Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Эрику. Кай и д-ра Юки Исикаву за разработку метода, описанного в этом протоколе (см. ссылку 11). Исследования в лабораториях S.K. и P.Y. поддерживаются грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Гарвардского института стволовых клеток и Фонда Битсона. Т.С. был поддержан докторской стипендией Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (NIDDK) (T32 DK007260-45), а К.Б. был частично поддержан стипендией Фонда Мэри К. Якокка.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс трансплантации и визуализации трансплантатов в адаптивной модели переноса диабета у мышей. Клетки NIT-1, экспрессирующие трансген светлячка люциферазу (luc2), пере...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

СД1 является разрушительным заболеванием, от которого в настоящее время не существует лекарства. Заместительная терапия бета-клетками предлагает многообещающее лечение для пациентов с этим заболеванием, но критическим препятствием для этой стратегии является возможность рецидивиру...

Диабет 1 типа (СД1) вызывается аутоиммунным разрушением инсулин-продуцирующих бета-клеток поджелудочной железы. Потеря бета-клеточной массы приводит к дефициту инсулина и гипергликемии. Пациенты с СД1 полагаются на многократные ежедневные инъекции экзогенного инсулина и испытывают эпизоды тяжелой гипергликемии и гипогликемии на протяжении всей своей жизни. Осложнения, связанные с этими эпизодами, включают диабетическую ретинопатию, снижение функции почек и невропатию1.
Инъекции инсулина являются лечением, но не лекарством от СД1. Однако замена потерянной бета-клеточной массы может обратить вспять болезнь, позволяя пациентам вырабатывать свой собственный инсулин. Тем не менее, предложение островков трупного донора ограничено2. Островки, полученные из стволовых клеток (SC-островки), могут обеспечить практически неограниченный запас бета-клеток для трансплантации. Несколько групп продемонстрировали, что эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть дифференцированы с образованием функциональных бета-подобных клеток 3,4,5. Многообещающие данные ранних клинических испытаний указывают на то, что эти клетки сохраняют свою функцию после трансплантации и могут позволить пациентам стать инсулинонезависимыми6. Однако требуется хроническая иммуносупрессия, что повышает их восприимчивость к раку и инфекциям. Кроме того, иммунодепрессанты могут быть цитотоксичными для трансплантатов в долгосрочной перспективе7. Чтобы устранить необходимость иммуносупрессии, SC-островки могут быть генетически модифицированы, чтобы защитить их от рецидивирующего аутоиммунитета, а также аллоиммунитета после трансплантации.
Исследования стволовых клеток очень требовательны к затратам и трудозатратам. Клеточные линии мышей и животные модели являются полезными инструментами для первоначальной идентификации и экспериментальной проверки стратегий защиты трансплантированных клеток от аутоиммунитета. У мыши NOD развивается спонтанный аутоиммунный диабет со многими сходствами с человеческим T1D8, а клеточная линия инсулиномы NIT-1 имеет общий генетический фон с этим мышиным штаммом9. Диабет может быть адоптивно перенесен на родственный иммунодефицитный штамм мыши NOD-scid посредством инъекции диабетических спленоцитов от мышей NOD с целью временной синхронизации начала диабета у реплицированных экспериментальных мышей10. Эта модель может быть использована для относительно быстрой и недорогой идентификации генетических мишеней для дальнейшей валидации в SC-островках. Недавно этот метод был применен для идентификации и проверки RNLS, мишени, которая, как было установлено, защищает первичные островки человека от аутоиммунитета in vivo и островки, полученные из iPSC, от стресса бета-клеток in vitro11. Здесь описан простой протокол трансплантации генетически модифицированных клеток NIT-1 и неинвазивного мониторинга их выживаемости в адаптивной модели переноса аутоиммунного диабета у мышей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

Сахарный диабет 1 типа характеризуется аутоиммунным разрушением инсулин-продуцирующих бета-клеток поджелудочной железы. Перспективным методом лечения этого заболевания является трансплантация бета-клеток, полученных из стволовых клеток. Однако генетические модификации могут быть необходимы для защиты трансплантированных клеток от стойкого аутоиммунитета. Модели мышей с диабетом являются полезным инструментом для предварительной оценки стратегий защиты трансплантированных клеток от аутоиммунной атаки. Здесь описан минимально инвазивный метод трансплантации и визуализации клеточных трансплантатов в адаптивной модели переноса диабета у мышей. В этом протоколе клетки из линии бета-клеток поджелудочной железы мыши NIT-1, экспрессирующие трансген люциферазы светлячка luc2 , подкожно трансплантируются иммунодефицитным мышам с диабетом (NOD) и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (scid) без ожирения. Этим мышам одновременно вводят внутривенно спленоциты от спонтанно диабетических мышей NOD для передачи аутоиммунитета. Трансплантаты визуализируются через регулярные промежутки времени с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации для мониторинга выживаемости клеток. Выживание мутантных клеток сравнивается с выживанием контрольных клеток, трансплантированных той же мыши.

Обзор протокола приведен на рисунке 1. Выживаемость двух клеточных линий, таких как мутантный и нецелевой контроль, может быть сравнена, или выживаемость одной клеточной линии может быть измерена в нескольких группах мышей, таких как мыши, обработанные лекарственными п?...

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Этот протокол описывает простой и минимально инвазивный метод трансплантации и визуализации клеток NIT-1 у мышей с комбинированным иммунодефицитом, не страдающих ожирением (NOD) и тяжелой формой иммунодефицита, которым подвергались воздействию спленоцитов, очищенных от мышей со спонтанным диабетом NOD.

Биолюминесцентный мониторинг выживаемости трансплантата в адаптивной модели переноса аутоиммунного диабета у мышей

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Этот протокол может помочь понять механизмы защиты от аутоиммунных атак и определить терапевтические мишени для замены бета-клеток при диабете первого типа. Основным преимуществом этой методики является относительно невысокая стоимость, простота методов культивирования клеток, трансплантации и визуализации, а также минимальная инвазивность мышиных методик. Люди, которые никогда раньше не делали инъекцию в хвостовую вену, могут испытывать трудности с введением иглы в вену.Попросите специалиста провести демонстрацию перед первой инъекцией. Для начала возьмите анестезированную мышь и удалите волосы с ее спинной стороны с помощью электробритвы с защитным кожухом, обнажив примерно один дюйм на два дюйма кожи. Верните бритую мышь в нокдаун-камеру.Перед пересадкой перенесите по одной мыши из камеры на чистую поверхность, оснащенную носовым конусом изофлурана, и осторожно направьте голову мыши в носовой конус. Протрите бритый участок протритой изопропиловым спиртом, чтобы удалить выпавшие волосы и продезинфицировать кожу. Затем наберите более 300 микролитров клеточной суспензии в стерильный шприц объемом один миллилитр, оснащенный иглой 26 калибра.Удалите все пузырьки из шприца и сохраните 300 микролитров клеточной суспензии, выталкивая излишки. Используя пару изогнутых щипцов, удерживаемых в недоминантной руке, осторожно приподнимите кожу с одной стороны спины мыши, чтобы облегчить доступ к подкожному пространству. Затем, используя доминирующую руку, расположите шприц параллельно корональной и сагиттальной плоскостям тела мыши.Направив иглу к голове мыши, вставьте ее в кожу возле задних четвертей и направьте в подкожное пространство, следя за тем, чтобы вся игла оставалась под кожей и не протыкалась насквозь. Отрегулируйте щипцы, чтобы удерживать кожу вокруг основания иглы. Медленно дозируйте менее 50 микролитров клеточной суспензии и подтвердите образование небольшой выпуклости под кожей в месте инъекции.Продолжайте вводить до 200 микролитров клеточной суспензии подкожно. Затем, удерживая щипцы на месте и удерживая иглу параллельно телу мыши, извлеките иглу. После того, как игла будет удалена, держите кожу закрытой щипцами в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить утечку клеток из колотой раны.После трансплантации переведите каждую мышь в новую клетку и дайте животному полностью оправиться от анестезии, прежде чем добавлять дополнительных мышей в клетку. Положив усыпленную мышь на спину, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать вертикальный разрез на коже длиной примерно два дюйма. Разрежьте правую сторону мыши и найдите ярко-красную селезенку.Аккуратно отрежьте селезенку от розовой поджелудочной железы и перенесите ее в стерильную 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую пять миллилитров стерильного PBS. Разомните селезенку плоской верхней частью стерильного поршня шприца. Поместите ситечко размером 40 или 70 микрон на коническую трубку объемом 50 миллилитров и заправьте его пятью миллилитрами PBS.Переложите суспензию селезенки в ситечко и аккуратно разомните. Вымойте посуду 10 миллилитрами PBS и переложите стирку в ситечко. Продолжайте растирать до тех пор, пока на ситечке не останется красного цвета.Затем раскрутите пробирку со скоростью 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки, прежде чем ресуспендировать клеточную гранулу в пяти миллилитрах буфера лизиса ACK, предварительно нагретого до комнатной температуры, чтобы выполнить лизис эритроцитов при комнатной температуре в течение четырех минут. Погасите реакцию пятью миллилитрами клеточной среды NIT-1 на пять миллилитров лизирующего буфера и пропустите клеточную суспензию в 50-миллилитровую центрифужную пробирку через свежее ситечко для удаления комков. Открутите тюбик при 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре.Затем ресуспендируйте гранулу ячейки в 20 миллилитрах PBS перед подсчетом клеток. После подсчета открутите ячейки при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточный гранул в стерильном PBS в 1,5-миллилитровой реакционной пробирке с безопасным замком.Либо сделайте инъекцию немедленно, либо храните клетки на льду не более одного часа. Разогрейте тело взрослых мышей-реципиентов NOD SCID, используя тепловую лампу в течение пяти-10 минут, чтобы вазодилатировать вены. Ресуспендируйте раствор спленоцитов перед каждой инъекцией.Для каждой мыши наберите в шприц 100 микролитров предварительно подогретой суспензии спленоцитов, убедитесь, что нет пузырьков воздуха. Затем поместите мышь в удерживающее устройство, прежде чем захватить ее хвост недоминантной рукой. Найдите одну из двух боковых хвостовых жилок.При необходимости аккуратно поверните хвост. Протрите хвост дезинфицирующей салфеткой, содержащей 70% изопропилового спирта. Доминирующей рукой введите иглу под острым углом в центральную область хвоста.Скос иглы вверх проведите иглой на несколько миллиметров по коже. Затем слегка надавите на шприц, чтобы ввести суспензию спленоцитов. Не позволяйте игле двигаться дальше внутрь или наружу во время инъекции.Успешные инъекции не вызывают противодавления во время инъекции и обозначаются прозрачным или белым кровотоком сразу после инъекции. После инъекции осторожно выпустите иглу из вены и слегка надавите на хвост дезинфицирующей салфеткой до тех пор, пока кровотечение не остановится. Освободите мышь от удерживающего устройства и аккуратно перенесите ее в только что подготовленную клетку.По крайней мере, за пять минут до визуализации введите мыши внутрибрюшинно соответствующую дозировку раствора D-люциферина, используя шприц объемом один миллилитр и иглу 26-го калибра. После входа в программное обеспечение для работы с изображениями на панели управления выберите «Инициализировать». Чтобы автоматически сохранить данные изображения, нажмите «Получение», а затем «Автосохранение в» и создайте соответствующие папки на компьютере.После того, как прибор завершит инициализацию, установите время экспозиции равным одной минуте. Поместите мышь на прибор визуализации в положение лежа с растопыренными конечностями и направьте голову в носовой конус. Аккуратно расплющите мышь, нажав на центр ее спины обеими руками, а затем разведя руки наружу и в стороны.Затем в программном обеспечении для обработки изображений выберите «Получить и записать все соответствующие детали эксперимента» во всплывающем окне. У двух из трех изученных мышей контрольный трансплантат был разрушен к 18-му дню, о чем свидетельствует потеря соответствующих биолюминесцентных сигналов. У другой мыши, однако, мутантный трансплантат был разрушен, в то время как контрольный трансплантат выжил, что подчеркивает биологическую изменчивость между животными.Биолюминесцентный сигнал был количественно определен, и выживаемость трансплантата была представлена как процент остаточного биолюминесцентного сигнала по сравнению с сигналом в первый момент времени. Соотношение люминесцентных сигналов от мутантного трансплантата к контрольному трансплантату для каждой мыши использовалось для визуализации различий между животными. Перед переносом заболевания трансплантированные клетки могут реплицироваться, в результате чего через кожу видны расширенные трансплантаты.При визуализации эти трансплантаты показали насыщенные биолюминесцентные сигналы, которые не могли быть точно определены. Трансплантаты могут быть выделены в различные моменты времени для характеристики инфильтрирующих иммунных клеток, например, с помощью проточной цитометрии для исследования механизмов аутоиммунной атаки и защиты трансплантата.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Индукция и мониторинг приемных гиперчувствительности замедленного типа у крыс

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

В естественных условиях Биолюминесцентный изображения опухоли молочной железы Использование ИВИС Спектра

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Функциональной визуализации бурого жира у мышей с ФДГ micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Измерение выживания Время<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotifers: Синхронизация материнской Условия

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Мурин Модель ожога раны реконструирована с аллогенной кожи трансплантата

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...