Name: network pharmacology prediction and experimental validation of trichosanthes-fritillaria thunbergii action mechanism against lung adenocarcinoma
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma at JoVE.com

Diese Studie wurde durch das Innovation Training Program der Beijing University of Chinese Medicine (Nr.: 202110026036) unterstützt.

Alle netzwerkpharmakologischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für netzwerkpharmakologische Bewertungsmethoden18 durchgeführt. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Labormanagementvorschriften der Pekinger Universität für Chinesische Medizin durchgeführt.
1. Pharmakologische Vorhersage des Netzwerks
<ol><li>Auswahl der aktiven Komponenten<ol><li>Öffnen Sie die HERB-Datenbank (http://herb.ac.cn...

Im Allgemeinen umfasst eine vollständige netzwerkpharmakologische Studie die Identifizierung von Wirkstoffen aus Datenbanken, die Erfassung von Zielen, die den Wirkstoffen und Krankheiten entsprechen, den Aufbau eines Netzwerks von Wirkstoffkomponenten-Krankheitszielen und die Vorhersage von Kernzielen und -wegen. Die Assoziation zwischen Wirkstoffen und Kernproteinen (molekulares Docking) wird mit Hilfe von Computertechnik vorläufig vorhergesagt und die abschließende Verifizierung mit einem Experiment durchgeführt.<...

Lungenkrebs bezieht sich auf bösartige Tumoren, die von der Bronchialschleimhaut der Lunge ausgehen, einschließlich Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom, großzelligem Karzinom und kleinzelligem Karzinom1. Das Lungenadenokarzinom (LUAD) ist die häufigste Form von Lungenkrebs und macht etwa 40 % aller Lungenkrebsfälleaus 2. Die meisten Patienten werden in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert oder haben Fernmetastasen und verlieren so die Möglichkeit einer Operation3. In der aktuellen klinischen Behandlung ist die gleichzeitige Radiochemotherapie die häufigste Strategie zur Behandlung von LUAD, ihre Anwendung ist jedoch aufgrund schwerwiegender Nebenwirkungen begrenzt4.
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) kann die klinischen Symptome von LUAD-Patienten wirksam lindern und die durch Strahlen- und Chemotherapie verursachten Nebenwirkungen reduzieren und ist damit zu einem Forschungs-Hotspot geworden 5,6,7. In der traditionellen chinesischen Medizin gehört Lungenkrebs in die Kategorie der "Lungenansammlung" und "Lungensteinwasser". Der Mangel an Qi und das Zusammenspiel von Schleim, Stase und Gift sind wichtig für die Pathogenese von Lungenkrebs. Daher sind die Tonisierung des Qi und die Beseitigung von Schleim und Blutstau die wichtigsten klinischen Behandlungsmethoden8 für Lungenkrebs gemäß der TCM-Theorie9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) und Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) stellen ein häufiges Medikamentenpaar bei der Behandlung von Lungenkrebs dar, und diese Kombination hat die Wirkung, die Hitze zu beseitigen und den Schleim zu reduzieren10,11,12. Der Wirkmechanismus ist jedoch noch unklar, und es muss noch weiter geforscht werden.
Die Netzwerkpharmakologie ist eine umfassende, auf der Theorie der Systembiologie und der multidirektionalen Pharmakologie basierende Methode, die darauf abzielt, komplexe Netzwerkbeziehungen zwischen mehreren Medikamenten und Krankheiten aufzudecken13. Traditionelle chinesische Verschreibungen haben die Eigenschaften, dass sie Mehrkomponenten- und Multi-Target-Verschreibungen sind, was bedeutet, dass sie sich sehr gut für das Studium der Netzwerkpharmakologie eignen14,15. In jüngster Zeit hat sich die Netzwerkpharmakologie zu einem leistungsstarken Ansatz bei der Erforschung von TCM-Rezepturen entwickelt und ist zu einem Forschungs-Hotspot geworden16,17.
Nach unserem besten Wissen werden jedoch alle Forschungen zur Netzwerkpharmakologie als Text dargestellt. Die Präsentation dieser Technologie per Video wird die Lernschwelle erheblich verringern und die Förderung dieser Technologie erleichtern, was einer der Vorteile dieses Artikels ist. In dieser Studie haben wir Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome als Beispiel genommen, um eine netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung durchzuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549&#160;cell line</td>
			<td>Procell</td>
			<td>CL-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4691S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PC0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence (ECL) kit&#160;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>RM00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>6040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14-15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory</td>
			<td>RE52CS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum freeze-drying mechanism</td>
			<td>Ningbo Scientz Biotechnology</td>
			<td>SCIENTZ-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

network pharmacology prediction and experimental validation of trichosanthes-fritillaria thunbergii action mechanism against lung adenocarcinoma

Unser Ziel war es, den Mechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms (LUAD) auf der Grundlage von Netzwerkpharmakologie und experimenteller Verifizierung zu untersuchen. Die wirksamen Komponenten und potentiellen Targets von Trichosanthis und Fritillaria thunbergii wurden mittels Hochdurchsatz-Experiment und referenzgeführter (HERB) Datenbank der Traditionellen Chinesischen Medizin und einer SEA-Datenbank (Similarity Ensemble Approach) gesammelt, und die LUAD-bezogenen Targets wurden von den Datenbanken GeneCards und Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) abgefragt. Ein Drug-Component-Disease-Target-Netzwerk wurde mit der Cytoscape-Software aufgebaut. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI), Genontologie-Funktionen (GO) und Analysen der Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG)-Signalwege wurden durchgeführt, um Kernziele und Schlüsselsignalwege zu erhalten. Für die anschließende experimentelle Validierung wurden ein wässriger Extrakt aus Trichosanthes-Fritillaria thunbergii und A549-Zellen verwendet. Durch die HERB-Datenbank und die Literaturrecherche wurden 31 wirksame Verbindungen und 157 potenzielle Zielgene von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii untersucht, von denen 144 regulatorische Ziele von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms waren. Die GO-funktionelle Anreicherungsanalyse zeigte, dass der Wirkmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen das Lungenadenokarzinom hauptsächlich in der Proteinphosphorylierung besteht. Die Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs deutete darauf hin, dass die Behandlung des Lungenadenokarzinoms mit Trichosanthes-Fritillaria thunbergii hauptsächlich den PI3K/AKT-Signalweg beinhaltet. Die experimentelle Validierung zeigte, dass ein wässriger Extrakt von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii die Proliferation von A549-Zellen und die Phosphorylierung von AKT hemmen kann. Durch Netzwerkpharmakologie und experimentelle Validierung konnte nachgewiesen werden, dass der PI3K/AKT-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Wirkung von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms spielt.

Insgesamt wurden 31 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-verwandte Wirkstoffe identifiziert, darunter 21 Trichosanthes- und 10 Fritillaria thunbergia-Komponenten, sowie 144 korrespondierende Targets. Insgesamt wurden 9.049 bzw. 67 LUAD-verwandte Gene aus der GeneCards-Datenbank bzw. der OMIM-Datenbank extrahiert. Nach dem Löschen duplizierter Gene konnten 9.057 Gene identifiziert werden, die mit LUAD in Verbindung stehen. Die Überschneidung der LUAD-verwandten Gene und der Trichosanthes-...

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Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Diese Studie enthüllt den Mechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung von Lungenadenokarzinomen auf der Grundlage von Netzwerkpharmakologie und experimenteller Überprüfung. Die Studie zeigt auch, dass der PI3K/AKT-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Wirkung von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms spielt.

Netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung des Wirkungsmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Traditionelle Chinesische Medizin, Wir werden über die Eigenschaften der Mehrkomponentenkomponente des Ziels sprechen. Das ist die grundlegende Box für Netzwerk- und biologische Forschung. Wir haben eine Demonstration der Technologie durchgeführt, die die Schwelle senken wird.Network Pharmacological ist eine systematische analytische Technologie, die die Werkzeuge der Interaktionsnetzwerkarbeit von Multifaktoren aufbaut. Die Daten von Network Pharmacological stammen aus der Datenbank, obwohl sie die Beziehung zu Medikamenten und Proteinen nicht vorhersagen können, und dies muss noch durch nachfolgende Experimente überprüft werden. Öffnen Sie zunächst die HERB-Datenbank und verwenden Sie Gua Liu und Zhebimu als Schlüsselwörter, um die Bestandteile der beiden Medikamente zu erhalten.Laden Sie die Liste und die kanonische SMILES-Struktur der verwandten Komponenten der beiden Medikamente herunter. Bestimmen Sie nun, ob die erhaltene Komponente aktiv ist, indem Sie Komponenten mit oraler Bioverfügbarkeit und wirkstoffähnlichen Werten in die HERB-Gruppendatenbank aufnehmen. Wenn die Komponente keine orale Bioverfügbarkeit und keine wirkstoffähnlichen Werte aufweist, geben Sie die Komponente in die Schweizer ADME-Datenbank ein, um die Informationen zu jeder Komponente zu erhalten.Nehmen Sie Komponenten mit hoher GI-Absorption und mindestens zwei ja, wirkstoffähnlichen Werten als Wirkstoffe auf. Um das Ziel der aktiven Komponenten vorherzusagen, öffnen Sie die HERB-Datenbank. Suchen und kopieren Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten.Öffnen Sie dann den Ähnlichkeits-Ensemble-Ansatz und fügen Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten in das Suchfeld ein. Klicken Sie auf "SEA" ausprobieren, um den Zielschlüssel, den Zielnamen, den P-Wert und die maximale TC jeder aktiven Komponente zu erhalten. Kopieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation und verwenden Sie die Filterfunktion für Tabellenkalkulationsdateien, um die aktiven Komponentenziele nach Zielschlüssel zu filtern.Kopieren Sie alle Ziele in eine Tabelle und entfernen Sie die Duplikate, um die Wirkstoffziele zu erhalten. Öffnen Sie nun die Genkartendatenbank und die Mendelsche Vererbung beim Menschen, um Krankheitsziele vorherzusagen. Verwenden Sie Lungenadenokarzinom'als Schlüsselwort, um die Krankheitsziele des Lungenadenokarzinoms zu erhalten.Laden Sie die Tabellen der Krankheitsziele herunter und löschen Sie die wiederholten Ziele, um die Ziele für das Lungenadenokarzinom zu erhalten. Konstruieren Sie ein Zielnetzwerk für Arzneimittelkomponentenkrankheiten, indem Sie die Zielmoleküle für Lungenadenokarzinome und Arzneimittelziele in dieselbe Spalte in einer neuen Tabelle kopieren. Verwenden Sie die Funktion zur Identifizierung von Datenduplikaten in der Symbolleiste, um Schnittpunkte der Ziele für Lungenadenokarzinome und der aktiven Komponenten von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia zu erhalten.Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0. Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei und wählen Sie Importieren. Gefolgt von Netzwerk aus Datei.Um die Tabellenkalkulationsdatei zu importieren, optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung. Verwenden Sie die Funktion "Netzwerk analysieren" für die Analyse der Netzwerk-Topologie. Klicken Sie in der Menüleiste auf Extras und wählen Sie Netzwerk analysieren.Klicken Sie im Tabellenbereich auf den Grad in der Titelleiste, um die Komponenten nach Grad in absteigender Reihenfolge anzuordnen. Nehmen Sie die Top-10-Komponenten und -Ziele als die wichtigsten aktiven Komponenten und Kernziele. Aufbau des PPI-Netzwerks und Screening der Kernproteine.Öffnen Sie die Zeichenfolgendatenbank und fügen Sie die Liste der potenziellen Ziele von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia gegen Lungenadenokarzinome in das Dialogfeld der Namensliste ein. Dann selektieren Sie Homosapiens in Organismen. Klicken Sie auf "Suchen" und wählen Sie die Schaltflächen "Weiter" aus. Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf "Einstellungen" Und kreuzen Sie hohe Konfidenz 0,700 an In den Grundeinstellungen unter "Mindestens erforderlicher Interaktionswert" aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen die Option "Hohe getrennte Knoten im Netzwerk".Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Aktualisieren. Klicken Sie anschließend in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen tabellarischen Text der PPI-Beziehung im TSV-Format herunter. Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0.Klicken Sie auf Datei, auswählen, importieren, gefolgt von Netzwerk aus Datei, um die Datei im TSV-Format für die visuelle Analyse zu importieren. Verwenden Sie die Netzwerkanalysefunktion, um die topologische Analyse durchzuführen. Optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung.Führen Sie eine KEGG-Anreicherungsanalyse durch, indem Sie die Medscape-Plattform öffnen, die Liste der potenziellen therapeutischen Ziele im Textformat in das Dialogfeld einfügen und dann auf die Schaltfläche "Senden" klicken. Kreuzen Sie Homo sapiens sowohl in der Eingabe als Spezies als auch in der Analyse als Spezies anund klicken Sie dann auf die Schaltfläche Benutzerdefinierte Analyse. Wählen Sie Anreicherung aus.Kreuzen Sie nur den KEGG-Pfad an und klicken Sie dann auf Anreicherungsanalyse. Sobald der Fortschrittsbalken 100 % erreicht, klicken Sie auf die orangefarbene Schaltfläche der Analyseberichtsseite, um die Anreicherungsergebnisse anzuzeigen. Klicken Sie auf alles in einer Zip-Datei'um das Anreicherungsergebnis herunterzuladen, und öffnen Sie dann die _FINAL_GO'csv-Datei im Ordner Enrichment_GO', um das Ergebnis zu erhalten.Öffnen Sie die R-Software und geben Sie install package GG plot two' und die Bibliothek GG Plot two'in R ein Für die Installation des GG plot two R-Pakets. Drücken Sie die Eingabetaste, um das KEGG-Visualisierungsprogramm auszuführen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen nachzuweisen, verdauen Sie die logarithmische Wachstumsphase A 549 Zellen mit einem Milliliter 0,25%Trypsin für eine Minute bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie einen Milliliter DMEM Complete Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und blasen Sie es sanft, um die Zellablösung zu fördern. Zentrifugieren Sie dann die Mischung, um das Zellpellet zu erhalten, und resuspendieren Sie die erhaltenen Zellen mit DMEM-Komplettmedium. Geben Sie die Zellsuspension in ein Hämozytometer und zählen Sie sie mit einem automatisierten Zellzähler, verdünnen Sie sie auf fünf mal 10 bis vierte Zellen pro Milliliter mit DMEM-Komplettmedium Lösen Sie nun ein Gramm Trichosanthes Fritillaria Thunbergia Wasserextrakt in 10 Millilitern PBS auf und filtern Sie es durch einen 0,22-Mikrometer-Filter.Verdünnen Sie das Gemisch mit PBS auf unterschiedliche Konzentrationen. 100 Mikroliter der verdünnten Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben. Nach der Zelladhärenz fügen Sie einen Mikroliter Trichosanthes Fritillaria Thunbergia Wasserextrakte in verschiedenen Konzentrationen hinzu, um die Konzentration jeder Vertiefung anzupassen.Entsorgen Sie das ursprüngliche Medium nach 24 Stunden Kultur und fügen Sie 100 Mikroliter DMEM hinzu. Basismedium für die weitere Inkubation für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Fügen Sie am Ende der Inkubation 20 Mikroliter MTS-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine weitere Stunde.Übertragen Sie die inkubierte Mischung auf einen anderen Teller. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 Nanometern und berechnen Sie die Zellviabilität. Verdünnen Sie die logarithmische Wachstumsphase A 549 Zellen auf fünf mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter.Gib zwei Milliliter der Zellsuspension auf eine Platte mit sechs Wells und züchte sie 12 Stunden lang. Nachdem Sie verschiedene PBS-Verdünnungen von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Wasserextrakt erhalten haben, wie zuvor gezeigt, werden 20 Mikroliter der PBS-Lösung in die Blindkontrollgruppe und 20 Mikroliter der verschiedenen Verdünnungen von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Wasserextrakt in eine andere Konzentrationsgruppe gegeben. Nach 24 Stunden des Eingriffs wird der Überstand verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gereinigt.Geben Sie 250 Mikroliter RIPA-Puffer in jede Vertiefung und lysieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Sammeln Sie das Lysat für die Zentrifugalisierung und erhalten Sie den Überstand. Das Interaktionsnetzwerk von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia gegen das Lungenadenokarzinom wird gezeigt.Im Interaktionsnetzwerk sind die Top 10 der erhaltenen Wirkstoffe die wichtigsten aktiven Komponenten der Wirkung von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms. Das PPI-Netzwerk umfasste 122 funktionelle Proteine und 210 Interaktionsbeziehungen. Die Top-10-Kernproteine sind hauptsächlich an der Neovaskularisation, Zellproliferation, Apoptose und dem Zellmembrantransport beteiligt.Von den 20 wichtigsten Signalwegen, die von KEGG eingestuft werden, stehen der PI3K-AKT-Signalweg, der Rap1-Signalweg, der Phospholipase-D-Signalweg und der MAPK1-Signalweg in engem Zusammenhang mit Lungenkrebs, wobei der PI3K-AKT-Signalweg den ersten Platz belegte. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Extrakte in Konzentrationen über 400 Mikrogramm pro Milliliter konnten die Zellproliferation hemmen, und die Hemmwirkung auf A-549-Zellen bei Konzentrationen von bis zu 800 Mikrogramm pro Milliliter lag nahe der Hälfte der hemmenden Konzentration. Die Intervention von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Extrakten führte zu keiner signifikanten Veränderung der AKT-Proteinexpression in jeder Gruppe.Die Expression von p-AKT Serin-473 war jedoch gehemmt und zeigte einen dosisabhängigen Effekt. Die kritischen Komponenten von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia waren molekular an die Schlüsselproteine des PI3K-AKT-Signalwegs angedockt, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bindungsenergien von Diosmetin und Kaempferol mit AKT1 weniger als minus sieben betrugen, was auf eine starke Bindungsaktivität hindeutet. Das Wichtigste ist, Wirkstoffe auf den Zielen der Traditionellen Chinesischen Medizin erreicht zu haben.Sowie deren Ziele der Kern von Network Pharmacological.

Research

JoVE Journal

Medicine

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