Name: network pharmacology prediction and experimental validation of trichosanthes-fritillaria thunbergii action mechanism against lung adenocarcinoma
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00
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Este estudo foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Inovação da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (No: 202110026036).

Todos os procedimentos de farmacologia de rede foram realizados de acordo com as Diretrizes para Métodos de Avaliação de Farmacologia de Rede18. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os regulamentos de gestão laboratorial da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.
1. Predição farmacológica de rede
<ol><li>Seleção de componentes ativos<ol><li>Abra o banco de dados HERB (http://herb.ac.cn)19</...

Geralmente, um estudo completo de farmacologia em rede inclui a identificação de componentes ativos a partir de bancos de dados, a aquisição de alvos correspondentes a componentes ativos e doenças, a construção de uma rede droga-componente-doença-alvo e a previsão de alvos e vias centrais. A associação entre componentes ativos e proteínas centrais (docking molecular) é preliminarmente prevista pela tecnologia computacional, e a verificação final é conduzida por meio de um experimento.
<p class="jove_c...

O câncer de pulmão refere-se a tumores malignos originados da mucosa brônquica pulmonar, incluindo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de grandes células e carcinoma de pequenascélulas1. O adenocarcinoma de pulmão (LUAD) é o tipo mais comum de câncer de pulmão, correspondendo a cerca de 40% do total de casos de câncer depulmão2. A maioria dos pacientes é diagnosticada em estágio avançado ou com metástase à distância e, assim, perde a oportunidade dacirurgia3. No tratamento clínico atual, a quimiorradioterapia concomitante é a estratégia mais comum para o tratamento da LUAD, mas sua aplicação é limitada devido a reações adversasgraves4.
A medicina tradicional chinesa (MTC) pode efetivamente aliviar os sintomas clínicos de pacientes com LUAD e reduzir as reações adversas causadas pela radioterapia e quimioterapia, tornando-se, assim, um foco de pesquisa 5,6,7. Na medicina tradicional chinesa, o câncer de pulmão pertence à categoria de "acúmulo pulmonar" e "petroso pulmonar". A deficiência de Qi e a interação de catarro, estase e veneno são importantes na patogênese do câncer de pulmão. Portanto, tonificar o Qi e eliminar o catarro e a estase sanguínea são os principais métodos de tratamento clínico8 para o câncer de pulmão de acordo com a teoria daMTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) e Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) representam um par de drogas comum no tratamento do câncer de pulmão, e essa combinação tem como efeito limpar o calor e reduzir o catarro10,11,12. No entanto, seu mecanismo de ação ainda não está claro, e mais pesquisas precisam ser conduzidas.
A farmacologia de redes é um método abrangente baseado na teoria da biologia de sistemas e farmacologia multidirecional que visa revelar complexas relações em rede entre múltiplas drogas e doenças13. As prescrições tradicionais chinesas têm as características de serem multicomponentes e multialvo, o que significa que são muito adequadas para o estudo da farmacologia de rede14,15. Recentemente, a farmacologia de redes emergiu como uma abordagem poderosa no estudo de fórmulas de MTC e tornou-se um hotspot de pesquisa16,17.
No entanto, até onde sabemos, todas as pesquisas em farmacologia de redes são apresentadas como texto. Apresentar essa tecnologia por meio de vídeo reduzirá muito o limiar de aprendizado e facilitará a divulgação dessa tecnologia, que é uma das vantagens deste artigo. Neste estudo, tomamos como exemplo Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra adenocarcinoma pulmonar para predição farmacológica de rede e validação experimental.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549&#160;cell line</td>
			<td>Procell</td>
			<td>CL-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4691S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PC0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence (ECL) kit&#160;</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>RM00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>6040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14-15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory</td>
			<td>RE52CS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum freeze-drying mechanism</td>
			<td>Ningbo Scientz Biotechnology</td>
			<td>SCIENTZ-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

network pharmacology prediction and experimental validation of trichosanthes-fritillaria thunbergii action mechanism against lung adenocarcinoma

Nosso objetivo foi estudar o mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar (LUAD) com base na farmacologia de rede e verificação experimental. Os componentes efetivos e alvos potenciais de Trichosanthis e Fritillaria thunbergii foram coletados por experimentos de alto rendimento e banco de dados guiados por referência (HERB) da medicina tradicional chinesa e um banco de dados de similaridade ensemble approach (SEA), e os alvos relacionados ao LUAD foram consultados pelos bancos de dados GeneCards e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Uma rede fármaco-componente-doença-alvo foi construída pelo software Cytoscape. Análises da rede de interação proteína-proteína (PPI), da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de Kyoto de enriquecimento de genes e genomas (KEGG) foram conduzidas para obter alvos centrais e vias-chave. Um extrato aquoso de células de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii e A549 foi utilizado para posterior validação experimental. Através do banco de dados HERB e busca na literatura, 31 compostos efetivos e 157 potenciais genes-alvo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram examinados, dos quais 144 foram alvos regulatórios de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento de adenocarcinoma pulmonar. A análise do enriquecimento funcional do GO mostrou que o mecanismo de ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra o adenocarcinoma pulmonar é principalmente a fosforilação de proteínas. A análise do enriquecimento da via de KEGG sugeriu que o tratamento do adenocarcinoma pulmonar por Trichosanthes-Fritillaria thunbergii envolve principalmente a via de sinalização PI3K/AKT. A validação experimental mostrou que um extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pode inibir a proliferação de células A549 e a fosforilação de AKT. Através da farmacologia de rede e validação experimental, verificou-se que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar.

Um total de 31 componentes ativos relacionados a Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram identificados, incluindo 21 componentes de Trichosanthes e 10 componentes de Fritillaria thunbergia, bem como 144 alvos correspondentes. No total, 9.049 e 67 genes relacionados ao LUAD foram extraídos do banco de dados GeneCards e do banco de dados OMIM, respectivamente. Após a exclusão de genes duplicados, 9.057 genes relacionados ao LUAD foram identificados. A intersecção dos genes relacionados ao...

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Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Este estudo revela o mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar com base na farmacologia de rede e verificação experimental. O estudo também demonstra que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar.

Predição de Farmacologia de Rede e Validação Experimental do Mecanismo de Ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Contra o Adenocarcinoma Pulmonar

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Medicina Tradicional Chinesa, falaremos das características de multicomponente do alvo. Que é a caixa básica para a pesquisa em Rede e Biológica. Fizemos uma demonstração da tecnologia que vai reduzir o limite.Rede Farmacológica é uma tecnologia analítica sistemática, constrói as ferramentas de interação em rede de trabalho de multifatores. Ele pode efetivamente prever o caminho único da medicina tradicional chinesa em Os dados da rede farmacológica vêm do banco de dados, embora não possa prever a relação com drogas, proteínas, e isso ainda precisa ser verificado pelos experimentos subsequentes. Para começar, abra o banco de dados HERB e use Gua Liu e Zhebimu como palavras-chave para obter os componentes das duas drogas.Faça o download da lista e da estrutura canônica SMILES dos componentes relacionados dos dois medicamentos. Agora determine se o componente obtido está ativo incluindo componentes com biodisponibilidade oral e valores semelhantes a medicamentos no banco de dados do Grupo HERB. Se o componente não tiver biodisponibilidade oral e valores semelhantes a medicamentos, insira o componente no banco de dados suíço ADME para obter as informações sobre cada componente.Incluir componentes com alta absorção gastrointestinal e pelo menos dois valores semelhantes a medicamentos como componentes ativos. Para prever o destino dos componentes ativos, abra o banco de dados HERB. Pesquise e copie as estruturas SMILES canônicas dos componentes ativos.Em seguida, abra a abordagem de conjunto de similaridade e cole as estruturas SMILES canônicas dos componentes ativos na caixa de pesquisa. Clique em try SEA'para obter o valor P da chave de destino da chave de destino e o TC máximo de cada componente ativo. Copie os dados em uma planilha e use a função de filtragem de arquivos de planilha para filtrar os destinos dos componentes ativos por chave de destino.Copie todos os alvos para uma planilha e remova as duplicatas para obter os alvos da droga. Agora abra o banco de dados de cartões genéticos e on-line herança mendeliana no homem para prever alvos de doenças. Use Lung Adenocarcinoma'como a palavra-chave para obter os alvos da doença do Adenocarcinoma de Pulmão.Faça o download das planilhas dos alvos da doença e exclua os alvos repetidos, para obter os alvos do Adenocarcinoma de Pulmão. Construa uma rede alvo de doença componente de drogas copiando os alvos relacionados ao adenocarcinoma pulmonar e os alvos de drogas na mesma coluna, em uma nova planilha. Use os dados da função identificar duplicatas, na barra de ferramentas, para obter alvos de intersecção dos alvos relacionados ao Adenocarcinoma de Pulmão e dos alvos relacionados ao componente ativo do Trichosanthes Fritillaria Thunbergia.Abra o Cytoscape 3.8.0. Clique no arquivo na barra de menus e selecione importar. Seguido pela rede do arquivo.Para importar o arquivo de planilha, otimize o tamanho e a cor dos nós de rede por meio da barra de estilos no painel de controle esquerdo. Use a função analisar rede para a análise de topologia de rede. Clique em ferramentas na barra de menus e selecione analisar rede.No painel da tabela, clique no grau na barra de título para organizar os componentes por grau em ordem decrescente. Tome os 10 principais componentes e destinos como os principais componentes ativos e alvos principais. Construir a rede PPI e selecionar as proteínas centrais.Abra o banco de dados de cadeia de caracteres e cole a lista de formato de texto dos alvos potenciais de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia, contra adenocarcinomas de pulmão na caixa de diálogo da lista de nomes. Em seguida, selecione homosapiens em organismos. Clique em pesquisar e selecione continuar botões, quando os resultados estiverem disponíveis, clique em configurações E marque alta confiança 0,700 Em configurações básicas, sob a pontuação mínima de interação necessária, marque nós desconectados altos na rede, em configurações avançadas.Em seguida, clique no botão de atualização. Em seguida, clique em exportações na barra de título e baixe o pequeno texto tabular da relação PPI no formato TSV. Abra o Cytoscape 3.8.0.Clique no arquivo, selecione, importe, seguido pela rede do arquivo para importar o arquivo de formato TSV para análise visual. Use a função de analisador de rede para realizar a análise topológica. Otimize o tamanho e a cor dos nós de rede através da barra de estilos no painel de controle esquerdo.Execute a análise de enriquecimento KEGG abrindo a plataforma Medscape, colando a lista de formato de texto dos potenciais alvos terapêuticos na caixa de diálogo e, em seguida, clicando no botão enviar. Assinale o Homo sapiens tanto na entrada como espécie e análise como espécie e, em seguida, clique no botão de análise personalizado. Selecione enriquecimento.Marque apenas o caminho KEGG e, em seguida, clique em análise de enriquecimento. Quando a barra de progresso atingir 100%, clique no botão laranja da página do relatório de análise para obter os resultados do enriquecimento. Clique em tudo em um arquivo zip para baixar o resultado do enriquecimento e, em seguida, abra o arquivo _FINAL_GO'csv na pasta Enrichment_GO para obter o resultado.Abra o R-Software e digite instalar o pacote GG plot two' e biblioteca GG Plot two'in R Para a instalação do GG plot dois pacotes R. Pressione Enter para executar o programa KEGG Visualization. Para detectar a viabilidade celular, digerir a fase de crescimento logarítmico A 549 células com um mililitro de 0,25% de tripsina por um minuto a 37 graus Celsius.Adicione um mililitro de DMEM Complete Medium para neutralizar a tripsina e soprar suavemente para promover a eliminação celular. Em seguida, centrifugar a mistura para obter o pellet celular e ressuspender as células obtidas, usando meio completo DMEM. Adicione a suspensão celular a um hemocitômetro e conte usando um contador de células automatizado, dilua-o para cinco vezes 10 a quarta células por mililitro, usando meio completo DMEM Agora dissolver um grama de extrato de água de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia em 10 mililitros de PBS e filtrar esterilizá-lo através de um filtro de 0,22 micrômetro.Diluir a mistura em diferentes concentrações utilizando PBS. Placa de 100 microlitros das células diluídas em cada poço de uma placa de 96 poços. Após a adesão celular, adicionar um microlitro de extratos aquosos de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia de diferentes concentrações para ajustar a concentração de cada poço.Descarte o meio original após 24 horas de cultivo e adicione 100 microlitros de DMEM. Meio básico para posterior incubação por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Ao final da incubação, adicionar 20 microlitros de solução de MTS e incubar as células por mais uma hora.Transfira a mistura incubada para uma placa diferente. Usando um leitor de microplacas, meça a absorvência em um comprimento de onda de 490 nanômetros e calcule a viabilidade celular. Diluir a fase de crescimento logarítmico A 549 células para cinco vezes 10 a quinta células por mililitro.Adicione dois mililitros da suspensão celular a uma placa de seis poços e cresça por 12 horas. Depois de obter diferentes diluições PBS do extrato aquoso de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia, como demonstrado anteriormente, adicione 20 microlitros da solução PBS ao grupo controle em branco e 20 microlitros das várias diluições do extrato aquoso de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia a diferentes grupos de concentração. Após 24 horas de intervenção, descartar o sobrenadante e limpar as células com PBS três vezes.Adicione 250 microlitros de tampão RIPA a cada poço e lise as células durante 30 minutos. Coletar o lisado para centrifugação e obter o sobrenadante. A rede de interação alvo da doença componente da droga de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia contra adenocarcinoma de pulmão é mostrada.Na rede de interação, Os 10 principais componentes ativos obtidos são os principais componentes ativos da ação de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia no tratamento do Adenocarcinoma de Pulmão. A rede PPI incluiu 122 proteínas funcionais e 210 relações de interação. As 10 principais proteínas centrais estão envolvidas principalmente na neovascularização, proliferação celular, apoptose e transporte da membrana celular.Das 20 principais vias classificadas pelo KEGG, a via de sinalização PI3K-AKT, a via de sinalização Rap1, a via de sinalização Phospholipase-D e a via de sinalização MAPK1 estão intimamente associadas ao câncer de pulmão, entre as quais a via PI3K-AKT ficou em primeiro lugar. Extratos de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia em concentrações acima de 400 microgramas por mililitro podem inibir a proliferação celular e o efeito de inibição em células A-549 em concentrações de até 800 microgramas por mililitro, foi próximo à metade da concentração inibitória. A intervenção dos extratos de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia não causou alteração significativa na expressão da proteína AKT em cada grupo.No entanto, a expressão de p-AKT Serina-473 foi inibida e mostrou um efeito dose-dependente. Os componentes críticos de Trichosanthes Fritillaria Thunbergia foram acoplados molecularmente com as proteínas-chave da via PI3K AKT, e os resultados sugeriram que as energias de ligação de Diosmetin e Kaempferol com AKT1 foram menores que menos sete, indicando forte atividade de ligação. O mais importante é ter alcançado ingredientes ativos nos alvos da Medicina Tradicional Chinesa.Assim como os alvos dos quais é o núcleo da Rede Farmacológica.

Research

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