Name: network pharmacology prediction and experimental validation of trichosanthes-fritillaria thunbergii action mechanism against lung adenocarcinoma
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00
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Cette étude a été soutenue par le Programme de formation à l’innovation de l’Université de médecine chinoise de Beijing (No: 202110026036).

Toutes les procédures de pharmacologie en réseau ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour les méthodes d’évaluation de la pharmacologie des réseaux18. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règles de gestion de laboratoire de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
1. Prédiction pharmacologique en réseau
<ol><li>Sélection des composants actifs<ol><li>Ouvrez la base de ...

En général, une étude pharmacologique de réseau complète comprend l’identification des composants actifs à partir de bases de données, l’acquisition de cibles correspondant aux composants actifs et aux maladies, la construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible, et la prédiction des cibles et des voies principales. L’association entre les composants actifs et les protéines centrales (amarrage moléculaire) est prédite de manière préliminaire par la technologie informatique, et la vérif...

Le cancer du poumon fait référence aux tumeurs malignes provenant de la muqueuse bronchique pulmonaire, y compris le carcinome épidermoïde, l’adénocarcinome, le carcinome à grandes cellules et le carcinome à petites cellules1. L’adénocarcinome du poumon (LUAD) est le type de cancer du poumon le plus courant, représentant environ 40 % du total des cas de cancer du poumon2. La plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé ou ont des métastases à distance et, par conséquent, perdent l’occasion d’une intervention chirurgicale3. Dans le traitement clinique actuel, la chimioradiothérapie concomitante est la stratégie la plus courante pour traiter LUAD, mais son application est limitée en raison d’effets indésirables graves4.
La médecine traditionnelle chinoise (MTC) peut soulager efficacement les symptômes cliniques des patients atteints de LUAD et réduire les effets indésirables causés par la radiothérapie et la chimiothérapie et est ainsi devenue un haut lieu de recherche 5,6,7. En médecine traditionnelle chinoise, le cancer du poumon appartient à la catégorie de « l’accumulation pulmonaire » et « pétreux pulmonaire ». La carence en Qi et l’interaction des mucosités, de la stase et du poison sont importantes dans la pathogenèse du cancer du poumon. Par conséquent, tonifier le Qi et éliminer les mucosités et la stase sanguine sont les principales méthodes de traitement clinique8 pour le cancer du poumon selon la théorie de la MTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) et Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) représentent une paire de médicaments commune dans le traitement du cancer du poumon, et cette combinaison a pour effet d’éliminer la chaleur et de réduire les mucosités10,11,12. Cependant, son mécanisme d’action n’est pas encore clair et d’autres recherches doivent être menées.
La pharmacologie de réseau est une méthode complète basée sur la théorie de la biologie des systèmes et la pharmacologie multidirectionnelle qui vise à révéler des relations de réseau complexes entre plusieurs médicaments et maladies13. Les prescriptions traditionnelles chinoises ont les caractéristiques d’être multi-composants et multi-cibles, ce qui signifie qu’elles sont très appropriées pour l’étude de la pharmacologie de réseau14,15. Récemment, la pharmacologie de réseau est apparue comme une approche puissante dans l’étude des formules de MTC et est devenue un point chaud de la recherche16,17.
Cependant, à notre connaissance, toutes les recherches sur la pharmacologie des réseaux sont présentées sous forme de texte. Présenter cette technologie par vidéo réduira considérablement le seuil d’apprentissage et facilitera la promotion de cette technologie, ce qui est l’un des avantages de cet article. Dans cette étude, nous avons pris Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire comme exemple pour effectuer la prédiction pharmacologique en réseau et la validation expérimentale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549&#160;cell line</td>
			<td>Procell</td>
			<td>CL-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4691S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PC0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence (ECL) kit&#160;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>RM00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>6040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14-15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory</td>
			<td>RE52CS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum freeze-drying mechanism</td>
			<td>Ningbo Scientz Biotechnology</td>
			<td>SCIENTZ-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

network pharmacology prediction and experimental validation of trichosanthes-fritillaria thunbergii action mechanism against lung adenocarcinoma

Notre objectif était d’étudier le mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) sur la base de la pharmacologie de réseau et de la vérification expérimentale. Les composants efficaces et les cibles potentielles de Trichosanthis et Fritillaria thunbergii ont été collectés par la base de données expérimentale à haut débit et guidée par référence (HERB) de la médecine traditionnelle chinoise et une base de données d’approche d’ensemble de similarité (SEA), et les cibles liées à LUAD ont été interrogées par les bases de données GeneCards et Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Un réseau médicament-composant-maladie-cible a été construit par le logiciel Cytoscape. Le réseau d’interaction protéine-protéine (PPI), la fonction d’ontologie génique (GO) et les analyses d’enrichissement des voies de l’encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) ont été effectués pour obtenir des cibles principales et des voies clés. Un extrait aqueux de cellules Trichosanthes-Fritillaria thunbergii et A549 a été utilisé pour la validation expérimentale ultérieure. Grâce à la base de données HERB et à la recherche documentaire, 31 composés efficaces et 157 gènes cibles potentiels de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ont été examinés, dont 144 étaient des cibles régulatrices de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire. L’analyse de l’enrichissement fonctionnel GO a montré que le mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire est principalement la phosphorylation des protéines. L’analyse d’enrichissement de la voie KEGG suggère que le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire par Trichosanthes-Fritillaria thunbergii implique principalement la voie de signalisation PI3K/AKT. La validation expérimentale a montré qu’un extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pouvait inhiber la prolifération des cellules A549 et la phosphorylation de l’AKT. Grâce à la pharmacologie en réseau et à la validation expérimentale, il a été vérifié que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire.

Au total, 31 composants actifs liés à Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ont été identifiés, dont 21 Trichosanthes et 10 Fritillaria thunbergia, ainsi que 144 cibles correspondantes. Au total, 9 049 et 67 gènes liés à LUAD ont été extraits de la base de données GeneCards et de la base de données OMIM, respectivement. Après suppression des gènes dupliqués, 9 057 gènes liés à LUAD ont été identifiés. L’intersection des gènes liés à LUAD et des cibles liées au composa...

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Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Cette étude révèle le mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire basé sur la pharmacologie de réseau et la vérification expérimentale. L’étude démontre également que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire.

Prédiction pharmacologique en réseau et validation expérimentale du mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Médecine traditionnelle chinoise, Nous parlerons des caractéristiques de multicomposant de la cible. Ce qui est la boîte de base pour la recherche en réseau et biologique. Nous avons fait une démonstration de la technologie qui réduira le seuil.Network Pharmacological est une technologie analytique systématique, construit les outils de travail de réseau d’interaction de multifacteurs. Il peut prédire efficacement la voie unique de la médecine traditionnelle chinoise dans Les données de Network Pharmacological proviennent de la base de données, bien qu’il ne puisse pas prédire la relation avec les médicaments, les protéines, et cela doit encore être vérifié par des expériences ultérieures. Pour commencer, ouvrez la base de données HERB et utilisez Gua Liu et Zhebimu comme mots-clés pour obtenir les composants des deux médicaments.Téléchargez la liste et la structure SMILES canonique des composants associés des deux médicaments. Déterminez maintenant si le composant obtenu est actif en incluant les composants ayant une biodisponibilité orale et des valeurs analogues à celles d’un médicament dans la base de données du groupe HERB. Si le composant n’a pas de biodisponibilité orale et de valeurs médicamenteuses, entrez le composant dans la base de données suisse ADME pour obtenir les informations sur chaque composant.Inclure les composants ayant une absorption gastro-intestinale élevée et au moins deux valeurs semblables à celles d’un médicament oui en tant que composants actifs. Pour prédire la cible des composants actifs, ouvrez la base de données HERB. Recherchez et copiez les structures SMILES canoniques des composants actifs.Ouvrez ensuite l’approche d’ensemble de similarité et collez les structures SMILES canoniques des composants actifs dans la zone de recherche. Cliquez sur try SEA' pour obtenir la valeur P du nom de cible de la clé cible et le TC maximum de chaque composant actif. Copiez les données dans une feuille de calcul et utilisez la fonction de filtrage des fichiers de feuille de calcul pour filtrer les cibles des composants actifs par clé cible.Copiez toutes les cibles dans une feuille de calcul et supprimez les doublons pour obtenir les cibles médicamenteuses. Ouvrez maintenant la base de données des cartes génétiques et l’héritage mendélien en ligne chez l’homme pour prédire les cibles de la maladie. Utilisez Adénocarcinome pulmonaire comme mot-clé pour obtenir les cibles de la maladie de l’adénocarcinome pulmonaire.Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie et supprimez les cibles répétées, pour obtenir les cibles de l’adénocarcinome pulmonaire. Construisez un réseau de cibles de maladies constitutives d’un médicament en copiant les cibles liées à l’adénocarcinome pulmonaire et les cibles médicamenteuses dans la même colonne, dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction d’identification des doublons de données, dans la barre d’outils pour obtenir des cibles d’intersection des cibles liées à l’adénocarcinome pulmonaire et des cibles liées au composant actif de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia.Ouvrez Cytoscape 3.8.0. Cliquez sur Fichier dans la barre de menus et sélectionnez Importer. Suivi par le réseau à partir du fichier.Pour importer le fichier de feuille de calcul, optimisez la taille et la couleur des nœuds du réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche. Utilisez la fonction d’analyse du réseau pour l’analyse de la topologie du réseau. Cliquez sur Outils dans la barre de menus et sélectionnez Analyser le réseau.Dans le panneau du tableau, cliquez sur le degré dans la barre de titre pour organiser les composants par degré par ordre décroissant. Prenez les 10 principaux composants et cibles comme principaux composants actifs et cibles principales. Construire le réseau PPI et cribler les protéines de base.Ouvrez la base de données de chaînes et collez la liste au format texte des cibles potentielles de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia, contre les adénocarcinomes pulmonaires dans la boîte de dialogue de la liste des noms. Ensuite, sélectionnez les homosapiens dans les organismes. Cliquez sur les boutons de recherche et sélectionnez continuer, lorsque les résultats sont disponibles, cliquez sur paramètres et cochez confiance élevée 0,700 Dans les paramètres de base, sous le score d’interaction minimum requis, cochez les nœuds déconnectés élevés du réseau, dans les paramètres avancés.Cliquez ensuite sur le bouton de mise à jour. Ensuite, cliquez sur les exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire de la relation PPI au format TSV. Ouvrez Cytoscape 3.8.0.Cliquez sur fichier, sélectionnez, importez, puis sur le réseau à partir du fichier pour importer le fichier au format TSV pour une analyse visuelle. Utilisez la fonction d’analyseur de réseau pour effectuer l’analyse topologique. Optimisez la taille et la couleur des nœuds réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche.Effectuez l’analyse d’enrichissement KEGG en ouvrant la plateforme Medscape, en collant la liste au format texte des cibles thérapeutiques potentielles dans la boîte de dialogue, puis en cliquant sur le bouton soumettre. Cochez Homo sapiens à la fois en entrée en tant qu’espèce et en analyse en tant qu’espèce, puis cliquez sur le bouton d’analyse personnalisée. Sélectionnez l’enrichissement.Cochez uniquement la voie KEGG, puis cliquez sur analyse d’enrichissement. Une fois que la barre de progression atteint 100%, cliquez sur le bouton orange de la page du rapport d’analyse pour les résultats de l’enrichissement. Cliquez sur tout en un fichier zip pour télécharger le résultat de l’enrichissement, puis ouvrez le fichier _FINAL_GO’csv dans le dossier Enrichment_GO' pour obtenir le résultat.Ouvrez R-Software et tapez install package GG plot two’and library GG Plot two’in R Pour l’installation du paquet GG plot two R. Appuyez sur Entrée pour exécuter le programme de visualisation KEGG. Pour détecter la viabilité cellulaire, digérer les cellules logarithmiques de la phase de croissance A 549 avec un millilitre de 0,25% de trypsine pendant une minute à 37 degrés Celsius.Ajouter un millilitre de DMEM Milieu Complet pour neutraliser la trypsine et souffler doucement pour favoriser l’excrétion cellulaire. Ensuite, centrifuger le mélange pour obtenir la pastille cellulaire et remettre en suspension les cellules obtenues, en utilisant DMEM Complete Medium. Ajouter la suspension cellulaire à un hémocytomètre et compter à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, diluer à cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre, en utilisant le milieu complet DMEM Maintenant, dissoudre un gramme d’extrait d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia dans 10 millilitres de PBS et le filtrer stériliser à travers un filtre de 0,22 micromètre.Diluer le mélange à différentes concentrations à l’aide de PBS. Plaquer 100 microlitres des cellules diluées dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Après l’adhérence cellulaire, ajoutez un microlitre d’extraits d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia de différentes concentrations pour ajuster la concentration de chaque puits.Jeter le milieu d’origine après 24 heures de culture et ajouter 100 microlitres de DMEM. Milieu de base pour une incubation ultérieure pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, ajoutez 20 microlitres de solution de MTS et incuber les cellules pendant une heure supplémentaire.Transférer le mélange incubé dans une assiette différente. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 490 nanomètres et calculez la viabilité cellulaire. Diluer la phase de croissance logarithmique A 549 cellules à cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.Ajouter deux millilitres de la suspension cellulaire à une plaque de six puits et cultiver pendant 12 heures. Après avoir obtenu différentes dilutions PBS de l’extrait d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia comme démontré précédemment, ajouter 20 microlitres de la solution PBS au groupe témoin blanc et 20 microlitres des différentes dilutions de l’extrait d’eau de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia à différents groupes de concentration. Après 24 heures d’intervention, jetez le surnageant et nettoyez les cellules avec du PBS trois fois.Ajouter 250 microlitres de tampon RIPA à chaque puits et lyser les cellules pendant 30 minutes. Recueillir le lysat pour la centrifugalisation et obtenir le surnageant. Le réseau d’interaction cible de la maladie composant médicamenteuse de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia contre l’adénocarcinome pulmonaire est montré.Dans le réseau d’interaction, Les 10 principaux composants actifs obtenus sont les composants actifs clés de l’action de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire. Le réseau PPI comprenait 122 protéines fonctionnelles et 210 relations d’interaction. Les 10 principales protéines de base sont principalement impliquées dans la néovascularisation, la prolifération cellulaire, l’apoptose et le transport de la membrane cellulaire.Parmi les 20 premières voies classées par KEGG, la voie de signalisation PI3K-AKT, la voie de signalisation Rap1, la voie de signalisation Phospholipase-D et la voie de signalisation MAPK1 sont étroitement associées au cancer du poumon, parmi lesquelles la voie PI3K-AKT s’est classée au premier rang. Les extraits de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia à des concentrations supérieures à 400 microgrammes par millilitre pouvaient inhiber la prolifération cellulaire et l’effet inhibiteur sur les cellules A-549 à des concentrations allant jusqu’à 800 microgrammes par millilitre, était proche de la moitié de la concentration inhibitrice. L’intervention des extraits de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia n’a entraîné aucun changement significatif dans l’expression de la protéine AKT dans chaque groupe.Cependant, l’expression de p-AKT Serine-473 a été inhibée et a montré un effet dose-dépendant. Les composants critiques de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia ont été amarrés moléculairement aux protéines clés de la voie PI3K AKT, et les résultats ont suggéré que les énergies de liaison de Diosmetin et Kaempferol avec AKT1 étaient inférieures à moins sept, indiquant une forte activité de liaison. Le plus important est d’avoir atteint des ingrédients actifs sur les cibles de la médecine traditionnelle chinoise.Ainsi que les cibles de ce qui est le cœur de Network Pharmacological.

Research

JoVE Journal

Medicine

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