Name: isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00
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이 연구는 일본 과학 진흥 협회 해외 연구 펠로우십(S.G.), Loris and David Rich 박사후 연구원(S.G.) 및 국립 보건원 국립 안과 연구소(R01EY012392; C.F.W.)입니다.

이 연구에 사용된 모든 동물 관리 및 치료는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다. 실험 프로토콜은 University of California, Berkeley의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 기니피그 눈의 적출술
<ol><li>마취하에 전달되는 나트륨 펜토바르비탈의 심장 내 주사로 기니피그를 안락사시킵니다(산소 중 5% 이소플루란).</li>
	<li>?...

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches.">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells.">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358 (2018).</li><li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia:+A+review.">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li><li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+the+retina:+Choroidal+modulation+of+refractive+state.">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control.">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li><li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia.">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+(OPN5)+in+mice.">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).</li><li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia.">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li><li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li><li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration.">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).</li><li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+age-related+macular+degeneration+(AMD):+Relationships+between+the+photoreceptor/retinal+pigment+epithelium/Bruch's+membrane/choriocapillaris+complex.">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li><li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+choroid/RPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction.">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li><li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo.">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li><li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear.">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li><li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+choroid.">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional,+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium.">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li><li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis.">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium.">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).</li><li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals.">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation.">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li></ol>

이 기사에서는 어린 색소 기니피그의 눈에서 RPE 유전자 발현 분석에 적합한 RPE를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 RNA가 RNA 특이적 분석에 적합하게 보존되어 상대적으로 오염이 없는 고품질 RPE 샘플을 생성하면서도 비교적 간단하고 효율적이라는 것입니다. 여기에 제공된 예에서 RPE 샘플은 어린(2주령) 기니피그의 눈에서 수집되었지만 프로토콜은 나이가 많은(젊은 성인) 동물...

RPE는 신경 망막과 혈관 맥락막 사이에 위치한 색소 세포의 독특한 단층으로 구성되며, RPE는 광형질도입 1,2을 포함하여 정상적인 망막 기능의 발달 및 유지에 잘 알려진 역할을 합니다. 최근에, RPE는 눈 성장 조절3 및 근시 4의 발달에 추가적인 핵심 역할을 할당받았다. 이 할당은 망막과 맥락막 사이에 개재된 RPE의 중요한 위치와 눈의 성장과 굴절 이상이 국소적으로 조절된다는 현재 널리 받아들여지고 있는 것을 기반으로 합니다5. RPE는 성장 조절 신호의 원천으로 추정되는 망막을 중계 신호의 두 표적인 맥락막과 공막에 연결하는 신호 중계자로서 핵심적인 역할을 하는 것으로 여겨집니다(6,7,8).
대부분의 근시를 특징짓는 축 길이의 증가는 양성으로 간주될 수 없으며, 망막, 맥락막 및/또는 공막과 관련된 병태생리학적 변화는 과도한 안구 신장의 피할 수 없고 현재 잘 알려진 결과를 나타냅니다 7,9. 이러한 맥락에서 RPE는 비유사분열 조직이기 때문에 개별 세포의 스트레칭 및 얇아짐에 의해서만 확장되는 유리체실을 수용할 수 있기 때문에 아마도 가장 취약할 것입니다. 근시성 황반변성과 같은 근시 관련 병리에서의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았지만, RPE는 망막, RPE 및 맥락막의 문서화된 이상과 관련된 실명의 주요 원인 중 하나인 지리적 위축을 포함한 여러 다른 망막 질환의 발병기전과 관련이 있습니다10,11, 12.
인접한 안구 조직의 오염이 없는 RPE 세포의 성공적인 분리는 잠재적으로 다양한 눈/망막 질환의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 많은 연구 기회를 열어줍니다. 그러나 RPE의 분리는 어려운 것으로 입증되었으며, 이러한 이유로 결합된 망막/RPE 또는 RPE/맥락막 샘플을 사용하는 많은 발표된 연구에서 13,14,15. 분자 생물학 연구에 적합한 품질의 RPE의 성공적인 분리와 관련된 연구는 병아리와 생쥐의 눈으로 제한되었다16,17. 예를 들어, Wang et al.18에 의해 기술된 동시 RPE 분리 및 RNA 안정화 (SRIRS) 방법. 생쥐에서 RPE 세포를 분리하는 것은 기니피그 눈에서 잘 작동하지 않는 것으로 보입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 저자 중 한 명(M.F.)이 처음에 나무 뒤쥐 눈으로 프로토타입을 만든 접근 방식을 개선한 것으로, 어린 색소 기니피그의 눈에서 RNA 및 기타 분자 생물학 분석에 적합한 고품질 RPE 샘플을 산출하는 것으로 입증되었습니다19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with Slip Tip</td>
			<td>Bd Vacutainer Labware Medical</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile</td>
			<td>pectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>970-95008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific LLC</td>
			<td>1198D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>automated electrophoresis to check RNA quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Salt Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11083-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps no. 5</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540108</td>
			<td>Max. Speed: 8,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>tissue storage reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes

이 프로토콜은 유전자 발현 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 잠재적으로 적용하기 위해 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포를 분리하는 것을 설명합니다. 눈 성장 조절 및 근시의 맥락에서 RPE는 망막과 맥락막 및 공막과 같은 눈의 두 벽 사이에 위치하기 때문에 성장 조절 신호에 대한 세포 중계자 역할을 할 가능성이 높습니다. RPE를 분리하기 위한 프로토콜은 병아리와 생쥐 모두를 위해 개발되었지만 이러한 프로토콜은 중요하고 널리 사용되는 포유류 근시 모델이 된 기니피그로 직접 번역할 수 없는 것으로 입증되었습니다. 이 연구에서는 분자 생물학 도구를 사용하여 특정 유전자의 발현을 검사하여 샘플에 인접 조직의 오염이 없는지 확인했습니다. 이 프로토콜의 가치는 근시를 유발하는 광학 디포커스에 노출된 어린 색소 기니피그의 RPE에 대한 RNA-Seq 연구에서 이미 입증되었습니다. 눈 성장 조절 외에도 이 프로토콜은 RPE가 연루된 근시 실명의 주요 원인 중 하나인 근시 황반병증을 포함하여 망막 질환 연구에 다른 잠재적인 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 일단 완성되면 RNA 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다.

위의 프로토콜을 사용하여 수집된 RPE 샘플의 분석은 눈당 240.2ng ± 35.1ng(n = 8, NanoDrop, 그림 2B)으로 잘 보존된 RNA(RIN(RIN)>8.0, 그림 2B)를 보여주었습니다. 분리된 RPE 샘플의 품질, 특히 맥락막 및 공막 오염 물질의 부재를 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 RPE 샘플19에서 후자의 조직 각각에 대한 대표 유전자의 발현을 조사하였다. RPE ?...

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Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

우리는 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포를 분리하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 유전자 발현 분석을 포함하여 분리된 RPE에 대한 후속 분자 생물학 연구가 가능합니다.

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

망막 색소 상피 또는 RPE는 망막 건강에 매우 중요합니다. 그리고 분리된 RPE를 연구하는 것은 망막 질환에 매우 중요합니다. 인기 있는 근시 모델인 기니피그에서 RPE를 분리하는 이 방법은 어려운 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 RPE 분석을 포함한 생물학적 분자 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다. 시연 된 기술을 완벽하게 따르고 해부 도구를 조작하는 방법을 관찰함으로써 약간의 연습으로이 절차를 빠르게 마스터 할 수 있습니다. 기니피그를 인도적으로 안락사시키고 동물의 눈을 적출 한 후 즉시 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS가 들어있는 10cm 페트리 접시에 옮겨 눈을 씻으십시오.세척 후 눈을 신선한 PBS 용액으로 옮깁니다. 이제 해부 현미경으로 작업하면서 18 게이지 바늘을 사용하여 각막과 공막 사이의 윤부 경계에서 약 1mm 뒤에있는 한쪽 눈의 공막에 초기 작은 구멍을 만듭니다. 가위를 사용하여 각막, 홍채, 모양체 및 수정체를 포함한 앞쪽 부분을 제거합니다.그런 다음 나머지 후방 안구 분절로 작업하여 집게를 사용하여 Zinn의 구역을 잡고 부드럽게 잡아당긴 다음 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 분리하고 단편화 없이 망막을 벗겨냅니다. 망막이 완전히 제거된 후 RPE, 맥락막 및 공막을 포함하는 나머지 후방 안구 컵을 2밀리리터의 조직 저장 시약이 들어 있는 12웰 플레이트의 웰 중 하나에 담그고 5분 동안 담그십시오. 보관 시약을 헹구기 위해 아이컵을 4밀리리터의 PBS로 채워진 다른 웰로 10초 동안 옮긴 후 2밀리리터의 PBS로 채워진 세 번째 웰로 옮깁니다.최종 RPE 격리 단계를 진행하기 전에 PBS로 채워진 1밀리리터 주사기를 준비하고 30게이지 바늘을 부착합니다. 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 PBS의 제트 기류를 만듭니다. 현미경으로 작업하면서 먼저 이 PBS 스트림을 RPE로 조준하여 작은 찢어짐이나 구멍을 만듭니다.그런 다음 PBS 스트림을 생성된 개구부로 유도하여 맥락막에서 시트로 RPE를 분리합니다. 맥락막에서 RPE를 분리한 후 바늘이 없는 1밀리리터 주사기에 RPE 세포를 수집하고 수집된 샘플을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수집된 RPE를 8, 000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RPE 펠릿을 얻었다.RNA 분석에 사용할 샘플의 경우 상층액, 즉 PBS 용액을 버리고 RNA 분리 키트에 포함된 350ml의 용해 완충액으로 교체합니다. 내용물을 위아래로 20회 피펫하여 잘 섞이고 샘플의 품질을 보존합니다. 장기 보관 및 보존을 위해 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고로 옮깁니다.전기영동을 통해 시료의 품질을 평가하기 전에 RNA 분리 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 RPE 시료에서 RNA를 분리하고 수집합니다. 본 연구에서, 수집된 RPE 샘플은 RNA 완전성 수 또는 RIN이 8보다 큰 잘 보존된 RNA를 보여주었다. 눈당 약 240나노그램의 총 RNA 수.RPE 특이적 유전자인 Rpe65의 발현 수준은 맥락막 및 공막에서보다 RPE 샘플에서 유의하게 더 높은 것으로 밝혀졌습니다. 대조적으로, RPE 샘플은 선별된 맥락막 공막 특이적 유전자인 콜라겐 유형 알파-온의 최소 발현을 보여주었으며, 이는 분리된 RPE 샘플에서 맥락막 및 공막 오염 물질이 없음을 나타냅니다. 절차의 가장 중요한 단계는 망막 조각을 남기지 않고 망막을 부드럽게 제거하는 것입니다.이 RPE 분리 절차는 분리 후 RPE 세포를 담그기 위한 배지 선택을 포함하여 몇 가지 중요한 차이점이 있는 시험관 내 세포 배양 연구에 대한 설명을 보증합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

연구

생물학

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...