Name: isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes at JoVE.com

Bu çalışma, Japonya Bilimin Desteklenmesi Derneği Denizaşırı Araştırma Bursu (SG), Loris ve David Rich Doktora Sonrası Bursu (SG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü'nden (R01EY012392; C.F.W.)

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan bakımı ve tedavileri, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'na uygundur. Deneysel protokoller, Berkeley'deki Kaliforniya Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Gine domuzu gözünün enükleasyonu
<ol><li>Anestezi altında verilen intrakardiyak sodyum pentobarbital enjeksiyonu ile bir gine domuzu ötenazi yapın (oksijende% 5 izofluran).</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches.">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells.">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358 (2018).</li><li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia:+A+review.">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li><li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+the+retina:+Choroidal+modulation+of+refractive+state.">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control.">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li><li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia.">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+(OPN5)+in+mice.">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).</li><li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia.">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li><li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li><li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration.">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).</li><li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+age-related+macular+degeneration+(AMD):+Relationships+between+the+photoreceptor/retinal+pigment+epithelium/Bruch's+membrane/choriocapillaris+complex.">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li><li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+choroid/RPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction.">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li><li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo.">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li><li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear.">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li><li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+choroid.">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional,+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium.">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li><li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis.">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li><li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium.">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).</li><li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals.">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation.">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li></ol>

Bu makalede, RPE gen ekspresyon analizleri için uygun olan RPE'yi genç, pigmentli kobayların gözünden izole etmek için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu protokolün esası, RNA'nın RNA'ya özgü analizler için uygun şekilde korunduğu ve yine de nispeten basit ve verimli olduğu için, nispeten kontaminasyondan arındırılmış yüksek kaliteli RPE örnekleri vermesidir. Burada verilen örnekte, RPE örnekleri genç (2 haftalık) bir kobayın gözünden toplanırken, protokol yaşlı (genç yetişkin) hayvanlar...

RPE, nöral retina ve vasküler koroid arasında yer alan pigmentli hücrelerin benzersiz bir tek katmanından oluşur ve RPE, fototransdüksiyon 1,2 de dahil olmak üzere normal retina fonksiyonunun geliştirilmesinde ve sürdürülmesinde iyi bilinen rollere sahiptir. Daha yakın zamanlarda, RPE'ye göz büyümesi düzenlemesi3'te ve dolayısıyla miyopi4'ün gelişiminde ek bir anahtar rol verilmiştir. Bu atama, RPE'nin retina ve koroid arasına yerleştirilen kritik konumuna ve göz büyümesinin ve dolayısıyla kırma kusurlarının yerel olarak düzenlendiği yönündeki geniş kabule dayanmaktadır5. RPE'nin, büyüme modülatörü sinyallerin varsayılan kaynağı olan retinayı, iletilen sinyallerin iki hedefi olan koroid ve skleraya bağlayan bir sinyal rölesi olarak kilit bir rol oynadığına inanılmaktadır 6,7,8.
Çoğu miyopiyi karakterize eden aksiyel uzunluktaki artış iyi huylu olarak kabul edilemez, retina, koroid ve / veya sklerasa içeren patofizyolojik değişiklikler aşırı oküler uzamanın kaçınılmaz ve şimdi iyi bilinen sonuçlarını temsil eder 7,9. Bu bağlamda, RPE belki de en savunmasız olanıdır, çünkü mitotik olmayan bir doku olarak, genişleyen vitreus odasını ancak bireysel hücrelerin gerilmesi ve inceltilmesiyle barındırabilir. Miyop makula dejenerasyonu gibi miyopi ile ilişkili patolojilerdeki rolü henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, RPE, retina, RPE ve koroid10,11'de belgelenmiş anormalliklerle ilişkili olan körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan coğrafi atrofi de dahil olmak üzere bir dizi başka retina hastalığının patogenezinde rol oynamıştır. 12.
RPE hücrelerinin komşu oküler dokulardan kontaminasyondan arındırılmış başarılı izolasyonu, çeşitli göz / retina hastalıklarının altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler edinmek için potansiyel olarak birçok araştırma fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, RPE'nin izolasyonunun zor olduğu kanıtlanmıştır, bu nedenle kombine retina / RPE veya RPE / koroid örneklerini kullanan birçok yayınlanmış çalışma ile13,14,15. Moleküler biyoloji çalışmalarına uygun kalitede RPE'nin başarılı bir şekilde izole edilmesini içeren çalışmalar civciv ve fare gözleri ile sınırlı kalmıştır16,17. Örneğin, Wang ve ark.18 tarafından tanımlanan eşzamanlı RPE izolasyonu ve RNA stabilizasyonu (SRIRS) yöntemi. Farelerde RPE hücrelerini izole etmek, kobay gözlerinde iyi çalışmıyor gibi görünmektedir. Burada açıklanan protokol, başlangıçta yazarlardan biri (M.F.) tarafından ağaç sivri gözlerle prototiplenen ve genç pigmentli kobayların gözlerinden RNA ve diğer moleküler biyoloji analizleri için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri verdiği kanıtlanmış bir yaklaşımın iyileştirilmesini temsil etmektedir19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe with Slip Tip</td>
			<td>Bd Vacutainer Labware Medical</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile</td>
			<td>pectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>970-95008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific LLC</td>
			<td>1198D72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>automated electrophoresis to check RNA quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced Salt Solutions</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11083-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps no. 5</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic disposable needles</td>
			<td>Exelint International, Co.</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540108</td>
			<td>Max. Speed: 8,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>tissue storage reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of retinal pigment epithelial cells from guinea pig eyes

Bu protokol, retinal pigment epiteli (RPE) hücrelerinin, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere moleküler biyoloji çalışmalarında potansiyel uygulama için genç pigmentli kobayların gözlerinden izolasyonunu tanımlar. Göz büyümesinin düzenlenmesi ve miyopi bağlamında, RPE muhtemelen retina ile koroid ve sklera gibi gözün iki duvarı arasında yer aldığı için büyüme modülatör sinyalleri için hücresel bir röle olarak rol oynar. RPE'yi izole etmek için protokoller hem civcivler hem de fareler için geliştirilmiş olsa da, bu protokollerin önemli ve yaygın olarak kullanılan bir memeli miyopi modeli haline gelen kobaya doğrudan çevrilemediği kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, örneklerin bitişik dokulardan kontaminasyon içermediğini doğrulamak için spesifik genlerin ekspresyonunu incelemek için moleküler biyoloji araçları kullanılmıştır. Bu protokolün değeri, miyopiye neden olan optik defokusa maruz kalan genç pigmentli kobaylardan RPE'nin RNA-Seq çalışmasında zaten gösterilmiştir. Göz büyümesi düzenlemesinin ötesinde, bu protokolün, RPE'nin dahil olduğu miyoplarda körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan miyop makülopati de dahil olmak üzere retina hastalıklarının çalışmalarında başka potansiyel uygulamaları vardır. Bu tekniğin temel avantajı, nispeten basit olması ve bir kez mükemmelleştirildikten sonra, RNA analizi de dahil olmak üzere moleküler biyoloji çalışmaları için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri vermesidir.

Yukarıdaki protokol kullanılarak toplanan RPE örneklerinin analizi, göz başına 240.2 ng ± 35.1 ng (n = 8, NanoDrop, Şekil 2B) ile iyi korunmuş RNA (RIN >8.0, Şekil 2B) göstermiştir. İzole RPE örneklerinin kalitesini, özellikle koroidal ve skleral kirleticilerin yokluğunu daha fazla değerlendirmek için, RPE örneklerinde19 ikinci dokuların her biri için temsili genlerin ekspresyonunu inceledik. RPE örnekleri, koroid ve...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes at JoVE.com

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Retina pigment epiteli veya RPE, retina sağlığı için kritik öneme sahiptir. İzole RPE'nin incelenmesi retina hastalığı için çok önemlidir. Popüler bir miyopi modeli olan kobaydan RPE izolasyonunun bu yöntemi, zorlu problemin çözülmesine yardımcı olur.Bu tekniğin temel avantajı, nispeten basit olması ve RPE analizi de dahil olmak üzere biyolojik moleküler çalışmalara uygun yüksek kaliteli RPE örneği vermesidir. Gösterilen tekniği mükemmel bir şekilde takip ederek ve diseksiyon araçlarının nasıl manipüle edileceğini gözlemleyerek, bu prosedürde bazı uygulamalarla hızlı bir şekilde ustalaşabilirsiniz. Gine domuzu insancıl bir şekilde ötenazi yaptıktan ve hayvanın gözlerini çekirdeklendirdikten sonra, gözleri derhal steril fosfat tamponlu salin veya PBS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktararak yıkayın.Yıkadıktan sonra, gözleri taze PBS çözeltisine aktarın. Şimdi diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, bir gözün sklerasında, kornea ve sklera arasındaki limbal sınırın yaklaşık bir milimetre arkasında ilk küçük bir açıklık yapmak için 18 gauge iğne kullanın. Makas kullanarak, kornea, iris, siliyer gövde ve kristalin lens dahil olmak üzere ön segmenti çıkarın.Daha sonra kalan bir posterior oküler segment ile çalışarak, Zinn zonulünü kavramak ve nazikçe çekmek için forseps kullanın, ardından retinayı RPE / koroid / sklera kompleksinden ayırın ve retinayı parçalanmadan soyun. Retina tamamen çıkarıldıktan sonra, RPE, koroid ve sklerayı içeren kalan arka göz kabını, iki mililitre doku depolama reaktifi içeren 12 delikli bir plakanın kuyucuklarından birine daldırın ve beş dakika boyunca daldırın. Depolama reaktifini durulamak için, vizör kabını iki mililitre PBS ile doldurulmuş üçüncü bir kuyucuğa taşımadan önce 10 saniye boyunca dört mililitre PBS ile doldurulmuş başka bir kuyucuğa aktarın.Son RPE izolasyon adımına geçmeden önce, PBS ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga hazırlayın ve 30 gauge iğne takın. PBS jet akımı oluşturmak için şırınga pistonunu yavaşça itin. Bir mikroskop altında çalışarak, ilk olarak, RPE'deki bu PBS akışını, içinde küçük bir yırtık veya delik açmak için hedefleyin.Ardından, RPE'yi koroidden bir tabaka olarak ayırmak için PBS akışını oluşturulan açıklığa yönlendirin. RPE'yi koroidden ayırdıktan sonra, RPE hücrelerini iğnesiz bir mililitrelik şırıngada toplayın ve toplanan numuneyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir RPE peleti elde etmek için tüpü toplanan RPE ile 8.000 x g'de bir dakika boyunca santrifüj edin.RNA analizlerinde kullanılacak numuneler için, süpernatanı, yani PBS çözeltisini atın ve RNA izolasyon kitlerine dahil edilen 350 mililitre lizis tamponu ile değiştirin. İyice karıştırmak ve numunenin kalitesini korumak için içeriği 20 kez yukarı ve aşağı borulayın. Uzun süreli depolama ve koruma için, numuneleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın.Bir RNA izolasyon kiti kullanın ve elektroforez yoluyla numunenin kalitesini değerlendirmeden önce RNA'yı RPE numunelerinden izole etmek ve toplamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Çalışmamızda, toplanan RPE örnekleri, RNA bütünlük numarasına veya sekizden büyük RIN'ye sahip iyi korunmuş RNA gösterdi. Toplam RNA sayısı göz başına yaklaşık 240 nanogramdır.RPE spesifik gen olan Rpe65'in ekspresyon seviyesi, RPE örneklerinde koroid ve skleraya göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Buna karşılık, RPE örnekleri, izole RPE örneklerinde koroidal ve skleral kirleticilerin bulunmadığını gösteren seçilmiş koroid sklera spesifik genin, kollajen tip alfa-bir'in minimal ekspresyonunu gösterdi. İşlemin en önemli adımı, retinanın geride herhangi bir retina parçası bırakmadan düzgün bir şekilde çıkarılmasıdır.Bu RPE izolasyon prosedürü, in vitro hücre kültürü çalışmalarını, izolasyondan sonra RPE hücrelerini daldırmak için ortam seçimi de dahil olmak üzere bazı önemli farklılıklarla açıklamayı garanti eder.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Epitel Hücrelerinin İnsan Diş Foliküllerinden İzolasyonu

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...