk på halen med en desinfektionsserviet, indtil blødningen stopper. Frigør musen fra fastholdelsesanordningen og overfør den forsigtigt til et frisklavet bur.Mindst fem minutter før billeddannelse injiceres musen intraperitonealt med den passende dosis af D-luciferinopløsning ved hjælp af en milliliter sprøjte og en 26 gauge nål. Når du er logget ind på billedbehandlingssoftwaren, skal du vælge initialiser i kontrolpanelet. For automatisk at gemme billeddataene skal du klikke på erhvervelse efterfulgt af autosave til og oprette de relevante mapper på computeren.Når instrumentet er færdig med initialisering, skal du indstille eksponeringstiden til et minut. Placer musen på billeddannelsesinstrumentet i en udsat position med lemmerne spredt og før hovedet ind i næsekeglen. Flad musen forsigtigt ved at trykke på midten af ryggen med begge hænder og derefter sprede hænderne udad og fra hinanden.Vælg derefter i billedbehandlingssoftwaren erhverve og registrere alle relevante detaljer om eksperimentet i pop op-vinduet. I to ud af de tre undersøgte mus blev kontroltransplantatet ødelagt på dag 18, hvilket fremgår af tabet af de respektive bioluminescerende signaler. I den anden mus blev det mutante transplantat imidlertid ødelagt, mens kontroltransplantatet overlevede, hvilket fremhævede den biologiske variation mellem dyr.Det bioluminescerende signal blev kvantificeret, og transplantatoverlevelse blev rapporteret som procentdelen af det resterende bioluminescerende signal sammenlignet med signalet på det første tidspunkt. Forholdet mellem selvlysende signaler fra mutanttransplantatet til kontroltransplantatet for hver mus blev brugt til at visualisere variationen mellem dyr. Før sygdomsoverførsel kan de transplanterede celler replikere, hvilket resulterer i udvidede transplantater, der er synlige gennem huden.Ved billeddannelse viste disse transplantater mættede bioluminescerende signaler, som ikke kunne kvantificeres nøjagtigt. Transplantater kan isoleres på forskellige tidspunkter til karakterisering af de infiltrerende immunceller ved for eksempel flowcytometri for at undersøge mekanismerne for autoimmunangreb og transplantatbeskyttelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Funktionel Imaging af brunt fedt i mus med FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent pattedvrceller for vedvarende og Real-time overvågning af cytotoksicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Måling af overlevelse Tid i<em&gt; Brachionus</em&gt; Hjuldyr: Synkronisering af Maternal betingelser

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

En Murine Model af en Burn Sår rekonstrueret med en allogeneic hudtransplantation

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...