Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
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हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि विकसित करने के लिए डॉ एरिका पी काई और डॉ युकी इशिकावा को धन्यवाद देते हैं (रेफरी 11 देखें)। एस.के. और पी.वाई. की प्रयोगशालाओं में अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर01डीके120445, पी30डीके036836), जेडीआरएफ, हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट और बीट्सन फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। टी.एस. को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) (टी 32 डीके007260-45) से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और केबी को मैरी के. इयाकोका फाउंडेशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> चित्रा 1: चूहों में मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में रोपाई और इमेजिंग ग्राफ्ट के लिए वर्कफ़्लो। जुगनू ट्रांसजीन लूसिफेरस (ल्यूक 2</em...

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	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

टी 1 डी एक विनाशकारी बीमारी है जिसके लिए वर्तमान में कोई इलाज मौजूद नहीं है। बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी इस बीमारी वाले रोगियों के लिए एक आशाजनक उपचार प्रदान करती है, लेकिन इस रणनीति के लिए महत्वपूर्ण ब...

टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) अग्न्याशय के इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश के कारण होता है। बीटा सेल द्रव्यमान के नुकसान के परिणामस्वरूप इंसुलिन की कमी और हाइपरग्लेसेमिया होता है। टी 1 डी रोगी बहिर्जात इंसुलिन के कई दैनिक इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं और अपने पूरे जीवन में गंभीर हाइपरग्लेसेमिया और हाइपोग्लाइसीमिया के एपिसोड का अनुभव करते हैं। इन एपिसोड से संबंधित जटिलताओं में मधुमेह रेटिनोपैथी, गुर्दे के कार्य में कमी और न्यूरोपैथी1 शामिल हैं।
इंसुलिन इंजेक्शन एक उपचार है लेकिन टी 1 डी के लिए इलाज नहीं है। खोए हुए बीटा सेल द्रव्यमान को प्रतिस्थापित करना, हालांकि, रोगियों को अपने स्वयं के इंसुलिन का उत्पादन करने में सक्षम बनाकर बीमारी को उलटने की क्षमता है। हालांकि, कैडवेरिक दाता आइलेट्स की आपूर्ति सीमित है। स्टेम सेल-व्युत्पन्न आइलेट्स (एससी-आइलेट्स) प्रत्यारोपण के लिए बीटा कोशिकाओं की लगभग असीमित आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं। कई समूहों ने प्रदर्शित किया है कि मानव भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को कार्यात्मक बीटा जैसी कोशिकाओं 3,4,5 उत्पन्न करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। प्रारंभिक नैदानिक परीक्षण डेटा का वादा करने से संकेत मिलता है कि ये कोशिकाएं प्रत्यारोपण के बाद अपना कार्य बनाए रखती हैं और रोगियों को इंसुलिन-स्वतंत्र बनने में सक्षम कर सकतीहैं। क्रोनिक इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता होती है, हालांकि, इस प्रकार कैंसर और संक्रमण के लिए उनकी संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इसके अलावा, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंट लंबी अवधि में ग्राफ्ट के लिए साइटोटोक्सिक हो सकतेहैं। इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता को खत्म करने के लिए, एससी-आइलेट्स को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि उन्हें आवर्तक ऑटोइम्यूनिटी के साथ-साथ प्रत्यारोपण के बाद एलोइम्यूनिटी से बचाया जा सके।
स्टेम सेल अनुसंधान लागत और श्रम में अत्यधिक मांग है। माउस सेल लाइनें और पशु मॉडल ऑटोइम्यूनिटी से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए रणनीतियों की प्रारंभिक पहचान और प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। एनओडी माउस मानव टी 1 डी8 के लिए कई समानताओं के साथ सहज ऑटोइम्यून मधुमेह विकसित करता है, और एनआईटी -1 इंसुलिनोमा सेल लाइन इस माउस स्ट्रेन 9 के साथ एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि साझा करतीहै। प्रयोगात्मक चूहों 10 में मधुमेह की शुरुआत को अस्थायी रूप से सिंक्रनाइज़ करने के लिए एनओडी चूहों से मधुमेह स्प्लेनोसाइट्स के इंजेक्शन के माध्यम से मधुमेह को संबंधित इम्यूनोडेफिशिएंट एनओडी-स्सिड माउस स्ट्रेन में स्थानांतरितकिया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग एससी-आइलेट्स में आगे के सत्यापन के लिए अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ते में आनुवंशिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। हाल ही में, इस विधि को आरएनएलएस की पहचान और मान्य करने के लिए लागू किया गया था, एक लक्ष्य जो विवो में ऑटोइम्यूनिटी से प्राथमिक मानव आइलेट्स की रक्षा करने और विट्रो11 में बीटा सेल तनाव से आईपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट्स की रक्षा के लिए पाया गया था। यहां वर्णित आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एनआईटी -1 कोशिकाओं को प्रत्यारोपण करने और चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में उनके अस्तित्व की गैर-आक्रामक रूप से निगरानी करने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

टाइप 1 मधुमेह अग्न्याशय के इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश की विशेषता है। इस बीमारी के लिए एक आशाजनक उपचार स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण है। आनुवंशिक संशोधन, हालांकि, प्रत्यारोपित कोशिकाओं को लगातार ऑटोइम्यूनिटी से बचाने के लिए आवश्यक हो सकते हैं। डायबिटिक माउस मॉडल ऑटोइम्यून हमले से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए रणनीतियों के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। यहां वर्णित चूहों में मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में प्रत्यारोपण और इमेजिंग सेल ग्राफ्ट के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि है। इस प्रोटोकॉल में, जुगनू लूसिफेरस ट्रांसजीन ल्यूक 2 को व्यक्त करने वाली मुराइन अग्नाशयी बीटा सेल लाइन एनआईटी -1 से कोशिकाओं को इम्यूनोडेफिशिएंसी गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) -गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (स्सिड) चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है। इन चूहों को एक साथ ऑटोइम्यूनिटी को स्थानांतरित करने के लिए अनायास मधुमेह नोड चूहों से स्प्लेनोसाइट्स के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। सेल के अस्तित्व की निगरानी के लिए गैर-इनवेसिव बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के माध्यम से ग्राफ्ट को नियमित अंतराल पर चित्रित किया जाता है। उत्परिवर्ती कोशिकाओं के अस्तित्व की तुलना एक ही माउस में प्रत्यारोपित नियंत्रण कोशिकाओं से की जाती है।

प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में उल्लिखित है। दो सेल लाइनों के अस्तित्व, जैसे कि एक उत्परिवर्ती और एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण, की तुलना की जा सकती है, या एक सेल लाइन के अस्तित्व को चूहों के कई ?...

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Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

यह प्रोटोकॉल गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) में एनआईटी -1 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और इमेजिंग के लिए एक सरल और न्यूनतम इनवेसिव विधि का वर्णन करता है - गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों को स्प्लेनोसाइट्स के साथ चुनौती दी जाती है।

चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक स्थानांतरण मॉडल में ग्राफ्ट सर्वाइवल की बायोल्यूमिनेसेंट निगरानी

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

यह प्रोटोकॉल ऑटोइम्यून हमलों के खिलाफ सुरक्षा के तंत्र को समझने और टाइप 1 मधुमेह में बीटा सेल प्रतिस्थापन के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने में मदद कर सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ अपेक्षाकृत कम लागत, सेल संस्कृति, प्रत्यारोपण और इमेजिंग विधियों की सादगी, साथ ही माउस तकनीकों की न्यूनतम आक्रामकता है। जिन व्यक्तियों ने पहले कभी पूंछ नस इंजेक्शन नहीं किया है, वे नस में सुई डालने के लिए संघर्ष कर सकते हैं।अपने पहले इंजेक्शन से पहले एक विशेषज्ञ द्वारा प्रदर्शन के लिए पूछें। शुरू करने के लिए, एनेस्थेटाइज्ड माउस लें और गार्ड के साथ इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके इसके पृष्ठीय पक्ष से बालों को हटा दें, त्वचा के लगभग एक इंच से दो इंच को उजागर करें। मुंडा माउस को वध कक्ष में वापस करें।प्रत्यारोपण से पहले, कक्ष से एक समय में एक माउस को आइसोफ्लुरेन नाक शंकु से सुसज्जित एक साफ सतह पर स्थानांतरित करें और धीरे से माउस के सिर को नाक शंकु में निर्देशित करें। ढीले बालों को हटाने और त्वचा को कीटाणुरहित करने के लिए एक आइसोप्रोपिल अल्कोहल प्रेप पैड के साथ मुंडा क्षेत्र को पोंछें। इसके बाद, 26 गेज सुई से सुसज्जित एक मिलीलीटर बाँझ सिरिंज में सेल निलंबन के 300 से अधिक माइक्रोलीटर खींचें।सिरिंज से किसी भी बुलबुले को हटा दें और अतिरिक्त को बाहर धकेलते हुए सेल निलंबन के 300 माइक्रोलीटर को बनाए रखें। गैर-प्रमुख हाथ में पकड़े गए घुमावदार बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, धीरे से माउस की पीठ के एक तरफ की त्वचा को उठाएं ताकि चमड़े के नीचे के स्थान तक आसान पहुंच हो सके। फिर प्रमुख हाथ का उपयोग करके, सिरिंज को माउस के शरीर के कोरोनल और मैदानों के समानांतर रखें।सुई को माउस के सिर की ओर इंगित करने के साथ, इसे पिछले क्वार्टर के पास की त्वचा में डालें और इसे चमड़े के नीचे की जगह में मार्गदर्शन करें, जबकि यह सुनिश्चित करें कि पूरी सुई त्वचा के नीचे रहती है और अंदर से नहीं गुजरती है। सुई के आधार के आसपास की त्वचा को पकड़ने के लिए बल को समायोजित करें। धीरे-धीरे सेल निलंबन के 50 से कम माइक्रोलीटर वितरित करें और इंजेक्शन की साइट पर त्वचा के नीचे एक छोटे उभार के गठन की पुष्टि करें।चमड़े के नीचे सेल निलंबन के 200 माइक्रोलीटर तक इंजेक्ट करना जारी रखें। फिर बल को जगह पर पकड़ना और सुई को माउस के शरीर के समानांतर रखना, सुई को वापस ले लें। एक बार सुई हटा दिए जाने के बाद, त्वचा को कुछ सेकंड के लिए बल के साथ बंद रखें ताकि कोशिकाओं को पंचर घाव से बाहर निकलने से रोका जा सके।प्रत्यारोपण के बाद, प्रत्येक माउस को एक ताजा पिंजरे में स्थानांतरित करें और पिंजरे में अतिरिक्त चूहों को जोड़ने से पहले जानवर को संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक होने की अनुमति दें। इच्छामृत्यु वाले माउस को अपनी पीठ पर रखते हुए, त्वचा में लगभग दो इंच लंबा ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। माउस के दाईं ओर काटें और उज्ज्वल लाल तिल्ली का पता लगाएं।धीरे से प्लीहा को गुलाबी अग्न्याशय से दूर काट लें और इसे बाँझ 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें पांच मिलीलीटर बाँझ पीबीएस होता है। एक बाँझ सिरिंज प्लंजर के सपाट शीर्ष के साथ तिल्ली को मैश करें। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर 40 या 70 माइक्रोन स्ट्रेनर रखें और इसे पांच मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्राइम करें।प्लीहा निलंबन को छन्नी में स्थानांतरित करें और इसे धीरे से मैश करें। पकवान को 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोएं और धोने को छन्नी में स्थानांतरित करें। जब तक छन्नी पर कोई लाल रंग न रह जाए तब तक मैश करना जारी रखें।फिर कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए ट्यूब को 500 जी की गति से घुमाएं और चार मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस करने के लिए कमरे के तापमान पर पूर्व-गर्म किए गए एसीके बफर में सेल पेलेट को पुन: उत्पन्न करने से पहले एक एस्पिरेटिंग पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें। प्रति पांच मिलीलीटर लाइसिस बफर में पांच मिलीलीटर एनआईटी -1 सेल मीडिया के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं और झुरमुट को हटाने के लिए एक ताजा छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पारित करें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए ट्यूब को 500 ग्राम पर घुमाएं।इसके बाद, कोशिकाओं की गिनती से पहले 20 मिलीलीटर पीबीएस में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। गिनती के बाद, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 500 जी पर कोशिकाओं को घुमाएं। 1.5 मिलीलीटर सुरक्षित-लॉक प्रतिक्रिया ट्यूब में बाँझ पीबीएस में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।या तो तुरंत इंजेक्ट करें या कोशिकाओं को अधिकतम एक घंटे के लिए बर्फ पर स्टोर करें। नसों को वासोडिलेट करने के लिए पांच से 10 मिनट के लिए हीट लैंप का उपयोग करके वयस्क प्राप्तकर्ता एनओडी एससीआईडी चूहों के शरीर को गर्म करें। प्रत्येक इंजेक्शन से पहले स्प्लेनोसाइट समाधान को पुन: निलंबित करें।प्रत्येक माउस के लिए, सिरिंज में पूर्व-गर्म स्प्लेनोसाइट निलंबन के 100 माइक्रोलीटर खींचें, सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं। इसके बाद, माउस को गैर-प्रमुख हाथ से अपनी पूंछ को पकड़ने से पहले संयम उपकरण में रखें। दो पार्श्व पूंछ नसों में से एक का पता लगाएं।यदि आवश्यक हो तो धीरे से पूंछ को घुमाएं। 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल युक्त कीटाणुशोधन पोंछे के साथ पूंछ को पोंछें। प्रमुख हाथ का उपयोग करके, सुई को पूंछ के मध्य क्षेत्र में एक तीव्र कोण पर डालें।सुई के झुकाव के साथ, सुई को त्वचा के माध्यम से कुछ मिलीमीटर स्लाइड करें। फिर स्प्लेनोसाइट निलंबन को इंजेक्ट करने के लिए सिरिंज पर कोमल दबाव लागू करें। इंजेक्शन लगाते समय सुई को आगे या बाहर न बढ़ने दें।सफल इंजेक्शन इंजेक्शन के दौरान पीठ के दबाव को जन्म नहीं देते हैं और इंजेक्शन के तुरंत बाद पारदर्शी या सफेद रक्त प्रवाह द्वारा इंगित किए जाते हैं। इंजेक्शन के बाद, धीरे से सुई को नस से बाहर छोड़ें और कीटाणुशोधन पोंछे के साथ पूंछ पर हल्का दबाव लागू करें जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए। संयम उपकरण से माउस छोड़ें और धीरे से इसे ताजा तैयार पिंजरे में स्थानांतरित करें।इमेजिंग से कम से कम पांच मिनट पहले, माउस को एक मिलीलीटर सिरिंज और 26 गेज सुई का उपयोग करके डी-लूसिफेरिन समाधान की उचित खुराक के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में लॉग इन करने के बाद, नियंत्रण कक्ष में, प्रारंभ करें का चयन करें। इमेजिंग डेटा को ऑटोसेव करने के लिए, अधिग्रहण पर क्लिक करें और उसके बाद कंप्यूटर में उपयुक्त फ़ोल्डर्स बनाएं।एक बार उपकरण शुरू करने के बाद, एक्सपोजर समय को एक मिनट तक सेट करें। इमेजिंग उपकरण पर माउस को एक प्रवण स्थिति में रखें, जिसके अंगों को हिलाया जाए और इसके सिर को नाक शंकु में निर्देशित किया जाए। माउस को धीरे से उसकी पीठ के केंद्र को दोनों हाथों से दबाकर और फिर हाथों को बाहर और अलग फैलाकर समतल करें।फिर इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, पॉपअप विंडो में प्रयोग के किसी भी प्रासंगिक विवरण का चयन करें और रिकॉर्ड करें। अध्ययन किए गए तीन चूहों में से दो में, नियंत्रण ग्राफ्ट 18 वें दिन तक नष्ट हो गया था जैसा कि संबंधित बायोल्यूमिनेसेंट संकेतों के नुकसान से स्पष्ट है। दूसरे माउस में, हालांकि, उत्परिवर्ती ग्राफ्ट नष्ट हो गया था, जबकि नियंत्रण ग्राफ्ट बच गया, जो जानवरों के बीच जैविक भिन्नता को उजागर करता है।बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल की मात्रा निर्धारित की गई थी और ग्राफ्ट उत्तरजीविता को पहली बार सिग्नल की तुलना में अवशिष्ट बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट किया गया था। प्रत्येक माउस के लिए उत्परिवर्ती ग्राफ्ट से नियंत्रण ग्राफ्ट तक ल्यूमिनेसेंट संकेतों के अनुपात का उपयोग जानवरों के बीच भिन्नता की कल्पना करने के लिए किया गया था। रोग हस्तांतरण से पहले, प्रत्यारोपित कोशिकाएं प्रतिकृति कर सकती हैं जिसके परिणामस्वरूप त्वचा के माध्यम से विस्तारित ग्राफ्ट दिखाई देते हैं।इमेजिंग पर, इन ग्राफ्ट ने संतृप्त बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल प्रदर्शित किए जिन्हें सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सका। ग्राफ्ट को घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर अलग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ऑटोम्यून्यून हमले और ग्राफ्ट संरक्षण के तंत्र की जांच के लिए फ्लो साइटोमेट्री।

Research

JoVE Journal

Biology

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