Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af en udnævnelse til forskningsdeltagelsesprogrammet ved Center for Devices and Radiological Health administreret af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en interagency aftale mellem US Department of Energy og US Food and Drug Administration. Forfatterne takker Richard Gray, Trent Robertson og Anna Avila for deres forslag og tekniske assistance. Undersøgelsen blev finansieret gennem US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.

1. Klargøring af plader og medier
BEMÆRK: En typisk ekstracellulær matrix (ECM)-baseret hydrogelalikvote er ~ 200 μL i et sterilt 1,5 ml rør opbevaret ved -20 ° C.
<ol><li>I en steril vævskulturhætte fremstilles en steril 6-brønds plade ved at overføre 2 ml 0,1% gelatine (materialetabel) til hver brønd. Låget anbringes på 6-brøndspladen, og den coatede plade inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time.</li>
	<li>En dag før såning af hiPSC-CM'erne på det fleksible hydrogelsubstrat optø en hydrogel (materialetabel) alikvote i køleskabet på is.</li>
	<li>Forbered kardiomyocytmediet (materialetabel) ved at blande 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x B-27 supplement og 5 ml penicillin-streptomycin9.</li>
</ol>2. Såning af kryopræserverede hiPSC-CM'er
<ol><li>To dage før såning af hiPSC-CM'erne på det fleksible hydrogelsubstrat forplades hiPSC-CM'erne på 0,1% gelatinebelagte sterile 6-brøndsplader. HiPSC-CM'erne optøes ved hjælp af standardoptøningsprotokollen 9,25.</li>
	<li>Derefter plades 1.500.000 samlede hiPSC-CM'er (materialetabel) pr. brønd i henhold til producentens anvisninger (figur 1A)26.</li>
	<li>HiPSC-CM'erne dyrkes i standard kardiomyocytsubstrat i 2-4 dage for at give hiPSC-CM'erne mulighed for at komme sig efter kryopræserveringen ved 37 °C og 5% CO2. Opdater det brugte medium med 100% kardiomyocytmedium hver 48. time.</li>
</ol>3. Afkobling og tælling af de forbelagte hiPSC-CM'er
<ol><li>Kontroller status for hiPSC-CM'erne før dissociation. Evaluer hiPSC-CM'ernes sundhed, hvilket sikrer levedygtighed og stabil slag. BEMÆRK: Renheden af hiPSC-CM-populationen er vigtig (f.eks. >90% hjerte-troponin T)7. En kardiomyocytudvælgelsesmetode (f.eks. metabolisk selektion eller sortering) anbefales for at reducere forstyrrelsen af hydrogelsubstratet af ikke-kardiomyocytceller25,26.</li>
	<li>HiPSC-CM'erne vaskes 2x med 4 ml D-PBS pr. hul uden CaCl2 ellerMgCl2 (materialetabel). D-PBS suges op, der tilsættes 1 ml dissociationsreagens ved stuetemperatur til hvert hul, og derefter inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.</li>
	<li>Tilsæt 10 ml kardiomyocytmedium til et sterilt 15 ml konisk rør.</li>
	<li>HiPSC-CM'erne adskilles fra 6-brøndspladen med en 1.000 μL pipette (figur 1B). Tilsæt cellesuspensionen til det 15 ml koniske rør26.</li>
	<li>Skyl brønden med 1 ml frisk kardiomyocytmedium for at opsamle eventuelle resterende hiPSC-CM'er, og tilsæt dem til det 15 ml koniske rør. Bring det endelige volumen af det koniske rør til 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger i 5 min (200 × g). Supernatanten fjernes op til 1 ml mærket. Resuspender cellerne i kardiomyocytmedium til et slutvolumen på 5 ml.</li>
	<li>Tæl hiPSC-CM'erne med en manuel eller automatiseret celletæller.</li>
	<li>HiPSC-CM-suspensionen inkuberes ved stuetemperatur, mens de fleksible hydrogelsubstrater fremstilles (maks. 30 min.).</li>
</ol>4. Fremstilling af de fleksible hydrogelsubstrater
<ol><li>Forbered en 20 μL pipette indstillet til 1 μL, 20 μL pipettespidser (f.eks. 20 μL) og en steril 48-brønds glasbundplade. Sørg for, at et stopur/timer er klar, inden hydrogelsubstraterne fremstilles.</li>
	<li>I den sterile vævskulturhætte blandes det ECM-baserede hydrogelsubstrat ved forsigtigt at banke på røret og straks placere det tilbage på is.</li>
	<li>Start derefter stopuret / timeren umiddelbart før det første hydrogelsubstrat er belagt - dette er tid nul.</li>
	<li>Afpipette 1 μL af hydrogelsubstratet op og ned ~3x for at afkøle pipettespidsen. Påfør ~1 μL af det ufortyndede hydrogelsubstrat vandret på bunden af hvert hul på pladen med 48 brønde (figur 1C, figur 2A og figur 3A), mens pipetten holdes i en vinkel på 45°. Alle hydrogelsubstraterne anbringes i samme retning i hvert hul (figur 2 og figur 3) for at hjælpe med at identificere substratet, når eksperimenterne udføres ved 40x forstørrelse 7,9,17,27. BEMÆRK: Hver ~ 1 μL linje er et hydrogelsubstrat (figur 3). Det tager typisk ~5 min at forberede 48 brønde. Brug af et vandret vippet mikropladestativ (f.eks. 30°) kan give et bedre overblik over bunden af brønden og hydrogelsubstratet. Sørg for at gå hele længden af brønden (dvs. fra venstre mod højre). Korte hydrogelsubstrater kan være for tykke, hvilket reducerer substratstabiliteten. Lad ikke hydrogelsubstratet tørre i pipettespidsen. Hvis dette sker, skal du hurtigt skifte til et nyt tip og straks fortsætte. Alternativt kan kølepipettespidser anvendes. Det ECM-baserede hydrogelsubstrat kan hurtigt polymerisere, når det ikke er på is. Det foreslås, at der udarbejdes flere brønde ad gangen (f.eks. 10). Derudover anbefales det at øve sig i en mock 48-brønds plade.</li>
	<li>Anbring låget på 48-brøndspladen, og lad hydrogelsubstraterne inkubere i 8-10 minutter ved stuetemperatur i den sterile vævskulturhætte, før cellerne tilsættes (figur 2B). BEMÆRK: Det er vigtigt at overholde de foreslåede inkubationstider. En inkubationstid på mere end 10 min vil føre til stive hydrogelsubstrater og ingen synlige sammentrækninger. En inkubationstid på mindre end 8 min kan føre til substrater, der kollapser.</li>
	<li>HiPSC-CM'erne sås straks dråbevis direkte på hydrogelsubstraterne med ~30.000 levedygtige hiPSC-CM'er pr. brønd i et lavt medium volumen på ~200 μL kardiomyocytmedium ved hjælp af en 1.000 μL pipette (figur 2B og figur 3B). BEMÆRK: Denne proces stopper hydrogelsubstratpolymerisationen og sikrer, at hiPSC-CM'erne er på substratet 7,9,17,27.</li>
	<li>Låget anbringes på pladen, og hiPSC-CM'erne inkuberes uforstyrret i 10-15 minutter ved stuetemperatur (figur 2C) i den sterile vævskulturhætte, så hiPSC-CM'erne kan klæbe til hydrogelsubstratet.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt ~ 100 μL frisk kardiomyocytmedium til hvert hul (slutvolumen: ~ 300 μL pr. Hul). Låget anbringes på pladen, og overføres til en inkubator ved 37 °C, 5% CO 2 i2-4 dage. Opdater 100% mediet hver 24. time, før sammentrækningseksperimenterne udføres. BEMÆRK: Undersøg visuelt hiPSC-CM'erne for den korrekte morfologi; umiddelbart efter plettering skal hiPSC-CM'erne være runde (figur 3B). På dag 2 efter såning observeres et sammenflydende 2D hiPSC-CM monolags syncytium (figur 3C) (supplerende video S1) med robust synlig sammentrækning (supplerende video S2).</li>
</ol>5. Registrering og analyse af sammentrækning
<ol><li>CCM-analysemediet, som er Tyrodes opløsning, der indeholder følgende (i mmol/l): CaCl2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4,MgCl2 1, glucose 10 og HEPES 10, med pH justeret til 7,4 med NaOH og ligevægt til 37 °C i et vandbad. BEMÆRK: Submaksimalt ekstracellulært calcium (0,5 mM) bruges til at forbedre CCM-analysevinduet.</li>
	<li>Tænd mikroskopet og miljøkontrolkammeret for at ekvilibrere til 37 °C og 5% CO2.</li>
	<li>Kardiomyocytmediet fjernes fra 48-brøndspladen, og skyl forsigtigt hvert hul to gange med 600 μL CCM-analysemedium.</li>
	<li>Der tilsættes 300 μL CCM-analysesubstrat pr. hul, og 48-brøndpladen anbringes på mikroskopet i miljøkontrolkammeret. Indsæt elektroderne, og ekvilibrer cellerne i 5 min.</li>
	<li>Brug videobaseret mikroskopi til at optage sammentrækningsvideoerne. Åbn videooptagelsessoftwaren, og indstil en billedhastighed på 100 billeder / s. Vælg et område af interesse (ROI) nær midten af hiPSC-CM-monolaget. BEMÆRK: Vælg ikke et investeringsafkast nær kanten af hiPSC-CM-monolagene, da dette kan være ustabilt for kontraktile optagelser.</li>
	<li>Derefter stimulerer feltet cellerne med en kommerciel pulsgenerator (materialetabel) til elektrisk tempo 2D hiPSC-CM-monolagene. Tempo hiPSC-CM'erne ved 1,5x tærskel ved 1 Hz med baseline pulsparametre (f.eks. monofasiske kvadratbølge pacing impulser med en 2 ms stimuluspulsvarighed på ~ 14 V / cm)17.</li>
	<li>Optag baseline, pacing kun (dvs. før CCM) (figur 1D) kontraktionsvideo i mindst fem slag17,28.</li>
	<li>Derefter stimuleres hiPSC-CM-monolaget med et eksperimentelt elektrisk signal (figur 1D). For at følge denne protokol skal du bruge standard CCM-stimuleringsparametrene: to symmetriske bifasiske impulser med 5,14 ms fasevarighed (20,56 ms samlet varighed), ~ 28 V / cm (faseamplitude), nul interfaseinterval og en forsinkelse på 30 ms (dvs. tid fra slutningen af pacingpulsen til begyndelsen af CCM-pulsen) (figur 1D)29,30 , og optag den CCM-inducerede sammentrækningsvideo i mindst fem slag.</li>
	<li>Sluk for CCM-signalet, stimuler med en baseline pacingpuls, og optag en sammentrækningsvideo af restitutionsperioden (dvs. efter CCM) i mindst fem slag.</li>
	<li>Brug standard kontraktionssoftware til automatisk at analysere sammentrækningsvideoerne og kvantificere de vigtigste kontraktile egenskaber (f.eks. kontraktionsamplitude, sammentrækningshældning, afslapningshældning, tid til top, tid til baseline 90% og sammentrækningsvarighed 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Brug 2D hiPSC-CM'erne på det fleksible hydrogelsubstrat til kontraktile eksperimenter fra dag 2-14 efter plettering på substratet.</li>
</ol>

Denne artikel afspejler forfatternes synspunkter og bør ikke fortolkes som at repræsentere US Food and Drug Administration's synspunkter eller politikker. Omtale af kommercielle produkter, deres kilder eller deres anvendelse i forbindelse med det materiale, der rapporteres heri, skal ikke fortolkes som enten en faktisk eller underforstået godkendelse af sådanne produkter fra Department of Health and Human Services. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser for dette arbejde.

Protokollen skitseret heri beskriver en metode til at generere robust sammentrækkende 2D hiPSC-CM-monolag på et fleksibelt ekstracellulært matrix (ECM)-baseret hydrogelsubstrat med kommercielle reagenser 7,17. HiPSC-CM'erne, der er podet på det fleksible hydrogelsubstrat, forbliver levedygtige og har forbedrede kontraktile egenskaber7. Denne teknik er afhængig af standard laboratorieudstyr ogkapaciteter 7. Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder i forhold til at arbejde med det ECM-baserede hydrogelsubstrat, der kræver omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Et potentielt problem er tilstedeværelsen af serum i mediet. Dette kan resultere i, at hiPSC-CM'erne danner netværk (f.eks. endotel/vaskulære netværk) i stedet for et sammenflydende enkeltlagsark; derfor anbefales et serumfrit medium under etableringen af de fleksible hydrogel hiPSC-CM-monolag (dvs. dag 0 til dag 4). På samme måde kan forberedelse af for mange hydrogelsubstrater ad gangen resultere i dårlige eller ujævne substrater på grund af operatørtræthed. Selvom det er vigtigt at arbejde hurtigt, er integriteten af hvert hydrogelsubstrat kritisk. På samme måde bør man omhyggeligt frø hiPSC-CM'erne og ændre mediet; Dette bør ikke gøres med magt. Når mediet ændres, skal det tilsættes forsigtigt fra brøndens øverste kant for ikke at forstyrre hydrogelsubstratet eller cellerne. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konventionel vævskulturplast eller glas) vil plettering ved lav densitet resultere i ufuldstændig enkeltlagsdannelse. Det er vigtigt visuelt at inspicere hiPSC-CM'erne for at bekræfte, at de er på hydrogelsubstratet og bruge en timer for at sikre nøjagtig timing. Desuden kan dyrkning af 2D hiPSC-CM-monolagene i mere end 14 dage på hydrogelsubstratet resultere i monolagsforstyrrelser baseret på ECM-egenskaberne og instruktioner fra producenten af substratet.
Der er flere begrænsninger for den nuværende metode, der skal overvejes. For det første var cellerne, der blev brugt i denne protokol, fra en kommerciel hiPSC-CM-udbyder, og disse celler danner et syncytium af elektrisk koblede celler. Syncytium indeholder en blanding af hiPSC-CM'er fra alle tre hjerteundertyper (dvs. ventrikulære, atriale og nodale)17. Studier kan drage fordel af en subtype-eksklusiv hiPSC-CM-population (dvs. 100% ventrikulær eller 100% atriel). For det andet anvendte denne metode kun hiPSC-CM'er, mens ikke-myocytter, herunder hjertefibroblaster, endotelceller og neuroner, kan forbedre hiPSC-CM-funktionaliteten22,36. For det tredje viser 2D hiPSC-CM'er flere funktioner i relativt umodne kardiomyocytter, herunder spontan slag, amorf morfologi og mangel på et inotropt respons 8,37. For det fjerde, mens denne protokol producerer robust kontraherende 2D hiPSC-CM-monolag, er det sandsynligt, at funktionelt forbedrede 3D hiPSC-CM-modeller såsom konstruerede hjertevæv (ECT'er) vil resultere i et forbedret CCM-induceret kontraktilt respons under fysiologiske calciumkoncentrationer 8,38. Endelig er protokollen beskrevet her designet til et 48-brøndsformat. Men med optimering og inkludering af automatisering kan dette skaleres til et højt gennemløbsformat (f.eks. 96-brønds- eller 384-brøndplader).
Den nuværende guldstandard for hiPSC-CM-undersøgelser er konventionelle stive 2D-kulturbetingelser (dvs. vævskulturplast eller glas). Selvom den konventionelle metode er nyttig til elektrofysiologi3 og calciumhåndtering39 undersøgelser, resulterer den i minimale kontraktile egenskaber 5,6,7. Som følge heraf kan konventionelle stive 2D-kulturbetingelser ikke vurderes af CCM's kontraktile virkninger8. Funktionelt forbedrede 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 er teknisk udfordrende, tidskrævende og kræver sofistikeret udstyr, der ikke er let tilgængeligt i alle laboratorier. I denne protokol beskriver vi en simpel metode til at generere robust sammentrækkende 2D hiPSC-CM-monolag inden for en kortere tidsramme end 3D ECT-metoder eller langsigtede, konventionelle 2D-metoder 7,40,41. Desuden er de reagenser, der anvendes her, kommercielt tilgængelige, herunder hydrogelsubstratet og hiPSC-CM'erne, og begge har betydelig lot-to-lot konsistens. Mens vi brugte aftagelige platintrådelektroder (interelektrodeafstand: 2,0 mm, bredde: 1,0 mm), er forskellige elektrodematerialer og konfigurationer modtagelige for CCM-kontraktile vurderinger in vitro 8,15,17,18,22. Ligeledes er der flere automatiserede software til rådighed, der muliggør analyse af sammentrækningsvideoer 7,31,32.
De fleste ikke-kliniske metoder til evaluering af kontraktilitet i forbindelse med hjertemedicinsk udstyr er i vid udstrækning baseret på dyre in vivo-dyremodeller (f.eks. hunde eller svin) og teknisk udfordrende papillære muskelstrimler (f.eks. kaniner)18. Dette papir beskrev en human in vitro-model til evaluering af virkningerne af hjerteelektrofysiologi, medicinsk udstyrssignaler på kontraktilitet. Dette værktøj kan reducere afhængigheden af dyreforsøg og være nyttigt til in vitro-evaluering af de kontraktile egenskaber ved hjerteelektrofysiologiudstyr.

Efterhånden som den amerikanske befolkning bliver ældre, fortsætter antallet af patienter med hjertesvigt med at stige sammen med de direkte medicinske omkostninger 1,2. Der er et kritisk behov for at udvikle nye terapier til behandling af hjertesvigt og innovative ikke-kliniske metoder til at teste sådanne terapier. Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er blevet foreslået som et in vitro-værktøj til støtte for den terapeutiske udviklingsproces og er blevet anvendt i regulatoriske indlæg 3,4. Deres udbredte anvendelse har imidlertid været begrænset til kontraktilitetsundersøgelser på grund af manglen på robuste kontraktile egenskaber, når de belægges under standard stive 2D-kulturbetingelser (dvs. konventionel vævskulturplast eller glas)5,6,7,8. Vi har tidligere demonstreret nytten af plettering af isolerede enkelte hiPSC-CM'er på et fleksibelt hydrogelsubstrat for at generere robuste synlige kontraktile egenskaber9. Vi viste, at isolerede hiPSC-CM'er har sammenlignelige kontraktile egenskaber med dem hos nyligt isolerede voksne ventrikulære kardiomyocytter hos voksne. Desuden demonstrerede vi nytten af denne metode til vurdering af kontraktile responser på farmakologiske midler7. Desuden har andre undersøgelser anvendt denne teknologi til mekanistiske vurderinger til grundvidenskab og sygdomsmodellering10,11,12. Her er denne metode blevet udvidet til 2D hiPSC-CM monolag, og dens anvendelighed til evaluering af fysiologisk relevante elektriske signaler om hjertekontraktilitetsmodulation (CCM) medicinsk udstyr in vitro demonstreres.
CCM er en intrakardial hjertesvigtsbehandling, hvor ikke-excitatoriske elektrofysiologiske signaler leveres til myokardiet i den absolutte ildfaste periode af hjertecyklussen13,14. Der mangler reproducerbare metoder til evaluering af CCM i humane hjertecellemodeller. Tidligere arbejde har anvendt forskellige hjertecellemodeller til at evaluere CCM-kontraktilresponsen. Vi demonstrerede in vitro, at nyligt isolerede kaninventrikulære kardiomyocytter reagerer på CCM-stimulering ved en forbigående stigning i calcium og sammentrækningsamplitude15. En anden undersøgelse af isolerede ventrikulære kardiomyocytter hos hunde viste CCM-induceret forbedring af den intracellulære calciumtransiente amplitude16. I de fleste CCM-undersøgelser er der imidlertid anvendt ex vivo- og in vivo-præparater til dyr. Disse undersøgelser er vanskelige at korrelere med hinanden, fordi de anvender en række CCM-pulsparametre og arter17. En undersøgelse i en isoleret kaninpapillær model afslørede øget CCM-induceret kontraktilitet8,18, og en række helhjerteundersøgelser har vist CCM-induceret forbedring af kontraktil funktion19,20,21. Disse undersøgelser har givet vigtig mekanistisk indsigt. Der mangler imidlertid reproducerbare humane modeller for in vitro kardiale EP-kontraktile studier, herunder CCM. Til det formål har vi udviklet flere 2D- og 3D hiPSC-modeller og demonstreret CCM-induceret forbedring af kontraktile egenskaber på en parameterafhængig måde. Desuden har de CCM-inducerede inotrope virkninger vist sig at være delvist medieret af neuronal input og β-adrenerg signalering 8,17,22. Alligevel skal der vides mere om mekanismerne i CCM-terapi, og udnyttelse af kontraherende humane kardiomyocytter kan hjælpe med at opnå dette resultat. Som sådan er der et betydeligt behov for at udvikle humane ikke-kliniske værktøjer til evaluering af nye CCM-enheder og -signaler, fremskynde reguleringsprocessen, reducere byrden på dyremodeller og hjælpe enhedsudvikleremed at træffe beslutninger 8,17,23,24. Det er vigtigt at udvikle nemme, gør-det-selv-protokoller, der kan overføres til ethvert laboratorium, og som bruger standardudstyr og lave cellekrav for at reducere omkostningerne. Denne metode belyser virkningerne af CCM-stimulering på human kardiomyocytfunktion og giver vigtig indsigt i CCM-sikkerhed eller effektivitet17. Her beskriver vi metoden til generering af 2D hiPSC-CM-monolag på et fleksibelt hydrogelsubstrat for at producere et standardiseret ikke-klinisk værktøj til kvantificering af akut hjerteelektrofysiologi medicinsk udstyr (dvs. CCM) kontraktile reaktioner i sundhed og sygdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) undersøges i øjeblikket til flere in vitro-applikationer og er blevet anvendt i regulatoriske indsendelser. Her udvider vi deres anvendelse til hjertemedicinsk udstyrs sikkerhed eller ydeevnevurderinger. Vi udviklede en ny metode til evaluering af kontraktile egenskaber for hjertemedicinsk udstyr i robust sammentrækkende 2D hiPSC-CMs monolag belagt på et fleksibelt ekstracellulært matrix (ECM) -baseret hydrogelsubstrat. Dette værktøj muliggør kvantificering af virkningerne af hjerteelektrofysiologiske enhedssignaler på menneskelig hjertefunktion (f.eks. kontraktile egenskaber) med standard laboratorieudstyr. 2D hiPSC-CM-monolagene blev dyrket i 2-4 dage på et fleksibelt hydrogelsubstrat i et 48-brønds format.
hiPSC-CM'erne blev udsat for standard hjertekontraktilitetsmodulation (CCM) elektriske signaler til medicinsk udstyr og sammenlignet med kontrol (dvs. kun pacing) hiPSC-CM'er. De grundlæggende kontraktile egenskaber for 2D hiPSC-CM'erne blev kvantificeret ved videobaseret detektionsanalyse baseret på pixelforskydning. De CCM-stimulerede 2D hiPSC-CM'er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat viste signifikant forbedrede kontraktile egenskaber i forhold til baseline (dvs. før CCM-stimulering), herunder en øget peak kontraktionsamplitude og accelereret sammentræknings- og afslapningskinetik. Desuden muliggør udnyttelsen af det fleksible hydrogelsubstrat multiplexing af de videobaserede kardiokalitationskontraktionskoblingsaflæsninger (dvs. elektrofysiologi, calciumhåndtering og sammentrækning) i raske og syge hiPSC-CM'er. Den nøjagtige detektion og kvantificering af virkningerne af hjerteelektrofysiologiske signaler på menneskelig hjertesammentrækning er afgørende for udvikling, optimering og de-risiko for hjertemedicinsk udstyr. Denne metode muliggør robust visualisering og kvantificering af de kontraktile egenskaber af hjertesyncytium, hvilket bør være værdifuldt for ikke-klinisk hjertemedicinsk udstyrs sikkerhed eller effektivitetstest. Dette papir beskriver detaljeret metoden til generering af 2D hiPSC-CM hydrogel substratmonolag.

Beskrevet i denne protokol er et simpelt, robust værktøj til at generere synligt sammentrækkende 2D hiPSC-CM monolag på et fleksibelt hydrogelsubstrat. Måling af kontraktile egenskaber opnås med videobaseret optagelse kombineret med kontraktilitetsanalysesoftware. Dette muliggør kvantificering af nøgleparametre for kardiomyocytkontraktilitet, herunder sammentrækningsamplitude, sammentrækningshældning, afslapningshældning, tid til top, tid til baseline 90% og sammentrækningsvarighed 50%. Modellen bruges til at karakterisere baseline kontraktile egenskaber af hiPSC-CM'er (figur 4) fra forskellige "sunde" donorer og kan udvides til evaluering af hjerteelektrofysiologi medicinsk udstyr signaler (dvs. CCM). Anvendelsen af CCM-standardstimuleringsparametrene (figur 1D)29,30 resulterede i forbedrede kontraktile egenskaber in vitro (figur 5 og tabel 1)17.
Vi demonstrerede endvidere, at denne metode kan bruges til at evaluere virkningerne af moduleringen af ekstracellulære calciumkoncentrationer på humane kontraktile egenskaber med og uden CCM-stimulering (figur 6)17. Den forventede calciumafhængighed af sammentrækning ved baseline blev observeret 7,17 såvel som en CCM-induceret stigning i calciumfølsomhed på niveauet af kardiomyocytmonolaget. Desuden afslørede den farmakologiske undersøgelse af den β-adrenerge signalvej (figur 7), at de CCM-inducerede inotrope virkninger delvis blev medieret af β-adrenerg signalering17. Desuden kan dette værktøj udvides til patientspecifikke sygdomskardiomyocytter, herunder dilateret kardiomyopati (DCM)33,34,35 (figur 8), for at forstå effekten af CCM i forbindelse med sygdomstilstande; faktisk blev forbedret kontraktil amplitude og accelereret sammentræknings- og afslapningskinetik observeret ved CCM "dosis" testet her (figur 8). Mens vi har en CCM-efterlignende enhed i vores laboratorium, er den metode, der anvendes her, ikke specifik for dette system og kan anvendes på andre hjerteelektrofysiologiske enheder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk resumé af 2D hiPSC-CM in vitro CCM-modellen. (A) HiPSC-CM'erne er forbelagt i monolagsformat på gelatine (0,1%)-belagte 6-brøndsplader. (B) Efter 2 dage i kultur dissocieres hiPSC-CM'erne og forberedes til plettering på et fleksibelt hydrogelsubstrat. (C) De isolerede hiPSC-CM'er belægges med høj densitet på hydrogelsubstrater opstillet i et 48-brøndformat (venstre) og analyseres i (0,5 mM) ekstracellulært calcium Tyrodes opløsning (højre). D) Der anvendes en kommerciel pulsgenerator og kliniske CCM-standardpulsparametre29,30 (højre) til stimulering af hiPSC-CM'erne. Hjertefunktionen vurderes ved videobaseret analyse (venstre). E) Repræsentative kontraktionsregistreringer før CCM (baseline: 5 V), under CCM (CCM: 10 V) og efter CCM (genfinding: 5 V). Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk oversigt over belægning og såning af fleksibelt hydrogelsubstrat. (A) Helt optøet, ufortyndet ECM-baseret hydrogelsubstrat påføres en steril 48-brønds plade (venstre panel) med 1 μL hydrogelsubstrat pr. hul (højre panel). (B) Hydrogelsubstratet får lov til at inkubere ved stuetemperatur i 8-10 min (højre panel), efterfulgt af plettering af hiPSC-CM'erne med høj densitet i et lavt medium volumen (~ 200 μL) (venstre panel). (C) Efter 10-15 minutters inkubation tilsættes medium til hvert hul (venstre panel), og pladerne flyttes til en standard vævskulturinkubator (højre panel). Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrix, hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; RT = stuetemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Figur 3: Ekstracellulært matrixbaseret hydrogelsubstrat. A) Repræsentativt hydrogelsubstrat (ingen celler) i en brønd i en 48-brønds glasbundplade umiddelbart efter, at substratet er påført brønden. B) Tid 0 efter podning af hiPSC-CM'erne. C) Tid 24 timer efter, at hiPSC-CM'erne er podet. Dette panel blev genoptrykt fra Feaster et al.17. De hvide pile angiver kanten af hydrogelsubstratet, 4x forstørrelse. Vægtstang = 1 mm. Forkortelse: hiPSC-CM = human induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Figur 4: Karakterisering af 2D hiPSC-CM monolags kontraktile egenskaber. (A) Repræsentativ kontraktionsoptagelse af 2D hiPSC-CM'er pacet ved 1 Hz (5 V). (B) Repræsentative sammentrækningsspor, der viser en sammentrækningscyklus. (C) Oversigtssøjlediagrammer. Dataene er gennemsnitlige ± SEM. n = 18. Forkortelse: hiPSC-CM = human induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Figur 5: Akut effekt af CCM på 2D hiPSC-CM kontraktile egenskaber. A) Repræsentativ sammentrækningsregistrering for før CCM (5 V), under CCM (10 V) og efter CCM (5 V). (B) Repræsentative sammentrækningsspor af de umiddelbare virkninger (dvs. sidste før CCM-slag, første CCM-slag og første efter CCM-slag, angivet med +). (C) Sammenfattende søjlediagrammer over de umiddelbare virkninger. Procentvis ændring, data er gennemsnitlige ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Figur 6: Effekt af ekstracellulær calciummodulation på CCM-responsen. A) repræsentative sammentrækningsspor af de umiddelbare virkninger for hver gruppe før CCM (5 V), under CCM (10 V) og efter CCM (5 V) hiPSC-CM'erne blev udsat for stigende koncentrationer af ekstracellulært calcium (Cao) på 0,25-2 mM. (B-D) Transformerede data (sigmoidal) til at guide øjet, der demonstrerer effekten af CCM på calciumfølsomheden af de kontraktile egenskaber (dvs. amplitude og kinetik) (bakkehældning = 1,0). n = 6-8 pr. Gruppe. Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Figur 7: Farmakologisk udfordring. repræsentative kontraktionsspor for hver gruppe før CCM (5 V), under CCM (10 V) og efter CCM (5V) hiPSC-CM'erne blev forbehandlet med (A) vehikel eller (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Oversigtssøjlediagrammer for hver betingelse. Procentvis ændring, data er gennemsnitlige ± SEM. n = 10 pr. Gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Figur 8: Akut effekt af CCM på de kontraktile egenskaber hos syge 2D hiPSC-CM'er. (A) Repræsentativt kontraktionsspor for DCM L35P, kontrolbaseline (før 6 V) og DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Oversigtssøjlediagrammer. Procentvis ændring, data er gennemsnitlige ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering; DCM = dilateret kardiomyopati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende Video S1: Timelapse af hiPSC-CM'erne på den ekstracellulære matrixbaserede hydrogel. Todimensionelle hiPSC-CM'er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat; Tid: 0-90 timer; en brønd af en 48-brønds glasbundplade; 4x forstørrelse. hiPSC-CM'erne danner et vandret monolags syncytium (dvs. venstre mod højre). Vægtstang = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende Video S2: hiPSC-CM'er på den ekstracellulære matrixbaserede hydrogel. Todimensionelle hiPSC-CM'er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat; Tid: ~ 24 timer; en brønd af en 48-brønds glasbundplade; 4x forstørrelse. HiPSC-CM'erne danner monolagsmorfologi og viser robust sammentrækning ved ~ 24 timer efter plettering. Vægtstang = 1 mm. Denne video er fra Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Efter</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid til peak 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid til top 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid til baseline 50%</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Tid til baseline 90%</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Sammentrækning varighed 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Sammentrækning varighed 50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Sammentrækning varighed 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Kontraktile egenskaber. Procentvis ændring i forhold til før CCM (5 V); dataene er gennemsnitlige ± SEM for alle slag i hver gruppe under CCM (10 V) og efter CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne tabel er genoptrykt fra Feaster et al.17.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Her demonstrerer vi en ikke-invasiv kontraktilitetsevalueringsmetode for hjertemedicinsk udstyr ved hjælp af 2D humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt (hiPSC-CM) monolag, belagt på et fleksibelt substrat kombineret med videobaseret mikroskopi. Dette værktøj vil være nyttigt til in vitro-evaluering af kontraktile egenskaber af hjerteelektrofysiologiske enheder.

Evaluering af hjertekontraktilitetsmodulationsterapi i 2D humane stamcelleafledte kardiomyocytter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Office of Science and Engineering Laboratories hos FDA udvikler lovgivningsmæssige videnskabelige værktøjer til at hjælpe udviklere af medicinsk udstyr og FDA-korrekturlæsere. Vores ultimative mål er at fremskynde patienternes adgang til innovativt, sikkert og effektivt medicinsk udstyr gennem den bedste tilgængelige videnskab. I denne protokol anvender vi banebrydende induceret pluripotent stamcelleteknologi til vurdering af medicinsk udstyr, der bruges til behandling af livstruende hjertesygdomme.Dette enkle værktøj muliggør reproducerbar evaluering af hjerteelektrofysiologiske enheder i skålen ved hjælp af standard laboratorieudstyr. Det kan også bruges med patientspecifikke celler afledt af donorer med forskellige hjertesygdomme. Til at begynde med plades de optøede humane iPSC-afledte kardiomyocytter på 0,1% gelatinebelagte sterile seksbrøndsplader mindst to dage før såning af kardiomyocytterne på det fleksible hydrogelsubstrat.Dyrk de humane iPSC-afledte kardiomyocytter i standard kardiomyocytmedium i to til fire dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid for at give dem mulighed for at komme sig efter kryokonserveringen. Opdater det brugte medium med 100% kardiomyocytmedium hver 48. time. Kontroller status for de humane iPSC-afledte kardiomyocytter før dissociation ved at evaluere cellernes sundhed, sikre levedygtighed og stabil slag.Vask kardiomyocytterne med fire ml pr. Brønd DPBS uden calciumchlorid eller magnesiumchlorid. Tilsæt en milliliter stuetemperaturdissociationsreagens til hver brønd og inkuber i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Derefter tilsættes 10 ml kardiomyocytmedium til et sterilt 15 ml konisk rør.Dissocier kardiomyocytterne fra de seks-brøndplader med en 1.000 mikroliter pipette og tilsæt cellesuspensionen til det koniske rør. Skyl brøndene med en milliliter frisk kardiomyocytmedium for at opsamle eventuelle resterende kardiomyocytter og tilsæt dem til det koniske rør. Derefter bringes det endelige volumen af det koniske rør til 15 ml med mediet.Glasset centrifugeres ved 200 G i fem minutter, og supernatanten fjernes op til 1 ml. Resuspender cellerne i kardiomyocytmediet til et slutvolumen på fem milliliter og tæl kardiomyocytterne med en manuel eller automatiseret celletæller. Derefter inkuberes kardiomyocytcellesuspensionen i ca. 30 minutter ved stuetemperatur, mens de fleksible hydrogelsubstrater fremstilles.Klargør en 20 mikroliter pipette indstillet til en mikroliter, pipettespidser, en steril 48-brønds glasbundplade og en stopurstimer i vævskulturhætten. Bland det ekstracellulære matrix eller ECM-baserede hydrogelsubstrat ved forsigtigt at banke på røret og straks placere det tilbage på is. Start stopurstimeren umiddelbart før plettering af det første hydrogelsubstrat, og markér dette som tid nul.Pipetter en mikroliter af hydrogelsubstratet op og ned ca. tre gange for at afkøle pipettespidsen. Påfør derefter ca. en mikroliter af det ufortyndede hydrogelsubstrat vandret på bunden af hvert hul i 48-brøndpladen, mens pipetten holdes i en 45 graders vinkel. Plade alle hydrogelsubstraterne i samme retning i hvert hul for at hjælpe med at identificere substratet, når eksperimenterne udføres ved 40X forstørrelse.Anbring låget på 48-brøndspladen, og lad hydrogelsubstraterne inkubere i otte til 10 minutter ved stuetemperatur i vævskulturhætten, før cellerne tilsættes. Efter inkubationen skal du straks frø kardiomyocytterne dråbevis direkte på hydrogelsubstraterne med ca. 30.000 levedygtige kardiomyocytter pr. Brønd i et lavt mediumvolumen på ca. 200 mikroliter kardiomyocytmedium. Efter lukning af låget skal kardiomyocytterne inkuberes uforstyrret i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur i emhætten for at gøre det muligt for cellerne at klæbe til hydrogelsubstratet.Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter frisk kardiomyocytmedium til hvert hul. Placer lågets lukkede plade på en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i to til fire dage. Tænd mikroskopet og miljøkontrolkammeret for at ekvilibrere til 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Fjern kardiomyocytmediet fra 48-brøndpladen og skyl forsigtigt hver brønd to gange med 600 mikroliter hjertekontraktilitetsmodulation eller CCM-assaymedium. Derefter tilsættes 300 mikroliter CCM-analysemedium pr. brønd, og pladen med 48 brønde anbringes på mikroskopet i miljøkontrolkammeret. Indsæt elektroderne og ligevægt cellerne i fem minutter.For at optage sammentrækningsvideoerne ved hjælp af videobaseret mikroskopi skal du åbne videooptagelsessoftwaren og indstille en billedhastighed på 100 billeder pr. Sekund. Vælg derefter et område af interesse eller ROI nær midten af hiPSC-CM-monolaget. Derefter stimulerer feltet cellerne med en kommerciel pulsgenerator til elektrisk tempo 2D kardiomyocytter monolag.Placer kardiomyocytten ved 1,5 gange tærsklen ved en hertz med baseline pulsparametre. For eksempel monofasiske kvadratbølgepacing pulser med en to millisekund stimuluspulsvarighed på fem volt. Optag baseline pacing only contraction video før CCM i mindst fem slag.Derefter stimulerer kardiomyocytterne monolag med et eksperimentelt elektrisk signal med 30 millisekunders forsinkelse, to symmetriske bifasiske impulser med 5,14 millisekunders fasevarighed med 20,56 millisekunder samlet varighed, 10 volt faseamplitude og nul interfaseinterval. Optag den CCM-inducerede sammentrækningsvideo i mindst fem slag. Sluk for CCM-signalet, stimuler med en baseline pacingpuls og optag en sammentrækningsvideo af restitutionsperioden efter CCM i mindst fem slag.Brug en standard sammentrækningssoftware til automatisk at analysere sammentrækningsvideoerne og kvantificere de vigtigste kontraktile egenskaber som sammentrækningsamplitude, sammentrækningshældning, afslapningshældning, tid til top, tid til baseline 90% og sammentrækningsvarighed 50%De 2D humane iPSC-afledte kardiomyocytter monolags kontraktlige egenskaber blev karakteriseret, og nøgleparametrene for kardiomyocytkontraktilitet blev kvantificeret. Anvendelsen af standard CCM-stimuleringsparametre resulterede i forbedrede kontraktile egenskaber in vitro. Virkningerne af ekstracellulær calciumkoncentrationsmodulering på humane kontraktile egenskaber med og uden CCM-stimulering blev evalueret.Den forventede calciumafhængighed af sammentrækning ved baseline blev observeret såvel som en CCM-induceret stigning i calciumfølsomhed på niveauet af kardiomyocytmonolaget. Derudover afslørede den farmakologiske undersøgelse af beta androgen signalvej, at de CCM-inducerede inotrope virkninger delvis blev medieret af beta-adrenerg signalering. Desuden kan dette værktøj udvides til patientspecifikke sygdomskardiomyocytter, herunder dilateret kardiomyopati for at forstå effekten af CCM i forbindelse med sygdomstilstande.Her fokuserer vi primært på evaluering af menneskelige kontraktile egenskaber. Ved hjælp af dette værktøj kunne man imidlertid også evaluere andre hjerteexcitationskontraktionskoblingsaflæsninger, herunder handlingspotentialer og calciumhåndtering. Dette er det første regulatoriske videnskabelige værktøj, der kombinerer induceret pluripotent stamcelle ved hjælp af teknologi med vurdering af hjerteudstyr.Denne alternative metode baner vejen for, at medicinsk udstyr kan vurderes i en skål, og har potentiale til at reducere behovet for dyre- og forsøgsundersøgelser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruktioner af Human Cardiac Venøs System ved hjælp Kontrast-computertomografi af Perfusion-faste Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave Anvendelse cellekulturer

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fremstilling af 3D-hjertemikrovævarrays ved hjælp af humane iPSC-afledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induktion af humane dental pulp stamceller mod bugspytkirtel afstamning

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...