Name: isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00
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Cette étude est financée par la Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), un boursier postdoctoral Loris et David Rich (S.G.) et une subvention du National Eye Institute des National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).

Tous les soins et traitements utilisés dans cette étude étaient conformes à la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Berkeley.
1. Énucléation de l’œil de cobaye
<ol><li>Euthanasier un cobaye avec une injection intracardiaque de pentobarbital sodique administré sous anesth?...

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches.">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells.">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358 (2018).</li><li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia:+A+review.">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li><li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+the+retina:+Choroidal+modulation+of+refractive+state.">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control.">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li><li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia.">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+(OPN5)+in+mice.">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).</li><li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia.">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li><li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li><li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration.">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).</li><li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+age-related+macular+degeneration+(AMD):+Relationships+between+the+photoreceptor/retinal+pigment+epithelium/Bruch's+membrane/choriocapillaris+complex.">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li><li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+choroid/RPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction.">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li><li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo.">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li><li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear.">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li><li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+choroid.">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional,+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium.">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li><li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis.">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium.">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).</li><li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals.">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation.">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li></ol>

Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement de l’EPR, appropriée pour les analyses d’expression génique de l’EPR, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Les avantages de ce protocole sont qu’il produit des échantillons d’EPR de haute qualité qui sont relativement exempts de contamination, avec de l’ARN convenablement préservé pour les analyses spécifiques de l’ARN et, pourtant, est relativement simple et efficace. Alors que dans l’exemple fourni ici, les échantillons d?...

L’EPR comprend une monocouche unique de cellules pigmentées situées entre la rétine neurale et la choroïde vasculaire, et l’EPR a des rôles bien reconnus dans le développement et le maintien de la fonction rétinienne normale, y compris la phototransduction 1,2. Plus récemment, l’EPR s’est vu attribuer un rôle clé supplémentaire dans la régulation de la croissance oculaire3 et, par conséquent, dans le développement de la myopie4. Cette assignation est basée sur l’emplacement critique de l’EPR, interposé entre la rétine et la choroïde et l’acceptation désormais large que la croissance oculaire et, par conséquent, les erreurs de réfraction sont régulées localement5. On pense que le RPE joue un rôle clé en tant que relais de signaux, reliant la rétine, source supposée de signaux modulateurs de croissance, à la choroïde et à la sclérotique, les deux cibles des signaux relayés 6,7,8.
L’augmentation de la longueur axiale qui caractérise la plupart des myopies ne peut pas être considérée comme bénigne, les changements physiopathologiques impliquant la rétine, la choroïde et / ou la sclérotique représentant des conséquences inévitables et désormais bien reconnues d’un allongement oculaire excessif 7,9. Dans ce contexte, l’EPR est peut-être le plus vulnérable, car, étant un tissu non mitotique, il ne peut accueillir la chambre vitrée en expansion que par l’étirement et l’amincissement de cellules individuelles. Bien que son rôle dans les pathologies liées à la myopie, telles que la dégénérescence maculaire myope, n’ait pas encore été entièrement compris, l’EPR a été impliqué dans la pathogenèse d’un certain nombre d’autres maladies de la rétine, y compris l’atrophie géographique, l’une des principales causes de cécité, qui est associée à des anomalies documentées de la rétine, de l’EPR et de la choroïde10,11, 12.
L’isolement réussi des cellules EPR, exemptes de contamination par les tissus oculaires adjacents, ouvre potentiellement de nombreuses possibilités de recherche pour acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes sous-jacents à diverses maladies oculaires et rétiniennes. Cependant, l’isolement de l’EPR s’est avéré difficile, de nombreuses études publiées utilisant des échantillons combinés de rétine/EPR ou d’EPR/choroïde pour cette raison13,14,15. Les études impliquant l’isolement réussi de l’EPR d’une qualité adaptée aux études de biologie moléculaire ont été limitées aux yeux de poussins et de souris16,17. Par exemple, la méthode d’isolement simultané de l’EPR et de stabilisation de l’ARN (SRIRS) décrite par Wang et coll.18. Isoler les cellules EPR chez la souris ne semble pas bien fonctionner dans les yeux des cobayes. Le protocole décrit ici représente un raffinement d’une approche qui a été initialement prototypée avec des yeux de musaraigne arboricole par l’un des auteurs (M.F.) et qui s’est avérée produire des échantillons d’EPR de haute qualité, appropriés pour les analyses d’ARN et d’autres analyses de biologie moléculaire, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with Slip Tip</td>
			<td>Bd Vacutainer Labware Medical</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile</td>
			<td>pectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>970-95008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific LLC</td>
			<td>1198D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>automated electrophoresis to check RNA quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Salt Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11083-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps no. 5</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540108</td>
			<td>Max. Speed: 8,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>tissue storage reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes

Ce protocole décrit l’isolement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés pour une application potentielle dans les études de biologie moléculaire, y compris les analyses d’expression génique. Dans le contexte de la régulation de la croissance oculaire et de la myopie, l’EPR joue probablement un rôle de relais cellulaire pour les signaux modulateurs de croissance, car il est situé entre la rétine et les deux parois de l’œil, telles que la choroïde et la sclérotique. Bien que des protocoles d’isolement de l’EPR aient été développés pour les poussins et les souris, ces protocoles se sont avérés ne pas être directement transposables au cobaye, qui est devenu un modèle de myopie de mammifère important et largement utilisé. Dans cette étude, des outils de biologie moléculaire ont été utilisés pour examiner l’expression de gènes spécifiques afin de confirmer que les échantillons étaient exempts de contamination par les tissus adjacents. La valeur de ce protocole a déjà été démontrée dans une étude RNA-Seq de l’EPR de jeunes cobayes pigmentés exposés à un défocalisation optique induisant la myopie. Au-delà de la régulation de la croissance oculaire, ce protocole a d’autres applications potentielles dans les études des maladies de la rétine, y compris la maculopathie myopique, l’une des principales causes de cécité chez les myopes, dans laquelle l’EPR a été impliquée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et, une fois perfectionnée, donne des échantillons d’EPR de haute qualité adaptés aux études de biologie moléculaire, y compris l’analyse de l’ARN.

L’analyse des échantillons d’EPR recueillis à l’aide du protocole ci-dessus a montré un ARN bien conservé (RIN >8.0, Figure 2B), avec 240,2 ng ± 35,1 ng par œil (n = 8, NanoDrop, Figure 2B). Pour évaluer davantage la qualité des échantillons d’EPR isolés, en particulier l’absence de contaminants choroïdiens et scléraux, nous avons examiné l’expression de gènes représentatifs pour chacun de ces derniers tissus dans les échantillons d?...

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Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

L’épithélium pigmentaire rétinien ou EPR est essentiel pour la santé de la rétine. Et l’étude de l’EPR isolé est cruciale pour la maladie de la rétine. Cette méthode d’isolement de l’EPR du cobaye, un modèle populaire de myopie, aide à résoudre le problème difficile.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et donne un échantillon d’EPR de haute qualité adapté aux études moléculaires biologiques, y compris l’analyse RPE. En suivant parfaitement la technique démontrée et en observant comment manipuler les outils de dissection, on peut maîtriser cette procédure rapidement avec un peu de pratique. Après avoir euthanasié sans cruauté le cochon d’Inde et énucléé les yeux de l’animal, lavez immédiatement les yeux en les transférant dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS.Après le lavage, transférer les yeux dans une solution de PBS fraîche. Maintenant sous un microscope à dissection, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire une petite ouverture initiale dans la sclérotique d’un œil, à environ un millimètre derrière la limite limbique entre la cornée et la sclérotique. À l’aide de ciseaux, retirez le segment antérieur, y compris la cornée, l’iris, le corps ciliaire et le cristallin.Ensuite, en travaillant avec un segment oculaire postérieur restant, utilisez une pince pour saisir et tirer doucement sur la zonule de Zinn, puis détachez la rétine du complexe EPR / choroïde / sclérotique et décollez la rétine sans fragmentation. Une fois la rétine complètement retirée, immergez le cupule postérieur restant, qui comprend l’EPR, la choroïde et la sclérotique, dans l’un des puits d’une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de réactif de stockage de tissus et maintenez-le immergé pendant cinq minutes. Pour rincer le réactif de stockage, transférez l’œilleton dans un autre puits rempli de quatre millilitres de PBS pendant 10 secondes avant de le déplacer vers un troisième puits rempli de deux millilitres de PBS.Avant de passer à l’étape finale d’isolement de l’EPR, préparez une seringue d’un millilitre remplie de PBS et fixez une aiguille de calibre 30. Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour créer un flux de PBS. En travaillant sous un microscope, dirigez d’abord ce flux de PBS vers l’EPR pour y faire une petite déchirure ou un trou.Ensuite, dirigez le flux de PBS dans l’ouverture créée pour détacher le RPE sous forme de feuille de la choroïde. Après avoir détaché l’EPR de la choroïde, recueillir les cellules EPR dans une seringue d’un millilitre sans aiguille et transférer l’échantillon prélevé dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube avec l’EPR recueilli à 8 000 x g pendant une minute pour obtenir une pastille d’EPR.Pour les échantillons à utiliser dans les analyses d’ARN, jetez le surnageant, c’est-à-dire la solution PBS, et remplacez-le par 350 millilitres de tampon de lyse inclus dans les kits d’isolement d’ARN. Pipeter le contenu de haut en bas 20 fois pour bien mélanger et préserver la qualité de l’échantillon. Pour l’entreposage et la conservation à long terme, transférer les échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.Utilisez une trousse d’isolement de l’ARN et suivez les instructions du fabricant pour isoler et prélever l’ARN des échantillons d’EPR avant d’évaluer la qualité de l’échantillon par électrophorèse. Dans notre étude, les échantillons d’EPR collectés ont montré un ARN bien conservé ayant un nombre d’intégrité de l’ARN ou un NIR supérieur à huit. Le nombre total d’ARN est d’environ 240 nanogrammes par œil.Le niveau d’expression du gène spécifique de l’EPR, Rpe65, s’est avéré significativement plus élevé dans les échantillons d’EPR que dans la choroïde et la sclérotique. En revanche, les échantillons d’EPR ont montré une expression minimale du gène spécifique de la sclérotique choroïde sélectionné, le collagène de type alpha-one, indiquant l’absence de contaminants choroïdiens et scléraux dans les échantillons isolés d’EPR. L’étape la plus importante de la procédure est l’élimination en douceur de la rétine sans laisser de fragment de rétine.Cette procédure d’isolement de l’EPR justifie une explication des études de culture cellulaire in vitro avec quelques différences importantes, y compris le choix du milieu pour l’immersion des cellules EPR après l’isolement.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Recherche

Biologie

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

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Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

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Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

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The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Analyse en temps réel de la bioénergétique dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines primaires à l’aide de la respirométrie à haute résolution

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