Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

이 프로토콜에 설명된 방법을 개발한 Erica P. Cai 박사와 Yuki Ishikawa 박사에게 감사드립니다(참조 11 참조). S.K.와 P.Y.의 실험실에서의 연구는 미국 국립보건원(NIH)(R01DK120445, P30DK036836), JDRF, 하버드 줄기세포 연구소 및 비트슨 재단의 보조금으로 지원됩니다. T.S.는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK) (T32 DK007260-45)의 박사후 연구원의 지원을 받았으며 K.B.는 Mary K. Iacocca Foundation의 펠로우 십에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> 그림 1: 생쥐에서 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이식편을 이식하고 이미징하기 위한 워크플로. 반딧불이 이식유전자 루시페라아제(luc2)를 발현하는 NIT-1 세포를 NOD-scid 마우스에 피하 이식합니다. 마우스에는 자발적 당뇨병 NOD 마우스에서 분리된 자가반응성 ?...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

T1D는 현재 치료법이 존재하지 않는 치명적인 질병입니다. 베타 세포 대체 요법은 이 질환을 앓고 있는 환자에게 유망한 치료법을 제공하지만 이 전략의 중요한 장벽은 이식된 베타 세포에 대한 반복적인 자가면역 공격의 가능성입니다. SC-베타 세포의 면역 가시성이나 감수성을 줄이기 위한 유전 공학은 이 문제에 대한 잠재적인 해결책 중 하나입니다. 여기에 기술된 것은 마우스에서 자가면역 당...

제1형 당뇨병(T1D)은 췌장의 인슐린 생산 베타 세포의 자가면역 파괴로 인해 발생합니다. 베타 세포 질량의 손실은 인슐린 결핍과 고혈당을 초래합니다. T1D 환자는 외인성 인슐린을 매일 여러 번 주사하고 평생 동안 심각한 고혈당증 및 저혈당증 에피소드를 경험합니다. 이러한 에피소드와 관련된 합병증으로는 당뇨병성 망막병증, 신장 기능 저하, 신경병증등이 있다 1.
인슐린 주사는 T1D의 치료법이지만 치료법은 아닙니다. 그러나 손실된 베타 세포 덩어리를 대체하면 환자가 자신의 인슐린을 생산할 수 있게 하여 질병을 역전시킬 수 있습니다. 그러나 사체기증자의 공급은 제한되어 있다2. 줄기 세포 유래 췌도(SC-islets)는 이식을 위한 베타 세포의 사실상 무제한 공급을 제공할 수 있다. 몇몇 그룹은 인간 배아 줄기 세포 (ESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)가 기능적 베타 유사 세포를 생성하기 위해 분화 될 수 있음을 입증했다 3,4,5. 유망한 초기 임상 시험 데이터에 따르면 이 세포는 이식 후에도 기능을 유지하며 환자가 인슐린 의존성을 갖도록 할 수 있다6. 그러나 만성 면역 억제가 필요하므로 암과 감염에 대한 감수성이 증가합니다. 또한, 면역억제제는 장기적으로 이식편에 세포독성을 나타낼 수 있다7. 면역억제의 필요성을 없애기 위해, SC-섬은 이식 후 동종면역뿐만 아니라 재발성 자가면역으로부터 보호하기 위해 유전자 변형될 수 있다.
줄기 세포 연구는 비용과 노동력이 매우 까다롭습니다. 마우스 세포주 및 동물 모델은 이식된 세포를 자가면역으로부터 보호하기 위한 전략의 초기 식별 및 실험적 검증에 유용한 도구입니다. NOD 마우스는 인간 T1D8와 많은 유사성을 가진 자발성 자가면역 당뇨병을 앓고 있으며, NIT-1 인슐린종 세포주는 이 마우스 균주와 유전적 배경을 공유한다9. 당뇨병은 복제 실험 마우스에서 당뇨병의 발병을 시간적으로 동기화하기 위해 NOD 마우스로부터 당뇨병성 비장세포의 주입을 통해 관련 면역결핍 NOD-scid 마우스 균주에 입양적으로 전달될 수 있다10. 이 모델은 SC 섬에서 추가 검증을 위해 유전자 표적을 비교적 빠르고 저렴하게 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에, 이 방법은 생체 내 자가면역으로부터 일차 인간 섬을 보호하고 시험관 내 베타 세포 스트레스로부터 iPSC 유래 섬을 보호하는 것으로 밝혀진 표적인 RNLS를 식별하고 검증하기 위해 적용되었습니다 11. 여기에 설명된 것은 유전자 조작된 NIT-1 세포를 이식하고 마우스에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이들의 생존을 비침습적으로 모니터링하는 간단한 프로토콜입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

제 1 형 당뇨병은 췌장의 인슐린 생산 베타 세포의자가 면역 파괴를 특징으로합니다. 이 질병에 대한 유망한 치료법은 줄기 세포 유래 베타 세포의 이식입니다. 그러나 이식된 세포를 지속적인 자가면역으로부터 보호하기 위해 유전자 변형이 필요할 수 있습니다. 당뇨병 마우스 모델은 자가면역 공격으로부터 이식된 세포를 보호하기 위한 전략의 예비 평가에 유용한 도구입니다. 여기에 기술된 것은 마우스에서 당뇨병의 입양 이식 모델에서 세포 이식편을 이식하고 이미징하기 위한 최소 침습적 방법이다. 이 프로토콜에서, 반딧불이 루시페라아제 이식유전자 luc2 를 발현하는 쥐 췌장 베타 세포주 NIT-1의 세포를 면역결핍성 비비만 당뇨병(NOD)-중증 복합 면역결핍(scid) 마우스에 피하 이식합니다. 이 마우스는 자가면역을 전달하기 위해 자발적 당뇨병 NOD 마우스의 비장 세포를 동시에 정맥 주사합니다. 이식편은 세포 생존을 모니터링하기 위해 비침습적 생물발광 이미징을 통해 일정한 간격으로 이미지화됩니다. 돌연변이 세포의 생존은 동일한 마우스에 이식된 대조군 세포의 생존율과 비교됩니다.

프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 요약되어 있습니다. 2개의 세포주, 예컨대 돌연변이체 및 비표적화 대조군의 생존을 비교하거나, 하나의 세포주의 생존을 다수의 마우스 그룹, 예컨대 약물-처리된 마우스 대 비히클-처리된 대조군에서 측정할 수 있다. 도 3A 는 비표적 대조군(왼쪽)과 돌연변이(오른쪽) 세포주를 이식한 8주령의 암컷 NOD-scid 마우스 3마?...

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Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

이 프로토콜은 자발적 당뇨병 NOD 마우스에서 정제된 비장 세포로 도전받은 비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역 결핍 마우스에서 NIT-1 세포를 이식하고 이미징하기 위한 간단하고 최소 침습적인 방법을 설명합니다.

생쥐에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이식편 생존의 생물발광 모니터링

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

이 프로토콜은 자가면역 공격에 대한 보호 메커니즘을 이해하고 제1형 당뇨병에서 베타 세포 교체를 위한 치료 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 저렴한 비용, 세포 배양, 이식 및 이미징 방법의 단순성뿐만 아니라 마우스 기술의 최소 침습성입니다. 이전에 꼬리 정맥 주사를 한 번도 해본 적이 없는 사람은 바늘을 정맥에 삽입하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.첫 번째 주사 전에 전문가의 시연을 요청하십시오. 시작하려면 마취된 마우스를 잡고 가드가 있는 전기 면도기를 사용하여 등쪽에서 털을 제거하여 피부의 약 1인치 x 2인치를 노출시킵니다. 면도한 마우스를 녹다운 챔버로 되돌립니다.이식하기 전에 한 번에 한 마리의 마우스를 챔버에서 이소 플루 란 코 콘이 장착 된 깨끗한 표면으로 옮기고 마우스의 머리를 코 콘으로 부드럽게 안내합니다. 이소프로필 알코올 프렙 패드로 면도한 부위를 닦아 느슨한 모발을 제거하고 피부를 소독합니다. 다음으로, 300 마이크로 리터 이상의 세포 현탁액을 26 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 멸균 주사기에 넣습니다.주사기에서 기포를 제거하고 초과분을 밀어내면서 300마이크로리터의 세포 현탁액을 유지합니다. 주로 사용하지 않는 손에 쥐고 있는 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 마우스 등의 한쪽 피부를 부드럽게 들어 올려 피하 공간에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 주로 사용하는 손을 사용하여 주사기를 마우스 몸의 관상 및 시상 평원과 평행하게 놓습니다.바늘이 쥐의 머리 쪽을 향하게 하여 뒷부분 근처의 피부에 바늘을 삽입하고 전체 바늘이 피부 아래에 남아 있고 찌르지 않도록 하면서 피하 공간으로 안내합니다. 바늘 바닥 주위의 피부를 고정하도록 집게를 조정합니다. 50 마이크로리터 미만의 세포 현탁액을 천천히 분배하고 주사 부위의 피부 아래에 작은 돌출부가 형성되는지 확인합니다.최대 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 피하 주사를 계속하십시오. 그런 다음 집게를 제자리에 잡고 바늘을 마우스의 몸과 평행하게 유지하면서 바늘을 빼냅니다. 바늘을 제거한 후 집게로 피부를 닫은 채로 몇 초 동안 유지하여 찔린 상처에서 세포가 새어 나오지 않도록합니다.이식 후 각 마우스를 신선한 케이지로 옮기고 케이지에 마우스를 추가하기 전에 동물이 마취에서 완전히 회복되도록하십시오. 안락사된 마우스를 등에 대고 수술용 가위를 사용하여 피부에 약 2인치 길이의 수직 절개를 합니다. 마우스의 오른쪽을 잘라내어 밝은 빨간색 비장을 찾습니다.분홍색 췌장에서 비장을 부드럽게 잘라 내고 5 밀리리터의 멸균 PBS가 들어있는 멸균 10 센티미터 페트리 접시에 옮깁니다. 멸균 주사기 플런저의 평평한 상단으로 비장을 으깬다. 40 또는 70 미크론 스트레이너를 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 놓고 5 밀리리터의 PBS로 프라이밍합니다.비장 현탁액을 여과기에 옮기고 부드럽게 으깬다. 10 밀리리터의 PBS로 접시를 씻고 세척액을 여과기로 옮깁니다. 여과기에 붉은 색이 남지 않을 때까지 계속 으깬다.그런 다음 실온에서 5분 동안 500G의 속도로 튜브를 회전시키고 흡인 피펫으로 상층액을 제거한 후 실온으로 예열된 ACK 용해 완충액 5밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하여 실온에서 4분 동안 적혈구 용해를 수행합니다. 용해 완충액 5밀리리터당 5밀리리터의 NIT-1 세포 배지로 반응을 소멸시키고 세포 현탁액을 새로운 여과기를 통해 50밀리리터 원심분리기 튜브에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 튜브를 500G에서 실온에서 5분 동안 회전시킵니다.다음으로, 세포를 계수하기 전에 20 밀리리터의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 계수 후 실온에서 5분 동안 500G에서 세포를 회전시킵니다. 1.5 밀리리터 안전 잠금 반응 튜브의 멸균 PBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.즉시 주사하거나 세포를 최대 1 시간 동안 얼음에 보관하십시오. 성체 수용자 NOD SCID 마우스의 몸을 5 내지 10분 동안 열 램프를 이용하여 몸을 따뜻하게 하여 정맥을 혈관 확장시켰다. 각 주사 전에 비장 세포 용액을 다시 일시 중지하십시오.각 마우스에 대해 예열 된 비장 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 주사기에 넣고 기포가 없는지 확인하십시오. 다음으로, 주로 사용하지 않는 손으로 꼬리를 잡기 전에 마우스를 구속 장치에 넣으십시오. 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나를 찾습니다.필요한 경우 꼬리를 부드럽게 돌립니다. 70% 이소프로필 알코올이 함유된 소독용 물티슈로 꼬리를 닦습니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 바늘을 꼬리의 중앙 영역에 예각으로 삽입하십시오.바늘의 경사가 위를 향하도록 하여 바늘을 피부를 통해 몇 밀리미터 밀어 넣습니다. 그런 다음 주사기에 부드러운 압력을 가하여 비장 세포 현탁액을 주입합니다. 주입할 때 바늘이 더 이상 안팎으로 움직이지 않도록 하십시오.성공적인 주사는 주사 중 배압을 일으키지 않으며 주사 직후 투명 또는 백색 혈류로 표시됩니다. 주사 후 바늘을 정맥 밖으로 부드럽게 떼고 출혈이 멈출 때까지 소독 물티슈로 꼬리에 가벼운 압력을 가하십시오. 구속 장치에서 마우스를 풀고 새로 준비된 케이지로 부드럽게 옮깁니다.이미징 최소 5분 전에 1밀리리터 주사기와 26게이지 바늘을 사용하여 적절한 용량의 D-루시페린 용액을 마우스에 복강 주사합니다. 이미징 소프트웨어에 로그인한 후 제어판에서 초기화를 선택합니다. 이미징 데이터를 자동 저장하려면 수집을 클릭한 다음 자동 저장을 클릭하고 컴퓨터에 적절한 폴더를 만듭니다.측량기 초기화가 완료되면 노출 시간을 1분으로 설정합니다. 마우스를 팔다리를 벌린 상태로 엎드린 자세로 이미징 기구 위에 놓고 머리를 노즈 콘으로 안내합니다. 양손으로 등 중앙을 누른 다음 손을 바깥쪽으로 벌려 마우스를 부드럽게 평평하게 만듭니다.그런 다음 이미징 소프트웨어에서 팝업 창에서 실험의 관련 세부 정보 획득 및 기록을 선택합니다. 연구된 3마리의 마우스 중 2마리에서, 대조군 이식편은 각각의 생체발광 신호의 손실로부터 명백히 밝혀진 바와 같이 18일째까지 파괴되었다. 그러나 다른 마우스에서는 대조군 이식편이 살아남은 동안 돌연변이 이식편이 파괴되어 동물 간의 생물학적 변이를 강조했습니다.생체발광 신호를 정량화하고, 이식편 생존율을 제1 시점에서의 신호와 비교한 잔류 생체발광 신호의 백분율로서 보고하였다. 각 마우스에 대한 대조군 이식편에 대한 돌연변이 이식편으로부터의 발광 신호의 비율을 사용하여 동물 간의 변이를 시각화했습니다. 질병이 전이되기 전에 이식된 세포가 복제되어 피부를 통해 볼 수 있는 확장된 이식편이 생길 수 있습니다.이미징 시 이러한 이식편은 정확하게 정량화할 수 없는 포화 생물발광 신호를 표시했습니다. 이식편은 예를 들어 자가면역 공격 및 이식편 보호의 메커니즘을 조사하기 위해 유세포 분석에 의해 침윤성 면역 세포의 특성화를 위해 다양한 시점에서 단리될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

연구

생물학

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

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FDG micro-PET/CT와 마우스의 브라운 지방의 기능 영상

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

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생존 시간의 측정에<em&gt; Brachionus</em&gt; 로티퍼 : 산모 조건의 동기화

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...