Name: bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Bu protokolde açıklanan yöntemi geliştirdikleri için Dr. Erica P. Cai ve Dr. Yuki Ishikawa'ya teşekkür ederiz (bkz. ref. 11). SK ve P.Y.'nin laboratuvarlarındaki araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Kök Hücre Enstitüsü ve Beatson Vakfı'ndan gelen hibelerle desteklenmektedir. TS, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü'nden (NIDDK) (T32 DK007260-45) doktora sonrası bir burs ile desteklendi ve KB, kısmen Mary K. Iacocca Vakfı'ndan bir burs ile desteklendi.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg"> Şekil 1: Farelerde diyabetin evlat edinilmiş bir transfer modelinde greftlerin nakli ve görüntülenmesi için iş akışı. Ateşböceği transgen lusiferazı (luc2) eksprese eden NIT-1 hücreleri, NOD-scid farelere deri altından nakledilir. Farelere aynı anda kendiliğinden diyabetik bir NOD faresinden izole edilen otoreaktif splenos...

<ol>
	<li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+mellitus.">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).</li><li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pancreatic+islet+transplantation.">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021)</li><li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development.">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li><li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+(NOD)+mouse+model+in+autoimmune+diabetes.">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li><li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+&#946;-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic &#946;-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice:+Relative+contribution+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li><li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes.">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li><li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection.">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).</li><li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease,+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression.">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice.">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li></ol>

T1D, şu anda tedavisi bulunmayan yıkıcı bir hastalıktır. Beta hücre replasman tedavisi, bu hastalığı olan hastalar için umut verici bir tedavi sunar, ancak bu stratejinin önündeki kritik engel, nakledilen beta hücrelerine karşı tekrarlayan otoimmün saldırı potansiyelidir. SC-beta hücrelerinin bağışıklık görünürlüklerini veya duyarlılıklarını azaltmak için genetik mühendisliği bu soruna potansiyel bir çözümdür. Burada tarif edilen, farelerde otoimmün diyabetin evlat edinilmiş bir ...

Tip 1 diyabet (T1D), pankreasın insülin üreten beta hücrelerinin otoimmün yıkımından kaynaklanır. Beta hücre kütlesinin kaybı insülin eksikliği ve hiperglisemi ile sonuçlanır. T1D hastaları günlük birden fazla eksojen insülin enjeksiyonuna güvenir ve yaşamları boyunca ciddi hiperglisemi ve hipoglisemi atakları yaşarlar. Bu ataklara bağlı komplikasyonlar diyabetik retinopati, azalmış böbrek fonksiyonu ve nöropati1'dir.
İnsülin enjeksiyonları bir tedavidir, ancak T1D için bir tedavi değildir. Bununla birlikte, kaybedilen beta hücre kütlesinin değiştirilmesi, hastaların kendi insülinlerini üretmelerini sağlayarak hastalığı tersine çevirme potansiyeline sahiptir. Ancak kadavra donör adacıklarının arzı sınırlı2. Kök hücre kaynaklı adacıklar (SC-adacıkları), nakil için neredeyse sınırsız bir beta hücresi kaynağı sağlayabilir. Birkaç grup, insan embriyonik kök hücrelerinin (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) fonksiyonel beta benzeri hücreler üretmek için farklılaştırılabileceğini göstermiştir 3,4,5. Umut verici erken klinik çalışma verileri, bu hücrelerin nakil sonrası işlevlerini sürdürdüklerini ve hastaların insülinden bağımsız olmalarını sağlayabileceğini göstermektedir6. Bununla birlikte, kronik immünsüpresyon gereklidir, böylece kanser ve enfeksiyona duyarlılıkları artar. Ek olarak, immünsüpresif ajanlar uzun dönemde greftler için sitotoksik olabilir7. İmmünsüpresyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için, SC-adacıkları, tekrarlayan otoimmüniteden ve nakil sonrası alloimmüniteden korumak için genetik olarak değiştirilebilir.
Kök hücre araştırması maliyet ve işçilik açısından oldukça talepkardır. Fare hücre çizgileri ve hayvan modelleri, nakledilen hücreleri otoimmüniteden korumak için stratejilerin ilk tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması için yararlı araçlardır. NOD faresi, insan T1D8 ile birçok benzerliğe sahip spontan otoimmün diyabet geliştirir ve NIT-1 insülinoma hücre hattı, bu fare suşu9 ile genetik bir arka planı paylaşır. Diyabet, replika deney farelerinde diyabetin başlangıcını geçici olarak senkronize etmek için NOD farelerinden diyabetik splenositlerin enjeksiyonu yoluyla ilgili immün yetmezlikli NOD-scid fare suşuna evlat edinilebilir10. Bu model, SC-adacıklarında daha fazla doğrulama için genetik hedefleri nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir. Son zamanlarda, yöntem, birincil insan adacıklarını in vivo otoimmüniteden ve iPSC türevli adacıkları in vitro11 beta hücre stresinden koruduğu tespit edilen bir hedef olan RNLS'yi tanımlamak ve doğrulamak için uygulanmıştır. Burada tarif edilen, genetiği değiştirilmiş NIT-1 hücrelerini nakletmek ve farelerde otoimmün diyabetin evlat edinilmiş bir transfer modelinde hayatta kalmalarını invaziv olmayan bir şekilde izlemek için basit bir protokoldür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amazon/Ever Ready First Aid</td>
			<td>B08NWF31DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL TB Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;30-100-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer premium SureStrain, 70 &#181;m, sterile</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>C4070</td>
			<td>Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellDrop automated cell counter</td>
			<td>Denovix</td>
			<td>CellDrop BF-PAYG</td>
			<td>Or use similar cell counter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td>Or use similar aspirating pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, &#62;99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon BD tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose urine test strip</td>
			<td>California Pet Pharmacy</td>
			<td>u-tsg100</td>
			<td>Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8211;1 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heating lamp</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>03057-00</td>
			<td>Or use similar infrared lamp&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>6679401725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td>Software for collecting and quantifying bioluminescent signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td>Or use similar sterile microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIT-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2055</td>
			<td>Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td>Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation&#160;Prkdcscid, commonly referred to as&#160;scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/ShiLtJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>001976</td>
			<td>The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>No calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-luciferase-blast</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Plasmid available upon request</td>
			<td>See Supplemental File 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1014320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-288-32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, sharp-pointed</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td>Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430167-20EA</td>
			<td>Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent monitoring of graft survival in an adoptive transfer model of autoimmune diabetes in mice

Tip 1 diyabet, pankreasın insülin üreten beta hücrelerinin otoimmün yıkımı ile karakterizedir. Bu hastalık için umut verici bir tedavi, kök hücre kaynaklı beta hücrelerinin transplantasyonudur. Bununla birlikte, nakledilen hücreleri kalıcı otoimmüniteden korumak için genetik modifikasyonlar gerekli olabilir. Diyabetik fare modelleri, nakledilen hücreleri otoimmün saldırılardan korumak için stratejilerin ön değerlendirmesi için yararlı bir araçtır. Burada tarif edilen, farelerde diyabetin evlat edinilmiş bir transfer modelinde hücre greftlerinin nakli ve görüntülenmesi için minimal invaziv bir yöntemdir. Bu protokolde, ateşböceği lusiferaz transgen luc2'yi eksprese eden murin pankreatik beta hücre hattı NIT-1'den hücreler, immün yetmezlikli obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli (scid) farelere deri altından nakledilir. Bu fareler, otoimmüniteyi aktarmak için spontan diyabetik NOD farelerinden splenositlerle eşzamanlı olarak intravenöz olarak enjekte edilir. Greftler, hücre sağkalımını izlemek için non-invaziv biyolüminesan görüntüleme yoluyla düzenli aralıklarla görüntülenir. Mutant hücrelerin hayatta kalması, aynı fareye nakledilen kontrol hücrelerininkiyle karşılaştırılır.

Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir. Bir mutant ve hedeflenmeyen bir kontrol gibi iki hücre hattının hayatta kalması karşılaştırılabilir veya bir hücre hattının hayatta kalması, ilaçla tedavi edilen farelere karşı araçla tedavi edilen kontroller gibi birden fazla fare grubunda ölçülebilir. Şekil 3A , hedeflenmeyen bir kontrol (solda) ve bir mutant (sağ) hücre hattı ile nakledilen üç adet 8 haftalık dişi NOD scid fa...

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice at JoVE.com

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Bu protokol, otoimmün ataklara karşı korunma mekanizmalarını anlamaya ve tip bir diyabette beta hücre replasmanı için terapötik hedefleri belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nispeten düşük maliyet, hücre kültürü, nakil ve görüntüleme yöntemlerinin basitliği ve fare tekniklerinin minimal invazivliğidir. Daha önce hiç kuyruk damarı enjeksiyonu yapmamış kişiler, iğneyi damar içine sokmak için mücadele edebilir.İlk enjeksiyonunuzdan önce bir uzman tarafından bir gösteri isteyin. Başlamak için, anestezi uygulanmış fareyi alın ve cildin yaklaşık bir inç x iki inçini açığa çıkaran bir koruyucu ile elektrikli tıraş makinesi kullanarak saçları sırt tarafından çıkarın. Tıraş olmuş fareyi yıkma odasına geri getirin.Nakilden önce, her seferinde bir fareyi odadan izofluran burun konisi ile donatılmış temiz bir yüzeye aktarın ve farenin başını nazikçe burun konisine yönlendirin. Gevşek tüyleri gidermek ve cildi dezenfekte etmek için tıraş edilen bölgeyi izopropil alkol hazırlama pedi ile silin. Daha sonra, 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitre steril şırıngaya 300 mikrolitreden fazla hücre süspansiyonu çekin.Şırıngadaki kabarcıkları çıkarın ve fazlalığı dışarı iterken 300 mikrolitre hücre süspansiyonunu koruyun. Baskın olmayan elde tutulan bir çift kavisli forseps kullanarak, deri altı boşluğa daha kolay erişim sağlamak için farenin sırtının bir tarafındaki cildi yavaşça kaldırın. Daha sonra baskın eli kullanarak, şırıngayı farenin vücudunun koronal ve sagital ovalarına paralel olarak konumlandırın.İğne farenin kafasına doğru işaret ettiğinde, arka çeyreklerin yakınındaki cilde yerleştirin ve tüm iğnenin cildin altında kalmasını ve dürtmemesini sağlarken deri altı boşluğa yönlendirin. Forsepsleri, cildi iğnenin tabanının etrafında tutacak şekilde ayarlayın. Hücre süspansiyonunun 50 mikrolitreden daha azını yavaşça dağıtın ve enjeksiyon bölgesinde cildin altında küçük bir çıkıntı oluşumunu onaylayın.Deri altından 200 mikrolitreye kadar hücre süspansiyonu enjekte etmeye devam edin. Daha sonra forsepsleri yerinde tutarak ve iğneyi farenin vücuduna paralel tutarak iğneyi geri çekin. İğne çıkarıldıktan sonra, hücrelerin delinme yarasından sızmasını önlemek için cildi birkaç saniye forseps ile kapalı tutun.Nakli takiben, her fareyi yeni bir kafese aktarın ve kafese ek fareler eklemeden önce hayvanın anesteziden tamamen iyileşmesine izin verin. Ötanazi fareyi sırtına yerleştirerek, ciltte yaklaşık iki inç uzunluğunda dikey bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Farenin sağ tarafını kesin ve parlak kırmızı dalağı bulun.Dalağı pembe pankreastan yavaşça kesin ve beş mililitre steril PBS içeren steril 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Dalağı steril bir şırınga pistonunun düz üst kısmı ile ezin. 50 mililitrelik bir konik tüpe 40 veya 70 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve beş mililitre PBS ile astarlayın.Dalak süspansiyonunu süzgecin içine aktarın ve yavaşça ezin. Bulaşığı 10 mililitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı süzgecin üzerine aktarın. Süzgeçte kırmızı renk kalmayana kadar ezmeye devam edin.Daha sonra tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G hızında döndürün ve kırmızı kan hücrelerinin oda sıcaklığında dört dakika boyunca parçalanmasını gerçekleştirmek için hücre peletini oda sıcaklığına önceden ısıtılmış beş mililitre ACK lizis tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edici bir pipetle çıkarın. Reaksiyonu, beş mililitre lizis tamponu başına beş mililitre NIT-1 hücre ortamı ile söndürün ve kümeleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu taze bir süzgeçten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne geçirin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de döndürün.Daha sonra, hücreleri saymadan önce hücre peletini 20 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de döndürün. Hücre peletini steril PBS'de 1,5 mililitrelik bir güvenli kilit reaksiyon tüpünde yeniden askıya alın.Hemen enjekte edin veya hücreleri en fazla bir saat boyunca buz üzerinde saklayın. Damarları vazodilate etmek için yetişkin alıcı NOD SCID farelerinin vücudunu beş ila 10 dakika boyunca bir ısı lambası kullanarak ısıtın. Her enjeksiyondan önce splenosit çözeltisini tekrar askıya alın.Her fare için, önceden ısıtılmış splenosit süspansiyonunun 100 mikrolitresini şırıngaya çekin, hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Ardından, kuyruğunu baskın olmayan elle yakalamadan önce fareyi kısıtlama cihazına yerleştirin. İki lateral kuyruk damarından birini bulun.Gerekirse kuyruğu yavaşça döndürün. Kuyruğu% 70 izopropil alkol içeren bir dezenfeksiyon mendili ile silin. Baskın eli kullanarak, iğneyi kuyruğun orta bölgesine keskin bir açıyla yerleştirin.İğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde, iğneyi cilt boyunca birkaç milimetre kaydırın. Daha sonra splenosit süspansiyonunu enjekte etmek için şırıngaya hafif basınç uygulayın. Enjeksiyon sırasında iğnenin daha fazla içeri veya dışarı hareket etmesine izin vermeyin.Başarılı enjeksiyonlar enjeksiyon sırasında geri basınca neden olmaz ve enjeksiyondan hemen sonra şeffaf veya beyaz kan akışı ile gösterilir. Enjeksiyondan sonra, iğneyi yavaşça damardan çıkarın ve kanama durana kadar bir dezenfeksiyon mendili ile kuyruğa hafif basınç uygulayın. Fareyi kısıtlama cihazından serbest bırakın ve yavaşça yeni hazırlanmış bir kafese aktarın.Görüntülemeden en az beş dakika önce, fareye bir mililitrelik bir şırınga ve 26 gauge iğne kullanarak uygun dozda D-lusiferin çözeltisi ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Görüntüleme yazılımında oturum açtıktan sonra, kontrol panelinde başlat'ı seçin. Görüntüleme verilerini otomatik olarak kaydetmek için, edinimin üzerine tıklayın ve ardından otomatik olarak kaydedin ve bilgisayarda uygun klasörleri oluşturun.Cihaz başlatmayı bitirdiğinde, pozlama süresini bir dakikaya ayarlayın. Fareyi görüntüleme cihazının üzerine, uzuvları oynak olacak şekilde yüzüstü bir konuma getirin ve başını burun konisine yönlendirin. Fareyi sırtının ortasına iki elinizle bastırarak ve ardından ellerinizi dışa ve birbirinden ayırarak hafifçe düzleştirin.Ardından, görüntüleme yazılımında, açılır pencerede denemenin ilgili ayrıntılarını al'ı seçin ve kaydedin. İncelenen üç fareden ikisinde, kontrol grefti, ilgili biyolüminesan sinyallerin kaybından açıkça görüldüğü gibi, 18. günde yok edildi. Bununla birlikte, diğer farede, kontrol grefti hayatta kalırken mutant greft yok edildi ve hayvanlar arasındaki biyolojik çeşitliliği vurguladı.Biyolüminesan sinyal ölçüldü ve greft sağkalımı, ilk zaman noktasındaki sinyale kıyasla kalıntı biyolüminesan sinyalin yüzdesi olarak rapor edildi. Her fare için mutant greftten gelen ışıldayan sinyallerin kontrol greftine oranı, hayvanlar arasındaki varyasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hastalık transferinden önce, nakledilen hücreler çoğalabilir ve bu da deriden görülebilen genişlemiş greftlerle sonuçlanabilir.Görüntüleme üzerine, bu greftler doğru bir şekilde ölçülemeyen doymuş biyolüminesan sinyaller gösterdi. Greftler, infiltrasyon yapan immün hücrelerin karakterizasyonu için çeşitli zaman noktalarında, örneğin otoimmün atak ve greft koruma mekanizmalarını araştırmak için akış sitometrisi ile izole edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Sıçanlarda Kabul edilmiş Gecikmeli-Tipi aşırı duyarlılık indüksiyonu ve İzleme

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

FDG micro-PET/CT ile Fare Brown Fat Fonksiyonel Görüntüleme

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Hayatta kalma Süre deneyinde<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotiferler: Maternal Koşullarının Senkronizasyon

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Allojenik Deri Grefti ile Yeniden Yapılandırılan Yanık Yarasının Murine Modeli

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...