Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
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Wir danken Dr. Erica P. Cai und Dr. Yuki Ishikawa für die Entwicklung der in diesem Protokoll beschriebenen Methode (siehe Ref. 11). Die Forschung in den Labors von S.K. und P.Y. wird durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, des Harvard Stem Cell Institute und der Beatson Foundation unterstützt. T.S. wurde durch ein Postdoc-Stipendium des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45) unterstützt, und K.B. wurde teilweise durch ein Stipendium der Mary K. Iacocca Foundation unterstützt.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> Abbildung 1: Der Arbeitsablauf für die Transplantation und Bildgebung von Transplantaten in einem adoptiven Transfermodell von Diabetes bei Mäusen. NIT-1-Zellen, die das Glühwürmchen-Transgen Luciferase (luc2) exprimieren, werden subkutan in NOD-scid-Mäuse transplantiert. Den Mäusen werden gleichzeitig autoreaktive Splenozyten injizie...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

T1D ist eine verheerende Krankheit, für die es derzeit keine Heilung gibt. Die Betazellersatztherapie bietet eine vielversprechende Behandlung für Patienten mit dieser Krankheit, aber das entscheidende Hindernis für diese Strategie ist das Potenzial für wiederkehrende Autoimmunangriffe gegen die transplantierten Betazellen. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist die gentechnische Veränderung von SC-beta-Zellen, um deren Immunsichtbarkeit oder -anfälligkeit zu verringern. Hier wird ein Protokoll für die nic...

Typ-1-Diabetes (T1D) wird durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht. Der Verlust von Betazellmasse führt zu Insulinmangel und Hyperglykämie. T1D-Patienten sind auf mehrere tägliche Injektionen von exogenem Insulin angewiesen und leiden im Laufe ihres Lebens unter Episoden schwerer Hyperglykämie und Hypoglykämie. Zu den Komplikationen, die mit diesen Episoden verbunden sind, gehören diabetische Retinopathie, verminderte Nierenfunktion und Neuropathie1.
Insulininjektionen sind eine Behandlung, aber keine Heilung für T1D. Der Ersatz der verlorenen Betazellmasse hat jedoch das Potenzial, die Krankheit rückgängig zu machen, indem die Patienten in die Lage versetzt werden, ihr eigenes Insulin zu produzieren. Das Angebot an Leichenspenderinseln ist jedoch begrenzt2. Aus Stammzellen gewonnene Inseln (SC-Inselchen) können einen praktisch unbegrenzten Vorrat an Betazellen für die Transplantation bieten. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass humane embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) differenziert werden können, um funktionelle beta-ähnliche Zellen zu erzeugen 3,4,5. Vielversprechende frühe klinische Studiendaten deuten darauf hin, dass diese Zellen ihre Funktion nach der Transplantation beibehalten und es den Patienten ermöglichen könnten, insulinunabhängig zu werden6. Es ist jedoch eine chronische Immunsuppression erforderlich, die ihre Anfälligkeit für Krebs und Infektionen erhöht. Darüber hinaus können Immunsuppressiva langfristig zytotoxisch für Transplantate sein7. Um die Notwendigkeit einer Immunsuppression zu eliminieren, können SC-Inseln genetisch verändert werden, um sie vor rezidivierender Autoimmunität sowie Alloimmunität nach der Transplantation zu schützen.
Die Stammzellforschung ist sehr kosten- und arbeitsintensiv. Mauszelllinien und Tiermodelle sind nützliche Werkzeuge für die erste Identifizierung und experimentelle Validierung von Strategien zum Schutz transplantierter Zellen vor Autoimmunität. Die NOD-Maus entwickelt einen spontanen Autoimmundiabetes mit vielen Ähnlichkeiten zu humanem T1D8, und die NIT-1-Insulinom-Zelllinie teilt einen genetischen Hintergrund mit diesem Mausstamm9. Diabetes kann durch die Injektion von diabetischen Milzzellen aus NOD-Mäusen adoptativ auf den verwandten immundefizienten NOD-scid-Mausstamm übertragen werden, um den Ausbruch des Diabetes in replizierten Versuchsmäusen zeitlich zu synchronisieren10. Mit diesem Modell lassen sich relativ schnell und kostengünstig genetische Zielstrukturen für die weitere Validierung in SC-Inseln identifizieren. Kürzlich wurde die Methode zur Identifizierung und Validierung von RNLS angewendet, einem Ziel, das primäre menschliche Inseln in vivo vor Autoimmunität und aus iPS-Zellen gewonnene Inseln vor Betazellstress in vitroschützt 11. Hier wird ein einfaches Protokoll beschrieben, um gentechnisch veränderte NIT-1-Zellen zu transplantieren und ihr Überleben nicht-invasiv in einem adoptiven Transfermodell für Autoimmundiabetes bei Mäusen zu überwachen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

Typ-1-Diabetes ist gekennzeichnet durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse. Eine vielversprechende Behandlung für diese Krankheit ist die Transplantation von Betazellen aus Stammzellen. Genetische Veränderungen können jedoch notwendig sein, um die transplantierten Zellen vor anhaltender Autoimmunität zu schützen. Diabetische Mausmodelle sind ein nützliches Werkzeug für die vorläufige Evaluierung von Strategien zum Schutz transplantierter Zellen vor Autoimmunangriffen. Hier wird ein minimalinvasives Verfahren zur Transplantation und Bildgebung von Zelltransplantaten in einem adoptiven Transfermodell von Diabetes in Mäusen beschrieben. In diesem Protokoll werden Zellen aus der murinen Pankreas-Betazelllinie NIT-1, die das Glühwürmchen-Luciferase-Transgen luc2 exprimieren, subkutan in immundefizige, nicht-adipöse diabetische (NOD)-schwere kombinierte immundefiziente (scid) Mäuse transplantiert. Diesen Mäusen werden gleichzeitig Splenozyten von spontandiabetischen NOD-Mäusen intravenös injiziert, um Autoimmunität zu übertragen. Die Transplantate werden in regelmäßigen Abständen mittels nicht-invasiver biolumineszenter Bildgebung abgebildet, um das Überleben der Zellen zu überwachen. Das Überleben von mutierten Zellen wird mit dem von Kontrollzellen verglichen, die in dieselbe Maus transplantiert wurden.

Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Überleben zweier Zelllinien, wie z.B. einer mutierten und einer nicht-zielgerichteten Kontrolle, kann verglichen werden, oder das Überleben einer Zelllinie kann in mehreren Gruppen von Mäusen gemessen werden, wie z. B. medikamentös behandelte Mäuse im Vergleich zu mit Vehikeln behandelten Kontrollen. Abbildung 3A zeigt drei 8 Wochen alte weibliche NOD-scid-Mäuse, die mit einer nicht-zi...

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Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.

Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Dieses Protokoll kann helfen, die Mechanismen des Schutzes vor Autoimmunangriffen zu verstehen und therapeutische Ziele für den Betazellersatz bei Typ-1-Diabetes zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik sind die relativ geringen Kosten, die Einfachheit der Zellkultur-, Transplantations- und Bildgebungsmethoden sowie die minimale Invasivität der Maustechniken. Personen, die noch nie eine Schwanzveneninjektion durchgeführt haben, können Schwierigkeiten haben, die Nadel in die Vene einzuführen.Lassen Sie sich vor der ersten Injektion von einem Experten vorführen. Nehmen Sie zunächst die betäubte Maus und entfernen Sie Haare von ihrer Rückenseite mit einem Elektrorasierer mit einem Schutz, wobei Sie etwa einen Zoll mal zwei Zoll der Haut freilegen. Lege die rasierte Maus in die Knockdown-Kammer zurück.Übertragen Sie vor der Transplantation jeweils eine Maus aus der Kammer auf eine saubere Oberfläche, die mit einem Isofluran-Nasenkegel ausgestattet ist, und führen Sie den Kopf der Maus vorsichtig in den Nasenkegel. Wischen Sie die rasierte Stelle mit einem Isopropylalkohol-Vorbereitungspad ab, um lose Haare zu entfernen und die Haut zu desinfizieren. Ziehen Sie als Nächstes mehr als 300 Mikroliter Zellsuspension in eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist.Entfernen Sie alle Blasen aus der Spritze und bewahren Sie 300 Mikroliter Zellsuspension auf, während Sie den Überschuss herausdrücken. Heben Sie mit einer gebogenen Pinzette, die in der nicht-dominanten Hand gehalten wird, die Haut auf einer Seite des Mausrückens sanft an, um einen leichteren Zugang zum Unterhautraum zu ermöglichen. Positionieren Sie dann die Spritze mit der dominanten Hand parallel zu den koronalen und sagittalen Ebenen des Mauskörpers.Führen Sie die Nadel in Richtung des Kopfes der Maus in die Haut in der Nähe der Hinterhand ein und führen Sie sie in den Unterhautraum, wobei Sie darauf achten, dass die gesamte Nadel unter der Haut bleibt und nicht durchsticht. Stellen Sie die Pinzette so ein, dass die Haut um die Nadelbasis herum gehalten wird. Geben Sie langsam weniger als 50 Mikroliter der Zellsuspension ab und bestätigen Sie die Bildung einer kleinen Ausbuchtung unter der Haut an der Injektionsstelle.Injizieren Sie weiterhin bis zu 200 Mikroliter der Zellsuspension subkutan. Halten Sie dann die Pinzette an Ort und Stelle und halten Sie die Nadel parallel zum Körper der Maus und ziehen Sie die Nadel zurück. Sobald die Nadel entfernt ist, halten Sie die Haut einige Sekunden lang mit einer Pinzette geschlossen, um zu verhindern, dass die Zellen aus der Stichwunde austreten.Nach der Transplantation wird jede Maus in einen neuen Käfig gebracht und das Tier kann sich vollständig von der Narkose erholen, bevor weitere Mäuse in den Käfig gesetzt werden. Legen Sie die eingeschläferte Maus auf den Rücken und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen etwa zwei Zentimeter langen vertikalen Schnitt in die Haut. Schneiden Sie die rechte Seite der Maus auf und suchen Sie die leuchtend rote Milz.Schneiden Sie die Milz vorsichtig von der rosa Bauchspeicheldrüse ab und legen Sie sie in eine sterile 10-Zentimeter-Petrischale mit fünf Millilitern sterilem PBS. Zerdrücken Sie die Milz mit der flachen Oberseite eines sterilen Spritzenkolbens. Stellen Sie ein 40- oder 70-Mikron-Sieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie es mit fünf Millilitern PBS.Die Milzsuspension in das Sieb geben und vorsichtig zerdrücken. Waschen Sie die Schüssel mit 10 Milliliter PBS und geben Sie die Wäsche in das Sieb. Weiter pürieren, bis keine rote Farbe mehr auf dem Sieb verbleibt.Dann drehen Sie das Röhrchen mit einer Geschwindigkeit von 500 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Aspirationspipette, bevor Sie das Zellpellet in fünf Millilitern auf Raumtemperatur vorgewärmtem ACK-Lysepuffer resuspendieren, um die Lyse der roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur vier Minuten lang durchzuführen. Beenden Sie die Reaktion mit fünf Millilitern NIT-1-Zellmedien pro fünf Milliliter Lysepuffer und geben Sie die Zellsuspension durch ein frisches Sieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um Klumpen zu entfernen. Drehen Sie das Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 Millilitern PBS, bevor Sie die Zellen zählen. Nach dem Zählen drehen Sie die Zellen bei 500 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur herunter. Resuspendieren Sie das Zellpellet in sterilem PBS in einem 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Reaktionsgefäß.Entweder sofort injizieren oder die Zellen maximal eine Stunde auf Eis lagern. Erwärmen Sie den Körper der erwachsenen NOD-SCID-Mäuse mit einer Wärmelampe für fünf bis 10 Minuten, um die Venen zu erweitern. Resuspendieren Sie die Splenozytenlösung vor jeder Injektion.Ziehen Sie für jede Maus 100 Mikroliter der vorgewärmten Splenozytensuspension in die Spritze und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Setzen Sie als Nächstes die Maus in die Rückhaltevorrichtung ein, bevor Sie ihren Schwanz mit der nicht dominanten Hand erfassen. Lokalisieren Sie eine der beiden seitlichen Schweifadern.Drehen Sie den Schwanz bei Bedarf vorsichtig. Wischen Sie den Schwanz mit einem Desinfektionstuch ab, das 70%igen Isopropylalkohol enthält. Führen Sie die Nadel mit der dominanten Hand in einem spitzen Winkel in den mittleren Bereich des Schwanzes ein.Schieben Sie die Nadel mit der Abschrägung der Nadel nach oben einige Millimeter durch die Haut. Üben Sie dann sanften Druck auf die Spritze aus, um die Splenozytensuspension zu injizieren. Achten Sie darauf, dass sich die Nadel beim Injizieren nicht weiter nach innen oder außen bewegt.Erfolgreiche Injektionen verursachen keinen Gegendruck während der Injektion und werden durch einen transparenten oder weißen Blutfluss unmittelbar nach der Injektion angezeigt. Lösen Sie nach der Injektion die Nadel vorsichtig aus der Vene und üben Sie mit einem Desinfektionstuch leichten Druck auf den Schwanz aus, bis die Blutung aufhört. Lösen Sie die Maus von der Rückhaltevorrichtung und setzen Sie sie vorsichtig in einen frisch vorbereiteten Käfig um.Mindestens fünf Minuten vor der Bildgebung wird der Maus mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 26-Gauge-Nadel die entsprechende Dosierung der D-Luciferin-Lösung intraperitoneal injiziert. Nachdem Sie sich bei der Imaging-Software angemeldet haben, wählen Sie in der Systemsteuerung die Option Initialisieren. Um die Bilddaten automatisch zu speichern, klicken Sie auf Erfassung, gefolgt von automatischem Speichern unter, und erstellen Sie die entsprechenden Ordner auf dem Computer.Sobald das Gerät mit der Initialisierung fertig ist, stellen Sie die Belichtungszeit auf eine Minute ein. Legen Sie die Maus in Bauchlage mit gespreizten Gliedmaßen auf das Bildgebungsinstrument und führen Sie den Kopf in den Nasenkegel. Glätten Sie die Maus vorsichtig, indem Sie mit beiden Händen auf die Mitte ihres Rückens drücken und dann die Hände nach außen und auseinander spreizen.Wählen Sie dann in der Bildgebungssoftware im Popup-Fenster die Option Erfassung und Aufzeichnung aller relevanten Details des Experiments. Bei zwei der drei untersuchten Mäuse war das Kontrolltransplantat an Tag 18 zerstört, was sich am Verlust der jeweiligen Biolumineszenzsignale zeigte. Bei der anderen Maus wurde das mutierte Transplantat jedoch zerstört, während das Kontrolltransplantat überlebte, was die biologische Variation zwischen den Tieren verdeutlicht.Das biolumineszente Signal wurde quantifiziert und das Transplantatüberleben wurde als Prozentsatz des verbleibenden biolumineszenten Signals im Vergleich zum Signal zum ersten Zeitpunkt angegeben. Das Verhältnis der Lumineszenzsignale vom mutierten Transplantat zum Kontrolltransplantat für jede Maus wurde verwendet, um die Variation zwischen den Tieren zu visualisieren. Vor der Übertragung der Krankheit können sich die transplantierten Zellen vermehren, was zu ausgedehnten Transplantaten führt, die durch die Haut sichtbar sind.Bei der Bildgebung zeigten diese Transplantate gesättigte biolumineszente Signale, die nicht genau quantifiziert werden konnten. Transplantate können zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert werden, um die infiltrierenden Immunzellen zu charakterisieren, z. B. durch Durchflusszytometrie, um die Mechanismen des Autoimmunangriffs und des Transplantatschutzes zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

Forschung

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Die Messung der Überlebensdauer in<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotifers: Synchronisation von Maternal Bedingungen

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...