Name: isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes at JoVE.com

Denne undersøgelse støttes af Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (SG), en Loris og David Rich Postdoc (S.G.) og et tilskud fra National Eye Institute of the National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).

Alle dyrepleje og behandlinger, der blev anvendt i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med ARVO-erklæringen for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of California, Berkeley.
1. Enucleation af marsvinøjet
<ol><li>Aflive et marsvin med en intrakardial injektion af natriumpentobarbital leveret under anæstesi (5% isofluran i ilt).</li>
	<li>Enucleate øjnene ved hjælp af...

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches.">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells.">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358 (2018).</li><li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia:+A+review.">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li><li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+the+retina:+Choroidal+modulation+of+refractive+state.">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control.">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li><li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia.">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+(OPN5)+in+mice.">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).</li><li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia.">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li><li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li><li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration.">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).</li><li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+age-related+macular+degeneration+(AMD):+Relationships+between+the+photoreceptor/retinal+pigment+epithelium/Bruch's+membrane/choriocapillaris+complex.">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li><li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+choroid/RPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction.">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li><li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo.">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li><li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear.">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li><li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+choroid.">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional,+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium.">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li><li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis.">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium.">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).</li><li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals.">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation.">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li></ol>

I denne artikel beskriver vi en metode til isolering af RPE, velegnet til RPE-genekspressionsanalyser, fra øjnene på unge, pigmenterede marsvin. Fordelene ved denne protokol er, at den giver RPE-prøver af høj kvalitet, der er relativt fri for kontaminering, med RNA, der er passende bevaret til RNA-specifikke analyser, og alligevel er den relativt enkel og effektiv. Mens RPE-prøverne i eksemplet her blev indsamlet fra øjnene på et ungt (2 uger gammelt) marsvin, er protokollen også blevet brugt med succes til at in...

RPE består af et unikt monolag af pigmenterede celler placeret mellem neuralhinden og den vaskulære choroid, og RPE har velkendte roller i udviklingen og vedligeholdelsen af normal nethindefunktion, herunder fototransduktion 1,2. For nylig er RPE blevet tildelt en yderligere nøglerolle i øjenvækstregulering3 og dermed udviklingen af nærsynethed4. Denne opgave er baseret på RPE'ens kritiske placering, indskudt mellem nethinden og choroid og den nu brede accept af, at øjenvækst og dermed brydningsfejl reguleres lokalt5. RPE menes at spille en nøglerolle som et signalrelæ, der forbinder nethinden, den formodede kilde til vækstmodulerende signaler, til choroid og sclera, de to mål for de videresendte signaler 6,7,8.
Stigningen i aksial længde, der karakteriserer de fleste nærsynethed, kan ikke betragtes som godartet, med patofysiologiske ændringer, der involverer nethinden, choroid og / eller sclera, der repræsenterer uundgåelige og nu velkendte konsekvenser af overdreven okulær forlængelse 7,9. I denne sammenhæng er RPE måske den mest sårbare, da den som et ikke-mitotisk væv kun er i stand til at rumme det ekspanderende glaslegemekammer ved strækning og udtynding af individuelle celler. Mens dets rolle i nærsynethedsrelaterede patologier, såsom myopisk makuladegeneration, endnu ikke er fuldt ud forstået, har RPE været impliceret i patogenesen af en række andre retinale sygdomme, herunder geografisk atrofi, en af de førende årsager til blindhed, som er forbundet med dokumenterede abnormiteter i nethinden, RPE og choroid10,11, 12.
Den vellykkede isolering af RPE-celler, fri for kontaminering fra tilstødende okulært væv, åbner potentielt mange forskningsmuligheder for at få ny indsigt i mekanismerne bag en række øjen- / nethindesygdomme. Imidlertid har isoleringen af RPE vist sig udfordrende, med mange offentliggjorte undersøgelser, der gør brug af kombinerede nethinden / RPE eller RPE / choroidprøver af denne grund13,14,15. Undersøgelser, der indebærer en vellykket isolering af RPE af en kvalitet, der er egnet til molekylærbiologiske undersøgelser, har været begrænset til kyllinge- og museøjne16,17. For eksempel den samtidige RPE-isolation og RNA-stabilisering (SRIRS) metode beskrevet af Wang et al.18. At isolere RPE-celler i mus ser ikke ud til at fungere godt i marsvinøjne. Protokollen, der beskrives her, repræsenterer en forfining af en tilgang, der oprindeligt blev prototypet med træskårne øjne af en af forfatterne (MF) og har vist sig at give RPE-prøver af høj kvalitet, der er egnede til RNA og andre molekylærbiologiske analyser, fra øjnene på unge pigmenterede marsvin19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with Slip Tip</td>
			<td>Bd Vacutainer Labware Medical</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile</td>
			<td>pectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>970-95008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific LLC</td>
			<td>1198D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>automated electrophoresis to check RNA quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Salt Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11083-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps no. 5</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540108</td>
			<td>Max. Speed: 8,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>tissue storage reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes

Denne protokol beskriver isoleringen af celler i retinale pigmentepitel (RPE) fra øjnene på unge pigmenterede marsvin med henblik på potentiel anvendelse i molekylærbiologiske undersøgelser, herunder genekspressionsanalyser. I forbindelse med øjenvækstregulering og nærsynethed spiller RPE sandsynligvis en rolle som et cellulært relæ for vækstmodulerende signaler, da det er placeret mellem nethinden og øjets to vægge, såsom choroid og sclera. Mens protokoller til isolering af RPE er blevet udviklet til både kyllinger og mus, har disse protokoller vist sig ikke at være direkte oversættelige til marsvinet, som er blevet en vigtig og udbredt pattedyrsnærsynethedsmodel. I denne undersøgelse blev molekylærbiologiske værktøjer brugt til at undersøge ekspressionen af specifikke gener for at bekræfte, at prøverne var fri for forurening fra de tilstødende væv. Værdien af denne protokol er allerede blevet demonstreret i et RNA-Seq-studie af RPE fra unge pigmenterede marsvin udsat for nærsynethedsinducerende optisk defokusering. Ud over regulering af øjenvækst har denne protokol andre potentielle anvendelser i undersøgelser af retinale sygdomme, herunder myopisk makulopati, en af de førende årsager til blindhed hos myopes, hvor RPE har været impliceret. Den største fordel ved denne teknik er, at den er relativt enkel og en gang perfektioneret, giver RPE-prøver af høj kvalitet, der er egnede til molekylærbiologiske undersøgelser, herunder RNA-analyse.

Analysen af RPE-prøverne indsamlet ved hjælp af ovenstående protokol viste velbevaret RNA (RIN >8,0, figur 2B) med 240,2 ng ± 35,1 ng pr. øje (n = 8, NanoDrop, figur 2B). For yderligere at evaluere kvaliteten af de isolerede RPE-prøver, især fraværet af choroidale og scleral kontaminanter, undersøgte vi ekspressionen af repræsentative gener for hvert af sidstnævnte væv i RPE-prøverne19. RPE-prøverne viste en signifikant hø...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes at JoVE.com

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Vi beskriver en enkel og effektiv metode til at isolere celler i retinale pigmentepitelceller (RPE) fra øjnene på unge pigmenterede marsvin. Denne procedure giver mulighed for opfølgende molekylærbiologiske undersøgelser af den isolerede RPE, herunder genekspressionsanalyser.

Isolering af retinale pigmentepitelceller fra marsvinøjne

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Retinal pigmentepitel eller RPE er kritisk for retinal sundhed. Og at studere den isolerede RPE er afgørende for retinal sygdom. Denne metode til RPE-isolering fra marsvinet, en populær nærsynethedsmodel, hjælper med at løse det udfordrende problem.Den største fordel ved denne teknik er, at den er relativt enkel og giver RPE-prøve af høj kvalitet, der er egnet til de biologiske molekylære undersøgelser, herunder RPE-analysen. Ved perfekt at følge den demonstrerede teknik og observere, hvordan man manipulerer dissekeringsværktøjerne, kan man mestre denne procedure hurtigt med lidt øvelse. Efter humant aflivning af marsvinet og enukleering af dyrets øjne, vask straks øjnene ved at overføre dem til en 10 centimeter petriskål indeholdende sterilt fosfatbufret saltvand eller PBS.Efter vask overføres øjnene til frisk PBS-opløsning. Nu arbejder under et dissekerende mikroskop, brug en 18 gauge nål til at lave en indledende lille åbning i sclera af det ene øje, cirka en millimeter bag limbalgrænsen mellem hornhinden og sclera. Brug en saks til at fjerne det forreste segment, herunder hornhinden, iris, ciliærlegeme og krystallinsk linse.Derefter arbejder du med et resterende bageste okulært segment, brug tang til at gribe og forsigtigt trække på zonulen af Zinn, efterfulgt af at løsne nethinden fra RPE / choroid / sclera-kompleks og skrælle nethinden væk uden fragmentering. Når nethinden er helt fjernet, nedsænkes den resterende bageste øjenkop, som inkluderer RPE, choroid og sclera i en af brøndene i en 12-brøndplade, der indeholder to ml vævsopbevaringsreagens og holder den nedsænket i fem minutter. For at skylle opbevaringsreagenset væk, overfør øjenkoppen til en anden brønd fyldt med fire ml PBS i 10 sekunder, før du flytter den til en tredje brønd fyldt med to ml PBS.Før du fortsætter til det sidste RPE-isolationstrin, skal du forberede en milliliter sprøjte fyldt med PBS og fastgøre en 30 gauge nål. Tryk forsigtigt på sprøjtestemplet for at skabe en jetstrøm af PBS. Arbejd under et mikroskop, først rette denne strøm af PBS mod RPE for at gøre en lille tåre eller hul i den.Ret derefter strømmen af PBS ind i den oprettede åbning for at løsne RPE som et ark fra choroid. Efter løsrivelse af RPE fra choroid, saml RPE-cellerne i en nåleløs en milliliter sprøjte og overfør den opsamlede prøve til et 1,5 ml rør. Centrifuger røret med den opsamlede RPE ved 8.000 x g i et minut for at opnå en RPE-pellet.For prøver, der skal anvendes i RNA-analyser, kasseres supernatanten, dvs. PBS-opløsningen, og erstattes med 350 ml lysisbuffer som inkluderet i RNA-isolationssæt. Pipettér indholdet op og ned 20 gange for at blande godt og bevare prøvens kvalitet. Til langtidsopbevaring og konservering overføres prøverne til en minus 80 grader Celsius fryser.Brug et RNA-isolationssæt og følg producentens instruktioner for at isolere og indsamle RNA'et fra RPE-prøverne, før du evaluerer prøvens kvalitet via elektroforese. I vores undersøgelse viste de indsamlede RPE-prøver velbevaret RNA med et RNA-integritetstal eller RIN større end otte. Det samlede RNA-tal på omkring 240 nanogram pr. Øje.Ekspressionsniveauet for det RPE-specifikke gen, Rpe65, viste sig at være signifikant højere i RPE-prøverne end i choroid og sclera. I modsætning hertil viste RPE-prøverne minimal ekspression af det valgte choroid sclera-specifikke gen, kollagentype alfa-on, hvilket indikerer fraværet af choroidale og scleral forurenende stoffer i de isolerede RPE-prøver. Det vigtigste trin i proceduren er den glatte fjernelse af nethinden uden at efterlade noget retinalt fragment.Denne RPE-isolationsprocedure berettiger forklaring in vitro-cellekulturundersøgelser med nogle vigtige forskelle, herunder valg af medier til nedsænkning af RPE-cellerne efter isoleringen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal Transplantation af humane embryonale stamceller afledt retinal Pigment epitel celler ind i en stor-eyed Model af geografisk atrofi

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolation, kultur og genteknologi af pattedyr primære pigment epitelceller til ikke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv dissektion og kultur af primære mus Retinal Pigment Epitel celler

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Isolering af epitelceller fra human tandsække

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur af porcine retinale pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv og konsistent generering af retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra menneskelige øjne til histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Realtidsanalyse af bioenergetik i primære humane retinale pigmentepitelceller ved hjælp af respirometri med høj opløsning

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...