Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Nous remercions le Dr Erica P. Cai et le Dr Yuki Ishikawa d’avoir développé la méthode décrite dans ce protocole (voir réf. 11). La recherche dans les laboratoires de S.K. et de P.Y. est financée par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), de FRDJ, du Harvard Stem Cell Institute et de la Fondation Beatson. T.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) (T32 DK007260-45), et K.B. a été soutenu en partie par une bourse de la Fondation Mary K. Iacocca.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> Figure 1 : Le flux de travail pour la transplantation et l’imagerie des greffes dans un modèle de transfert adoptif du diabète chez la souris. Les cellules NIT-1 exprimant la luciférase transgénique luciférase (luc2) sont transplantées par voie sous-cutanée chez des souris NOD-scid. Les souris reçoivent simultanément des injectio...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

Le DT1 est une maladie dévastatrice pour laquelle il n’existe actuellement aucun remède. La thérapie de remplacement des cellules bêta offre un traitement prometteur pour les patients atteints de cette maladie, mais l’obstacle critique à cette stratégie est le potentiel d’attaque auto-immune récurrente contre les cellules bêta transplantées. Le génie génétique des cellules SC-bêta pour réduire leur visibilité immunitaire ou leur susceptibilité est une solution potentielle à ce problème. Décrit ic...

Le diabète de type 1 (DT1) est causé par la destruction auto-immune des cellules bêta productrices d’insuline du pancréas. La perte de masse des cellules bêta entraîne une carence en insuline et une hyperglycémie. Les patients atteints de DT1 dépendent de multiples injections quotidiennes d’insuline exogène et connaissent des épisodes d’hyperglycémie et d’hypoglycémie sévères tout au long de leur vie. Les complications liées à ces épisodes comprennent la rétinopathie diabétique, la diminution de la fonction rénale et la neuropathie1.
Les injections d’insuline sont un traitement, mais pas un remède contre le DT1. Le remplacement de la masse cellulaire bêta perdue, cependant, a le potentiel d’inverser la maladie en permettant aux patients de produire leur propre insuline. Cependant, l’offre d’îlots donneurs cadavériques est limitée2. Les îlots dérivés de cellules souches (îlots SC) peuvent fournir un approvisionnement pratiquement illimité de cellules bêta pour la transplantation. Plusieurs groupes ont démontré que les cellules souches embryonnaires humaines (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent être différenciées pour générer des cellules fonctionnelles de type bêta 3,4,5. Des données prometteuses d’essais cliniques préliminaires indiquent que ces cellules conservent leur fonction après la greffe et peuvent permettre aux patients de devenir insulino-indépendants6. Une immunosuppression chronique est toutefois nécessaire, augmentant ainsi leur susceptibilité au cancer et à l’infection. De plus, les agents immunosuppresseurs peuvent être cytotoxiques pour les greffons à long terme7. Pour éliminer le besoin d’immunosuppression, les îlots SC peuvent être génétiquement modifiés pour les protéger de l’auto-immunité récurrente ainsi que de l’allo-immunité après la transplantation.
La recherche sur les cellules souches est très exigeante en termes de coûts et de main-d’œuvre. Les lignées cellulaires de souris et les modèles animaux sont des outils utiles pour l’identification initiale et la validation expérimentale de stratégies visant à protéger les cellules transplantées contre l’auto-immunité. La souris NOD développe un diabète auto-immun spontané avec de nombreuses similitudes avec le DT18 humain, et la lignée cellulaire d’insulinome NIT-1 partage un fond génétique avec cette souchede souris 9. Le diabète peut être transféré de manière adoptive à la souche de souris NOD-scid immunodéficiente apparentée par injection de splénocytes diabétiques de souris NOD afin de synchroniser temporellement l’apparition du diabète chez des souris expérimentales répliquées10. Ce modèle peut être utilisé pour identifier des cibles génétiques relativement rapidement et à peu de frais pour une validation ultérieure dans les îlots SC. Récemment, la méthode a été appliquée pour identifier et valider RNLS, une cible qui a été trouvée pour protéger les îlots humains primaires de l’auto-immunité in vivo et les îlots dérivés de l’iPSC du stress des cellules bêta in vitro11. Décrit ici est un protocole simple pour transplanter des cellules NIT-1 génétiquement modifiées et surveiller de manière non invasive leur survie dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

Le diabète de type 1 est caractérisé par la destruction auto-immune des cellules bêta productrices d’insuline du pancréas. Un traitement prometteur pour cette maladie est la transplantation de cellules bêta dérivées de cellules souches. Des modifications génétiques, cependant, peuvent être nécessaires pour protéger les cellules transplantées de l’auto-immunité persistante. Les modèles murins diabétiques sont un outil utile pour l’évaluation préliminaire des stratégies visant à protéger les cellules transplantées contre les attaques auto-immunes. Décrit ici est une méthode mini-invasive pour la transplantation et l’imagerie des greffes cellulaires dans un modèle de transfert adoptif du diabète chez la souris. Dans ce protocole, les cellules de la lignée cellulaire bêta pancréatique murine NIT-1 exprimant le transgène luciférase luciférase luc2 sont transplantées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéficientes non obèses diabétiques (NOD) immunodéficientes combinées sévères (SCID). Ces souris sont injectées simultanément par voie intraveineuse avec des splénocytes de souris NOD spontanément diabétiques pour transférer l’auto-immunité. Les greffons sont imagés à intervalles réguliers via une imagerie bioluminescente non invasive pour surveiller la survie cellulaire. La survie des cellules mutantes est comparée à celle des cellules témoins transplantées dans la même souris.

La figure 1 donne un aperçu du protocole. La survie de deux lignées cellulaires, comme un mutant et un témoin non ciblé, peut être comparée, ou la survie d’une lignée cellulaire peut être mesurée dans plusieurs groupes de souris, comme les souris traitées par un médicament par rapport aux témoins traités par véhicule. La figure 3A montre trois souris NOD-scid femelles âgées de 8 semaines transplantées avec un témoin non ciblé (à gauche) et ...

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Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Ce protocole décrit une méthode simple et peu invasive pour la transplantation et l’imagerie de cellules NIT-1 chez des souris immunodéficientes combinées diabétiques sévères non obèses (NOD) défiées avec des splénocytes purifiés à partir de souris NOD spontanément diabétiques.

Surveillance bioluminescente de la survie du greffon dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Ce protocole peut aider à comprendre les mécanismes de protection contre les attaques auto-immunes et à identifier des cibles thérapeutiques pour le remplacement des cellules bêta dans le diabète de type un. Le principal avantage de cette technique est le coût relativement faible, la simplicité des méthodes de culture cellulaire, de transplantation et d’imagerie, ainsi que le caractère invasif minimal des techniques de souris. Les personnes qui n’ont jamais effectué d’injection veineuse de la queue auparavant peuvent avoir du mal à insérer l’aiguille dans la veine.Demandez une démonstration par un expert avant votre première injection. Pour commencer, prenez la souris anesthésiée et retirez les poils de sa face dorsale à l’aide d’un rasoir électrique avec un garde, exposant environ un pouce sur deux pouces de la peau. Remettez la souris rasée dans la chambre de retournement.Avant la greffe, transférez une souris à la fois de la chambre à une surface propre équipée d’un cône nasal d’isoflurane et guidez doucement la tête de la souris dans le cône nasal. Essuyez la zone rasée avec un tampon de préparation à l’alcool isopropylique pour enlever les poils lâches et désinfecter la peau. Ensuite, aspirez plus de 300 microlitres de suspension cellulaire dans une seringue stérile d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26.Retirez les bulles de la seringue et retenez 300 microlitres de suspension cellulaire tout en expulsant l’excès. À l’aide d’une paire de pinces incurvées tenues dans la main non dominante, soulevez doucement la peau d’un côté du dos de la souris pour permettre un accès plus facile à l’espace sous-cutané. Ensuite, à l’aide de la main dominante, placez la seringue parallèlement aux plaines coronales et sagittales du corps de la souris.Avec l’aiguille pointée vers la tête de la souris, insérez-la dans la peau près des quartiers postérieurs et guidez-la dans l’espace sous-cutané tout en vous assurant que l’aiguille entière reste sous la peau et ne perce pas. Ajustez les forceps pour maintenir la peau autour de la base de l’aiguille. Distribuez lentement moins de 50 microlitres de la suspension cellulaire et confirmez la formation d’un petit renflement sous la peau au site de l’injection.Continuez à injecter jusqu’à 200 microlitres de suspension cellulaire par voie sous-cutanée. Ensuite, en tenant la pince en place et en gardant l’aiguille parallèle au corps de la souris, retirez l’aiguille. Une fois l’aiguille retirée, maintenez la peau fermée avec une pince pendant quelques secondes pour empêcher les cellules de s’échapper de la plaie perforante.Après la greffe, transférez chaque souris dans une nouvelle cage et permettez à l’animal de se remettre complètement de l’anesthésie avant d’ajouter des souris supplémentaires à la cage. En plaçant la souris euthanasiée sur son dos, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision verticale d’environ deux pouces de long dans la peau. Coupez le côté droit de la souris et localisez la rate rouge vif.Coupez doucement la rate loin du pancréas rose et transférez-la dans une boîte de Petri stérile de 10 centimètres contenant cinq millilitres de PBS stérile. Écraser la rate avec le dessus plat d’un piston de seringue stérile. Placez une passoire de 40 ou 70 microns sur un tube conique de 50 millilitres et amorcez-la avec cinq millilitres de PBS.Transférer la suspension de rate dans la passoire et l’écraser doucement. Lavez le plat avec 10 millilitres de PBS et transférez le lavage dans la passoire. Poursuivre l’écrasage jusqu’à ce qu’il ne reste plus de couleur rouge sur la passoire.Faites ensuite tourner le tube à une vitesse de 500 G pendant cinq minutes à température ambiante et retirez le surnageant avec une pipette d’aspiration avant de remettre en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de tampon de lyse ACK préchauffé à température ambiante pour effectuer la lyse des globules rouges à température ambiante pendant quatre minutes. Éteignez la réaction avec cinq millilitres de milieu cellulaire NIT-1 par cinq millilitres de tampon de lyse et passez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 50 millilitres à travers une crépine fraîche pour éliminer les touffes. Faire tourner le tube à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 20 millilitres de PBS avant de compter les cellules. Après le comptage, faites tourner les cellules à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans du PBS stérile dans un tube de réaction à verrouillage sécuritaire de 1,5 millilitre.Injectez immédiatement ou stockez les cellules sur de la glace pendant un maximum d’une heure. Réchauffez le corps des souris NOD SCID adultes en utilisant une lampe chauffante pendant cinq à 10 minutes pour vasodiler les veines. Remettez en suspension la solution splénocytaire avant chaque injection.Pour chaque souris, aspirez 100 microlitres de la suspension de splénocytes préchauffée dans la seringue, assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente. Ensuite, placez la souris dans le dispositif de retenue avant de capturer sa queue avec la main non dominante. Localisez l’une des deux veines latérales de la queue.Faites tourner doucement la queue si nécessaire. Essuyez la queue avec une lingette désinfectante contenant 70% d’alcool isopropylique. À l’aide de la main dominante, insérez l’aiguille à un angle aigu dans la région centrale de la queue.Avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, faites glisser l’aiguille de quelques millimètres à travers la peau. Appliquez ensuite une légère pression sur la seringue pour injecter la suspension splénocytes. Ne laissez pas l’aiguille entrer ou sortir plus loin lors de l’injection.Les injections réussies ne donnent pas lieu à une contre-pression pendant l’injection et sont indiquées par un flux sanguin transparent ou blanc immédiatement après l’injection. Après l’injection, relâchez doucement l’aiguille hors de la veine et appliquez une légère pression sur la queue avec une lingette désinfectante jusqu’à ce que le saignement cesse. Libérez la souris du dispositif de retenue et transférez-la doucement dans une cage fraîchement préparée.Au moins cinq minutes avant l’imagerie, injecter à la souris par voie intrapéritonéale la dose appropriée de solution de D-luciférine à l’aide d’une seringue d’un millilitre et d’une aiguille de calibre 26. Après vous être connecté au logiciel de création d’images, dans le panneau de configuration, sélectionnez Initialiser. Pour enregistrer automatiquement les données d’imagerie, cliquez sur acquisition suivi de l’enregistrement automatique et créez les dossiers appropriés dans l’ordinateur.Une fois l’initialisation de l’instrument terminée, réglez le temps d’exposition sur une minute. Placez la souris sur l’instrument d’imagerie en position couchée avec ses membres écartés et guidez sa tête dans le cône de nez. Aplatissez doucement la souris en appuyant sur le centre de son dos avec les deux mains, puis en écartant les mains vers l’extérieur et à l’écart.Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez acquérir et enregistrer tous les détails pertinents de l’expérience dans la fenêtre contextuelle. Chez deux des trois souris étudiées, le greffon témoin a été détruit au jour 18, comme en témoigne la perte des signaux bioluminescents respectifs. Chez l’autre souris, cependant, la greffe mutante a été détruite tandis que la greffe témoin a survécu, mettant en évidence la variation biologique entre les animaux.Le signal bioluminescent a été quantifié et la survie du greffon a été rapportée comme le pourcentage du signal bioluminescent résiduel par rapport au signal au premier point temporel. Le rapport des signaux luminescents de la greffe mutante à la greffe témoin pour chaque souris a été utilisé pour visualiser la variation entre les animaux. Avant le transfert de la maladie, les cellules transplantées peuvent se répliquer, ce qui entraîne des greffons élargis visibles à travers la peau.À l’imagerie, ces greffons présentaient des signaux bioluminescents saturés qui ne pouvaient pas être quantifiés avec précision. Les greffons peuvent être isolés à différents moments pour caractériser les cellules immunitaires infiltrantes, par exemple par cytométrie en flux pour étudier les mécanismes d’attaque auto-immune et de protection des greffons.

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