Name: isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes at JoVE.com

هذه الدراسة مدعومة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز زمالات أبحاث العلوم في الخارج (SG) ، وباحث ما بعد الدكتوراه لوريس وديفيد ريتش (SG) ، ومنحة من المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة (R01EY012392; كف. و.).

تتوافق جميع رعاية الحيوانات والعلاجات المستخدمة في هذه الدراسة مع بيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة كاليفورنيا ، بيركلي.
1. استئصال عين خنزير غينيا
<ol><li>القتل الر...

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches.">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells.">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358 (2018).</li><li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia:+A+review.">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li><li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+the+retina:+Choroidal+modulation+of+refractive+state.">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control.">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li><li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia.">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+(OPN5)+in+mice.">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).</li><li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia.">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li><li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li><li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration.">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).</li><li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+age-related+macular+degeneration+(AMD):+Relationships+between+the+photoreceptor/retinal+pigment+epithelium/Bruch's+membrane/choriocapillaris+complex.">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li><li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+choroid/RPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction.">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li><li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo.">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li><li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear.">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li><li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+choroid.">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional,+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium.">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li><li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis.">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium.">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).</li><li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals.">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation.">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li></ol>

في هذه المقالة ، نصف طريقة لعزل RPE ، مناسبة لتحليلات التعبير الجيني RPE ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول في أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة وخالية نسبيا من التلوث ، مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي بشكل مناسب للتحليلات الخاصة بالحمض النووي الريبي ، ومع ذلك ?...

يتكون RPE من طبقة أحادية فريدة من الخلايا المصطبغة الموجودة بين الشبكية العصبية والمشيمية الوعائية ، و RPE لها أدوار معترف بها جيدا في تطوير وصيانة وظيفة الشبكية الطبيعية ، بما في ذلك النقل الضوئي 1,2. في الآونة الأخيرة ، تم تكليف RPE بدور رئيسي إضافي في تنظيم نمو العين3 ، وبالتالي تطوير قصر النظر4. يعتمد هذا التعيين على الموقع الحرج ل RPE ، المتداخل بين شبكية العين والمشيمية والقبول الواسع الآن بأن نمو العين ، وبالتالي الأخطاء الانكسارية يتم تنظيمها محليا5. يعتقد أن RPE يلعب دورا رئيسيا كمتابع إشارة ، يربط شبكية العين ، المصدر المفترض للإشارات المعدلة للنمو ، بالمشيمية والصلبة ، وهما الهدفان للإشارات المنقولة6،7،8.
لا يمكن اعتبار الزيادة في الطول المحوري التي تميز معظم قصر النظر حميدة ، حيث تمثل التغيرات الفسيولوجية المرضية التي تشمل شبكية العين و / أو المشيمية و / أو الصلبة عواقب لا مفر منها ومعترف بها الآن لاستطالة العين المفرطة 7,9. في هذا السياق ، ربما يكون RPE هو الأكثر ضعفا ، لأنه ، كونه نسيجا غير ميتوتي ، فهو قادر فقط على استيعاب الغرفة الزجاجية المتوسعة عن طريق تمدد الخلايا الفردية وترققها. في حين أن دوره في الأمراض المرتبطة بقصر النظر ، مثل الضمور البقعي قصير النظر ، لم يتم فهمه بالكامل بعد ، فقد تورط RPE في التسبب في عدد من أمراض الشبكية الأخرى ، بما في ذلك الضمور الجغرافي ، أحد الأسباب الرئيسية للعمى ، والذي يرتبط بتشوهات موثقة في شبكية العين ، RPE ، والمشيمية10,11 ، 12.
من المحتمل أن يفتح العزل الناجح لخلايا RPE ، الخالية من التلوث من أنسجة العين المجاورة ، العديد من الفرص البحثية لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء مجموعة متنوعة من أمراض العين / الشبكية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عزل RPE يمثل تحديا ، حيث استخدمت العديد من الدراسات المنشورة عينات شبكية العين / RPE أو RPE / المشيمية المدمجة لهذا السبب13،14،15. اقتصرت الدراسات التي تنطوي على عزل ناجح ل RPE لجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية على عيون الفرخ والفأر16,17. على سبيل المثال ، طريقة عزل RPE المتزامنة وتثبيت الحمض النووي الريبي (SRIRS) التي وصفها Wang et al.18. لا يبدو أن عزل خلايا RPE في الفئران يعمل بشكل جيد في عيون خنزير غينيا. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تحسينا لنهج تم تصميمه في البداية بعيون زبابة الأشجار من قبل أحد المؤلفين (MF) وأثبت أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة ، مناسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبيولوجيا الجزيئية الأخرى ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with Slip Tip</td>
			<td>Bd Vacutainer Labware Medical</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile</td>
			<td>pectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>970-95008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific LLC</td>
			<td>1198D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>automated electrophoresis to check RNA quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Salt Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11083-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps no. 5</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540108</td>
			<td>Max. Speed: 8,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>tissue storage reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes

يصف هذا البروتوكول عزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون صغار خنازير غينيا المصطبغة للتطبيق المحتمل في دراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني. في سياق تنظيم نمو العين وقصر النظر ، من المحتمل أن يلعب RPE دورا كمرحل خلوي للإشارات المعدلة للنمو ، حيث يقع بين شبكية العين وجداري العين ، مثل المشيمية والصلبة. في حين تم تطوير بروتوكولات لعزل RPE لكل من الكتاكيت والفئران ، فقد أثبتت هذه البروتوكولات أنها غير قابلة للترجمة مباشرة إلى خنزير غينيا ، الذي أصبح نموذجا مهما ومستخدما على نطاق واسع لقصر النظر في الثدييات. في هذه الدراسة ، تم استخدام أدوات البيولوجيا الجزيئية لفحص التعبير عن جينات معينة للتأكد من أن العينات كانت خالية من التلوث من الأنسجة المجاورة. وقد تم بالفعل إثبات قيمة هذا البروتوكول في دراسة RNA-Seq ل RPE من خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة المعرضة لإلغاء التركيز البصري الذي يحفز قصر النظر. بالإضافة إلى تنظيم نمو العين ، فإن هذا البروتوكول له تطبيقات محتملة أخرى في دراسات أمراض الشبكية ، بما في ذلك اعتلال البقعة قصير النظر ، وهو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في myopes ، والذي تورط فيه RPE. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وبمجرد إتقانها ، تنتج عينات RPE عالية الجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي.

أظهر تحليل عينات RPE التي تم جمعها باستخدام البروتوكول أعلاه الحمض النووي الريبي المحفوظ جيدا (RIN >8.0 ، الشكل 2B) ، مع 240.2 نانوغرام ± 35.1 نانوغرام لكل عين (ن = 8 ، NanoDrop ، الشكل 2B). لمزيد من التقييم لجودة عينات RPE المعزولة ، لا سيما عدم وجود ملوثات المشيمية والصلبة ، ق?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes at JoVE.com

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

وصفنا طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون خنازير غينيا المصطبغة الصغيرة. يسمح هذا الإجراء بمتابعة دراسات البيولوجيا الجزيئية على RPE المعزول ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني.

عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من عيون خنزير غينيا

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

ظهارة الشبكية الصبغية أو RPE أمر بالغ الأهمية لصحة الشبكية. ودراسة RPE المعزولة أمر بالغ الأهمية لمرض الشبكية. تساعد طريقة عزل RPE هذه عن خنزير غينيا ، وهو نموذج قصر نظر شائع ، في حل المشكلة الصعبة.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وتنتج عينة RPE عالية الجودة مناسبة للدراسات الجزيئية البيولوجية بما في ذلك تحليل RPE. من خلال اتباع التقنية الموضحة بشكل مثالي ومراقبة كيفية التعامل مع أدوات التشريح ، يمكن للمرء إتقان هذا الإجراء بسرعة مع بعض الممارسة. بعد القتل الرحيم إنسانيا لخنزير غينيا واستئصال عيون الحيوان ، اغسل العينين على الفور عن طريق نقلها إلى طبق بتري 10 سم يحتوي على محلول ملحي معقم من الفوسفات أو PBS.بعد الغسيل ، انقل العينين إلى محلول PBS جديد. الآن تحت المجهر التشريحي ، استخدم إبرة قياس 18 لعمل فتحة صغيرة أولية في الصلبة في عين واحدة ، حوالي ملليمتر واحد خلف الحدود الداكنة حول القزحية بين القرنية والصلبة. باستخدام المقص ، قم بإزالة الجزء الأمامي ، بما في ذلك القرنية والقزحية والجسم الهدبي والعدسة البلورية.ثم العمل مع الجزء الخلفي المتبقي من العين ، استخدم الملقط للإمساك بمنطقة زين وسحبها برفق ، متبوعا بفصل الشبكية عن مجمع RPE / المشيمية / الصلبة ، وتقشير الشبكية دون تجزئة. بعد إزالة الشبكية بالكامل ، اغمر كوب العين الخلفي المتبقي ، والذي يتضمن RPE والمشيمية والصلبة في أحد آبار صفيحة 12 بئرا تحتوي على ملليلتر من كاشف تخزين الأنسجة واحتفظ بها مغمورة لمدة خمس دقائق. لشطف كاشف التخزين ، انقل كوب العين إلى بئر آخر مملوء بأربعة ملليلتر من PBS لمدة 10 ثوان قبل نقله إلى بئر ثالث مملوء بملليلتر من PBS.قبل الانتقال إلى خطوة عزل RPE النهائية ، قم بإعداد حقنة سعة ملليلتر واحدة مملوءة ب PBS وقم بتوصيل إبرة قياس 30. اضغط برفق على مكبس المحقنة لإنشاء تيار نفاث من PBS. العمل تحت المجهر ، أولا ، استهدف هذا التيار من PBS في RPE لعمل تمزق صغير أو ثقب فيه.ثم قم بتوجيه دفق PBS إلى الفتحة التي تم إنشاؤها لفصل RPE كورقة من المشيمية. بعد فصل RPE عن المشيمية ، اجمع خلايا RPE في حقنة ملليلتر واحدة عديمة الإبر وانقل العينة المجمعة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب باستخدام RPE الذي تم جمعه عند 8،000 × g لمدة دقيقة واحدة للحصول على حبيبات RPE.بالنسبة للعينات التي سيتم استخدامها في تحليلات الحمض النووي الريبي ، تخلص من المادة الطافية ، أي محلول PBS ، واستبدلها ب 350 ملليلتر من محلول التحلل كما هو مدرج في مجموعات عزل الحمض النووي الريبي. قم بسحب المحتوى لأعلى ولأسفل 20 مرة لخلطه جيدا والحفاظ على جودة العينة. للتخزين والحفظ على المدى الطويل ، انقل العينات إلى مجمد بدرجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل وجمع الحمض النووي الريبي من عينات RPE قبل تقييم جودة العينة عن طريق الرحلان الكهربائي. في دراستنا ، أظهرت عينات RPE التي تم جمعها الحمض النووي الريبي المحفوظ جيدا والذي يحتوي على رقم سلامة الحمض النووي الريبي أو RIN أكبر من ثمانية. إجمالي عدد الحمض النووي الريبي حوالي 240 نانوجرام لكل عين.وجد أن مستوى التعبير للجين المحدد RPE ، Rpe65 ، أعلى بكثير في عينات RPE منه في المشيمية والصلبة. في المقابل ، أظهرت عينات RPE الحد الأدنى من التعبير عن الجين المحدد للصلبة المشيمية المختارة ، نوع الكولاجين ألفا واحد ، مما يشير إلى عدم وجود ملوثات المشيمية والصلبة في عينات RPE المعزولة. أهم خطوة في الإجراء هي الإزالة السلسة لشبكية العين دون ترك أي جزء من الشبكية.يستدعي إجراء عزل RPE هذا شرحا في دراسات زراعة الخلايا في المختبر مع بعض الاختلافات المهمة ، بما في ذلك اختيار الوسائط لغمر خلايا RPE بعد العزل.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

عزل الخلايا الظهارية من بصيلات الأسنان البشرية

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

توليد فعال ومتسق لظهارة صبغية شبكية العين / المشيمية من العين البشرية للتحليل النسيجي

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

تحليل في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية في الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية الأولية باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...