Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Ringraziamo la Dott.ssa Erica P. Cai e la Dott.ssa Yuki Ishikawa per aver sviluppato il metodo descritto in questo protocollo (vedi rif. 11). La ricerca nei laboratori di SK e P.Y. è supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute e Beatson Foundation. T.S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), e K.B. è stato supportato in parte da una borsa di studio della Mary K. Iacocca Foundation.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> Figura 1: Il flusso di lavoro per il trapianto e l'imaging degli innesti in un modello di trasferimento adottivo del diabete nei topi. Le cellule NIT-1 che esprimono il transgene luciferasi della lucciola (luc2) vengono trapiantate per via sottocutanea in topi NOD-scid. I topi vengono iniettati simultaneamente con splenociti autoreattivi is...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

Il T1D è una malattia devastante per la quale attualmente non esiste una cura. La terapia sostitutiva delle cellule beta offre un trattamento promettente per i pazienti con questa malattia, ma la barriera critica a questa strategia è il potenziale di attacchi autoimmuni ricorrenti contro le cellule beta trapiantate. L'ingegneria genetica delle cellule SC-beta per ridurre la loro visibilità o suscettibilità immunitaria è una potenziale soluzione a questo problema. Descritto qui è un protocollo per l'imaging non inva...

Il diabete di tipo 1 (T1D) è causato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta produttrici di insulina del pancreas. La perdita di massa delle cellule beta provoca carenza di insulina e iperglicemia. I pazienti T1D si affidano a più iniezioni giornaliere di insulina esogena e sperimentano episodi di grave iperglicemia e ipoglicemia per tutta la vita. Le complicanze correlate a questi episodi includono retinopatia diabetica, diminuzione della funzionalità renale e neuropatia1.
Le iniezioni di insulina sono un trattamento ma non una cura per il T1D. La sostituzione della massa delle cellule beta persa, tuttavia, ha il potenziale per invertire la malattia consentendo ai pazienti di produrre la propria insulina. Tuttavia, la fornitura di isole donatrici cadaveriche è limitata2. Le isole derivate dalle cellule staminali (isole SC) possono fornire una fornitura virtualmente illimitata di cellule beta per il trapianto. Diversi gruppi hanno dimostrato che le cellule staminali embrionali umane (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere differenziate per generare cellule beta-simili funzionali 3,4,5. I promettenti dati dei primi studi clinici indicano che queste cellule mantengono la loro funzione dopo il trapianto e possono consentire ai pazienti di diventare insulino-indipendenti6. L'immunosoppressione cronica è necessaria, tuttavia, aumentando così la loro suscettibilità al cancro e alle infezioni. Inoltre, gli agenti immunosoppressori possono essere citotossici per gli innesti a lungo termine7. Per eliminare la necessità di immunosoppressione, le isole SC possono essere geneticamente modificate per proteggerle dall'autoimmunità ricorrente e dall'alloimmunità dopo il trapianto.
La ricerca sulle cellule staminali è molto impegnativa in termini di costi e manodopera. Le linee cellulari di topo e i modelli animali sono strumenti utili per l'identificazione iniziale e la validazione sperimentale di strategie per proteggere le cellule trapiantate dall'autoimmunità. Il topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo con molte somiglianze con ilT1D 8 umano e la linea cellulare di insulinoma NIT-1 condivide un background genetico con questo ceppo di topo9. Il diabete può essere trasferito in modo adottivo al ceppo murino NOD-scid immunodeficiente correlato tramite l'iniezione di splenociti diabetici da topi NOD al fine di sincronizzare temporalmente l'insorgenza del diabete in topi sperimentali replicati10. Questo modello può essere utilizzato per identificare bersagli genetici in modo relativamente rapido ed economico per un'ulteriore convalida nelle isole SC. Recentemente, il metodo è stato applicato per identificare e convalidare RNLS, un bersaglio che è stato trovato per proteggere le isole umane primarie dall'autoimmunità in vivo e le isole derivate da iPSC dallo stress delle cellule beta in vitro11. Descritto qui è un semplice protocollo per trapiantare cellule NIT-1 geneticamente modificate e monitorare in modo non invasivo la loro sopravvivenza in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

Il diabete di tipo 1 è caratterizzato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta produttrici di insulina del pancreas. Un trattamento promettente per questa malattia è il trapianto di cellule beta derivate da cellule staminali. Le modificazioni genetiche, tuttavia, possono essere necessarie per proteggere le cellule trapiantate dall'autoimmunità persistente. I modelli murini diabetici sono uno strumento utile per la valutazione preliminare delle strategie per proteggere le cellule trapiantate dall'attacco autoimmune. Descritto qui è un metodo minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging di innesti cellulari in un modello di trasferimento adottivo del diabete nei topi. In questo protocollo, le cellule della linea cellulare beta pancreatica murina NIT-1 che esprime il transgene luciferasi luc2 della lucciola vengono trapiantate per via sottocutanea in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD)-gravi immunodeficienti combinati (SCID). Questi topi vengono iniettati simultaneamente per via endovenosa con splenociti da topi NOD spontaneamente diabetici per trasferire l'autoimmunità. Gli innesti vengono ripresi a intervalli regolari tramite imaging bioluminescente non invasivo per monitorare la sopravvivenza cellulare. La sopravvivenza delle cellule mutanti è paragonata a quella delle cellule di controllo trapiantate nello stesso topo.

Una panoramica del protocollo è descritta nella Figura 1. La sopravvivenza di due linee cellulari, come un mutante e un controllo non mirato, può essere confrontata, o la sopravvivenza di una linea cellulare può essere misurata in più gruppi di topi, come topi trattati con farmaci rispetto a controlli trattati con veicolo. La Figura 3A mostra tre topi NOD-scid femmina di 8 settimane trapiantati con un controllo non mirato (a sinistra) e una linea cellulare m...

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Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Questo protocollo descrive un metodo semplice e minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging delle cellule NIT-1 in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD) gravi sfidati con splenociti purificati da topi NOD spontaneamente diabetici.

Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Questo protocollo può aiutare a comprendere i meccanismi di protezione contro gli attacchi autoimmuni e identificare bersagli terapeutici per la sostituzione delle cellule beta nel diabete di tipo uno. Il vantaggio principale di questa tecnica è il costo relativamente basso, la semplicità della coltura cellulare, del trapianto e dei metodi di imaging, nonché la minima invasività delle tecniche del topo. Gli individui che non hanno mai eseguito un'iniezione di vena della coda prima possono avere difficoltà a inserire l'ago nella vena.Chiedere una dimostrazione da parte di un esperto prima della prima iniezione. Per iniziare, prendi il topo anestetizzato e rimuovi i peli dal suo lato dorsale usando un rasoio elettrico con una guardia, esponendo circa un pollice per due pollici della pelle. Riportare il topo rasato nella camera di abbattimento.Prima del trapianto, trasferire un topo alla volta dalla camera a una superficie pulita dotata di un cono nasale isoflurano e guidare delicatamente la testa del topo nel cono del naso. Pulire l'area rasata con un tampone di preparazione all'alcool isopropilico per rimuovere i peli sciolti e disinfettare la pelle. Quindi, aspirare più di 300 microlitri di sospensione cellulare in una siringa sterile da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge.Rimuovere eventuali bolle dalla siringa e trattenere 300 microlitri di sospensione cellulare mentre si spinge fuori l'eccesso. Utilizzando un paio di pinze curve tenute nella mano non dominante, sollevare delicatamente la pelle su un lato della schiena del topo per consentire un accesso più facile allo spazio sottocutaneo. Quindi, usando la mano dominante, posizionare la siringa parallelamente alle pianure coronali e sagittali del corpo del topo.Con l'ago puntato verso la testa del topo, inserirlo nella pelle vicino ai quarti posteriori e guidarlo nello spazio sottocutaneo assicurandosi che l'intero ago rimanga sotto la pelle e non penetri. Regolare la pinza per tenere la pelle intorno alla base dell'ago. Erogare lentamente meno di 50 microlitri della sospensione cellulare e confermare la formazione di un piccolo rigonfiamento sotto la pelle nel sito dell'iniezione.Continuare a iniettare fino a 200 microlitri di sospensione cellulare per via sottocutanea. Quindi, tenendo la pinza in posizione e mantenendo l'ago parallelo al corpo del topo, ritirare l'ago. Una volta rimosso l'ago, tenere la pelle chiusa con una pinza per alcuni secondi per evitare che le cellule fuoriescano dalla ferita da puntura.Dopo il trapianto, trasferire ogni topo in una gabbia fresca e consentire all'animale di riprendersi completamente dall'anestesia prima di aggiungere altri topi alla gabbia. Posizionando il topo eutanasia sulla schiena, utilizzare le forbici chirurgiche per fare un'incisione verticale lunga circa due pollici nella pelle. Tagliare il lato destro del mouse e individuare la milza rosso vivo.Tagliare delicatamente la milza dal pancreas rosa e trasferirla in una piastra di Petri sterile di 10 centimetri contenente cinque millilitri di PBS sterile. Schiacciare la milza con la parte superiore piatta di uno stantuffo sterile della siringa. Posizionare un filtro da 40 o 70 micron su un tubo conico da 50 millilitri e adescarlo con cinque millilitri di PBS.Trasferire la sospensione di milza nel colino e schiacciarla delicatamente. Lavare il piatto con 10 millilitri di PBS e trasferire il lavaggio sul colino. Continuare ad ammassare fino a quando non rimane alcun colore rosso sul colino.Quindi ruotare il tubo ad una velocità di 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta aspirante prima di risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di lisi ACK preriscaldato a temperatura ambiente per eseguire la lisi dei globuli rossi a temperatura ambiente per quattro minuti. Spegnere la reazione con cinque millilitri di mezzi cellulari NIT-1 per cinque millilitri di tampone di lisi e passare la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 50 millilitri attraverso un filtro fresco per rimuovere i grumi. Girare il tubo a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di PBS prima di contare le cellule. Dopo il conteggio, ruotare le cellule a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare in PBS sterile in un tubo di reazione safe-lock da 1,5 millilitri.Iniettare immediatamente o conservare le cellule sul ghiaccio per un massimo di un'ora. Riscaldare il corpo dei topi adulti NOD SCID riceventi utilizzando una lampada di calore per cinque o 10 minuti per vasodilatare le vene. Risospendere la soluzione di splenociti prima di ogni iniezione.Per ogni topo, aspirare 100 microlitri della sospensione di splenociti preriscaldata nella siringa, assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Quindi, posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta prima di catturarne la coda con la mano non dominante. Individuare una delle due vene laterali della coda.Ruotare delicatamente la coda se necessario. Pulire la coda con una salvietta disinfettante contenente alcol isopropilico al 70%. Usando la mano dominante, inserire l'ago ad angolo acuto nella regione centrale della coda.Con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto, far scorrere l'ago di alcuni millimetri attraverso la pelle. Quindi applicare una leggera pressione sulla siringa per iniettare la sospensione di splenociti. Non lasciare che l'ago si muova ulteriormente dentro o fuori durante l'iniezione.Le iniezioni riuscite non danno luogo a contropressione durante l'iniezione e sono indicate da un flusso sanguigno trasparente o bianco immediatamente dopo l'iniezione. Dopo l'iniezione, rilasciare delicatamente l'ago dalla vena e applicare una leggera pressione sulla coda con una salvietta disinfettante fino a quando l'emorragia si arresta. Rilasciare il mouse dal dispositivo di ritenuta e trasferirlo delicatamente in una gabbia appena preparata.Almeno cinque minuti prima dell'imaging, iniettare il topo per via intraperitoneale con il dosaggio appropriato della soluzione di D-luciferina utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da 26 gauge. Dopo aver effettuato l'accesso al software di imaging, nel pannello di controllo, selezionare inizializza. Per salvare automaticamente i dati di imaging, fare clic su acquisizione seguita da salvataggio automatico in e creare le cartelle appropriate nel computer.Una volta terminata l'inizializzazione dello strumento, impostare il tempo di esposizione su un minuto. Posizionare il mouse sullo strumento di imaging in posizione prona con gli arti divaricati e guidare la testa nel cono del naso. Appiattire delicatamente il mouse premendo il centro della schiena con entrambe le mani e quindi allargando le mani verso l'esterno e divaricate.Quindi, nel software di imaging, selezionare acquisisci e registra tutti i dettagli rilevanti dell'esperimento nella finestra popup. In due dei tre topi studiati, l'innesto di controllo è stato distrutto entro il giorno 18, come evidente dalla perdita dei rispettivi segnali bioluminescenti. Nell'altro topo, tuttavia, l'innesto mutante è stato distrutto mentre l'innesto di controllo è sopravvissuto, evidenziando la variazione biologica tra gli animali.Il segnale bioluminescente è stato quantificato e la sopravvivenza dell'innesto è stata riportata come percentuale del segnale bioluminescente residuo rispetto al segnale al primo punto temporale. Il rapporto tra i segnali luminescenti dall'innesto mutante e l'innesto di controllo per ciascun topo è stato utilizzato per visualizzare la variazione tra gli animali. Prima del trasferimento della malattia, le cellule trapiantate possono replicarsi con conseguente espansione degli innesti visibili attraverso la pelle.Al momento dell'imaging, questi innesti hanno mostrato segnali bioluminescenti saturi che non potevano essere quantificati con precisione. Gli innesti possono essere isolati in vari punti temporali per la caratterizzazione delle cellule immunitarie infiltranti, ad esempio mediante citometria a flusso per studiare i meccanismi di attacco autoimmune e protezione del trapianto.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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