Name: isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00
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Diese Studie wird von der Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), einem Loris and David Rich Postdoctoral Scholar (S.G.) und einem Stipendium des National Eye Institute of the National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).

Alle Tierpflege- und -behandlungen, die in dieser Studie verwendet wurden, entsprachen der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Die Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of California, Berkeley, genehmigt.
1. Enukleation des Meerschweinchenauges
<ol><li>Euthanasieren Sie ein Meerschweinchen mit einer intrakardialen Injektion von Natrium-Pentobarbital, das unter Narkose verabreicht wird (5% Isofluran ...

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches.">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells.">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358 (2018).</li><li>Rymer, J., Wildsoet, C. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional,+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium.">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li><li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis.">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium.">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).</li><li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals.">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation.">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li></ol>

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von RPE, die für RPE-Genexpressionsanalysen geeignet ist, aus den Augen junger, pigmentierter Meerschweinchen. Die Vorteile dieses Protokolls bestehen darin, dass es qualitativ hochwertige RPE-Proben liefert, die relativ frei von Kontaminationen sind, wobei die RNA für RNA-spezifische Analysen geeignet konserviert ist und dennoch relativ einfach und effizient ist. Während in dem hier gezeigten Beispiel die RPE-Proben aus den Augen eines jungen (2 Wochen alt...

Das RPE besteht aus einer einzigartigen Monoschicht pigmentierter Zellen, die sich zwischen der neuralen Netzhaut und der vaskulären Aderhaut befinden, und die RPE spielt eine anerkannte Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer normalen Netzhautfunktion, einschließlich der Phototransduktion 1,2. In jüngerer Zeit wurde dem RPE eine zusätzliche Schlüsselrolle bei der Regulation des Augenwachstums3 und damit bei der Entwicklung von Myopie4 zugewiesen. Diese Zuordnung basiert auf der kritischen Lokalisation des RPE, die zwischen Netzhaut und Aderhaut liegt, und der mittlerweile weit verbreiteten Akzeptanz, dass das Augenwachstum und damit die Brechungsfehler lokal reguliert werden5. Es wird angenommen, dass das RPE eine Schlüsselrolle als Signalrelais spielt, das die Netzhaut, die angenommene Quelle wachstumsmodulatorischer Signale, mit der Aderhaut und der Sklera, den beiden Zielen der weitergeleiteten Signale 6,7,8, verbindet.
Die Zunahme der axialen Länge, die für die meisten Myopien charakteristisch ist, kann nicht als gutartig angesehen werden, wobei pathophysiologische Veränderungen der Netzhaut, der Aderhaut und/oder der Sklera unvermeidliche und inzwischen allgemein anerkannte Folgen einer übermäßigen Augendehnung darstellen 7,9. In diesem Zusammenhang ist das RPE vielleicht am anfälligsten, da es als nichtmitotisches Gewebe nur durch Dehnung und Ausdünnung einzelner Zellen in der Lage ist, die expandierende Glaskörperkammer aufzunehmen. Während seine Rolle bei Myopie-bedingten Pathologien, wie der myopischen Makuladegeneration, noch nicht vollständig verstanden ist, wurde das RPE in die Pathogenese einer Reihe anderer Netzhauterkrankungen verwickelt, einschließlich der geografischen Atrophie, einer der Hauptursachen für Erblindung, die mit dokumentierten Anomalien in der Netzhaut, RPE und Aderhaut verbunden ist10,11, 12. Sonstiges
Die erfolgreiche Isolierung von RPE-Zellen, die frei von Verunreinigungen aus benachbarten Augengeweben sind, eröffnet potenziell viele Forschungsmöglichkeiten, um neue Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die einer Vielzahl von Augen-/Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Isolierung des RPE hat sich jedoch als schwierig erwiesen, da viele veröffentlichte Studien aus diesem Grund kombinierte Netzhaut/RPE- oder RPE/Aderhautproben verwenden13,14,15. Studien, die die erfolgreiche Isolierung des RPE in einer für molekularbiologische Studien geeigneten Qualität beinhalteten, beschränkten sich auf Küken- und Mäuseaugen16,17. Zum Beispiel die von Wang et al.18 beschriebene Methode der simultanen RPE-Isolierung und RNA-Stabilisierung (SRIRS). Die Isolierung von RPE-Zellen in Mäusen scheint in Meerschweinchenaugen nicht gut zu funktionieren. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine Verfeinerung eines Ansatzes dar, der ursprünglich von einem der Autoren (M.F.) mit Baumspitzmausaugen prototypisiert wurde und nachweislich qualitativ hochwertige RPE-Proben aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen liefert, die für RNA- und andere molekularbiologische Analysen geeignet sind19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with Slip Tip</td>
			<td>Bd Vacutainer Labware Medical</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile</td>
			<td>pectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>970-95008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific LLC</td>
			<td>1198D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>automated electrophoresis to check RNA quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Salt Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11083-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps no. 5</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540108</td>
			<td>Max. Speed: 8,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>tissue storage reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen für eine mögliche Anwendung in molekularbiologischen Studien, einschließlich Genexpressionsanalysen. Im Zusammenhang mit der Regulation des Augenwachstums und der Myopie spielt das RPE wahrscheinlich eine Rolle als zelluläres Relais für wachstumsmodulatorische Signale, da es sich zwischen der Netzhaut und den beiden Wänden des Auges, wie der Aderhaut und der Sklera, befindet. Während Protokolle zur Isolierung des RPE sowohl für Küken als auch für Mäuse entwickelt wurden, haben sich diese Protokolle als nicht direkt auf das Meerschweinchen übertragbar erwiesen, das zu einem wichtigen und weit verbreiteten Myopiemodell für Säugetiere geworden ist. In dieser Studie wurden molekularbiologische Werkzeuge verwendet, um die Expression bestimmter Gene zu untersuchen, um zu bestätigen, dass die Proben frei von Verunreinigungen aus den angrenzenden Geweben waren. Der Wert dieses Protokolls wurde bereits in einer RNA-Seq-Studie zu RPE von jungen pigmentierten Meerschweinchen nachgewiesen, die einer Myopie-induzierenden optischen Defokussierung ausgesetzt waren. Neben der Regulierung des Augenwachstums hat dieses Protokoll weitere potenzielle Anwendungen in Studien zu Netzhauterkrankungen, einschließlich der myopischen Makulopathie, einer der Hauptursachen für Erblindung bei Myopen, an der das RPE beteiligt ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach ist und nach ihrer Perfektionierung qualitativ hochwertige RPE-Proben liefert, die für molekularbiologische Studien, einschließlich RNA-Analysen, geeignet sind.

Die Analyse der RPE-Proben, die mit dem obigen Protokoll gesammelt wurden, zeigte eine gut erhaltene RNA (RIN >8.0, Abbildung 2B) mit 240,2 ng ± 35,1 ng pro Auge (n = 8, NanoDrop, Abbildung 2B). Um die Qualität der isolierten RPE-Proben, insbesondere das Fehlen von Aderhaut- und Sklerakontaminanten, weiter zu bewerten, untersuchten wir die Expression repräsentativer Gene für jedes der letztgenannten Gewebe in den RPE-Proben19. Die RP...

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Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Retinales Pigmentepithel oder RPE ist entscheidend für die Gesundheit der Netzhaut. Und die Untersuchung des isolierten RPE ist entscheidend für die Netzhauterkrankung. Diese Methode der RPE-Isolierung aus dem Meerschweinchen, ein beliebtes Myopiemodell, hilft bei der Lösung des herausfordernden Problems.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach ist und qualitativ hochwertige RPE-Proben liefert, die für die biologischen molekularen Studien einschließlich der RPE-Analyse geeignet sind. Wenn man die demonstrierte Technik perfekt befolgt und beobachtet, wie man die Sezierwerkzeuge manipuliert, kann man dieses Verfahren mit etwas Übung schnell beherrschen. Nachdem Sie das Meerschweinchen human eingeschläfert und die Augen des Tieres enukleiert haben, waschen Sie die Augen sofort, indem Sie sie in eine 10-Zentimeter-Petrischale geben, die sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS enthält.Übertragen Sie die Augen nach dem Waschen in eine frische PBS-Lösung. Verwenden Sie nun unter einem Präpariermikroskop eine 18-Gauge-Nadel, um eine erste kleine Öffnung in der Sklera eines Auges zu machen, etwa einen Millimeter hinter der Limbusgrenze zwischen Hornhaut und Sklera. Entfernen Sie mit einer Schere das vordere Segment, einschließlich der Hornhaut, der Iris, des Ziliarkörpers und der Augenlinse.Arbeiten Sie dann mit einem verbleibenden hinteren Augensegment, greifen Sie mit einer Pinzette nach der Zonule von Zinn und ziehen Sie sanft daran, gefolgt von der Ablösung der Netzhaut vom RPE / Aderhaut / Sklera-Komplex und dem Abschälen der Netzhaut ohne Fragmentierung. Nachdem die Netzhaut vollständig entfernt wurde, tauchen Sie die verbleibende hintere Augenmuschel, die das RPE, die Aderhaut und die Sklera enthält, in eine der Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die zwei Milliliter Gewebespeicherreagenz enthält, und lassen Sie sie fünf Minuten lang eintauchen. Um das Speicherreagenz wegzuspülen, geben Sie die Augenmuschel 10 Sekunden lang in eine andere Vertiefung, die mit vier Millilitern PBS gefüllt ist, bevor Sie sie in eine dritte Vertiefung geben, die mit zwei Millilitern PBS gefüllt ist.Bevor Sie mit dem letzten RPE-Isolationsschritt fortfahren, bereiten Sie eine mit PBS gefüllte Ein-Milliliter-Spritze vor und bringen Sie eine 30-Gauge-Nadel an. Drücken Sie vorsichtig auf den Spritzenkolben, um einen Jetstream von PBS zu erzeugen. Wenn Sie unter einem Mikroskop arbeiten, richten Sie diesen PBS-Strom zunächst auf das RPE, um einen kleinen Riss oder ein Loch darin zu hinterlassen.Richten Sie dann den PBS-Strom in die erzeugte Öffnung, um das RPE als Blatt von der Aderhaut zu lösen. Nachdem Sie das RPE von der Aderhaut gelöst haben, sammeln Sie die RPE-Zellen in einer nadellosen Ein-Milliliter-Spritze und überführen Sie die gesammelte Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit dem gesammelten RPE bei 8.000 x g eine Minute lang, um ein RPE-Pellet zu erhalten.Für Proben, die in RNA-Analysen verwendet werden sollen, wird der Überstand, d. h. die PBS-Lösung, verworfen und durch 350 Milliliter Lysepuffer ersetzt, wie er in RNA-Isolationskits enthalten ist. Pipettieren Sie den Inhalt 20 Mal nach oben und unten, um sich gut zu mischen und die Qualität der Probe zu erhalten. Zur Langzeitlagerung und -konservierung die Proben in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius überführen.Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die RNA aus den RPE-Proben zu isolieren und zu sammeln, bevor Sie die Qualität der Probe durch Elektrophorese bewerten. In unserer Studie zeigten die gesammelten RPE-Proben gut erhaltene RNA mit einer RNA-Integritätszahl oder RIN von mehr als acht. Die Gesamt-RNA-Zahl beträgt etwa 240 Nanogramm pro Auge.Das Expressionsniveau des RPE-spezifischen Gens Rpe65 war in den RPE-Proben signifikant höher als in Aderhaut und Sklera. Im Gegensatz dazu zeigten die RPE-Proben eine minimale Expression des ausgewählten Aderhaut-Sklera-spezifischen Gens, Kollagen Typ alpha-on, was auf das Fehlen von Aderhaut- und Sklerakontaminanten in den isolierten RPE-Proben hinweist. Der wichtigste Schritt des Eingriffs ist die sanfte Entfernung der Netzhaut, ohne ein Netzhautfragment zu hinterlassen.Dieses RPE-Isolationsverfahren rechtfertigt eine Erklärung in vitro Zellkulturstudien mit einigen wichtigen Unterschieden, einschließlich der Wahl des Mediums zum Eintauchen der RPE-Zellen nach der Isolierung.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Forschung

Biologie

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Isolierung von Epithelzellen aus dem menschlichen Zahnfollikel

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...