Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een benoeming in het Research Participation Program bij het Center for Devices and Radiological Health, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and Education via een interagency-overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van Energie en de Amerikaanse Food and Drug Administration. De auteurs bedanken Richard Gray, Trent Robertson en Anna Avila voor hun suggesties en technische assistentie. De studie werd gefinancierd door de Amerikaanse Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.

1. Voorbereiding van de platen en media
OPMERKING: Een typische extracellulaire matrix (ECM)-gebaseerde hydrogel aliquot is ~ 200 μL in een steriele 1,5 ml buis opgeslagen bij −20 °C.
<ol><li>Bereid in een steriele weefselkweekkap een steriele 6-putplaat door 2 ml 0,1% gelatine (materiaaltabel) over te brengen naar elk putje. Plaats het deksel op de 6-putplaat en laat de gecoate plaat minimaal 1 uur incuberen bij 37 °C.</li>
	<li>Een dag voor het zaaien van de hiPSC-CMs op het flexibele hydrogelsubstraat, ontdooi je een hydrogel (Table of Materials) aliquot in de koelkast op ijs.</li>
	<li>Bereid het cardiomyocytenmedium (materiaalopgave) voor door 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x B-27-supplement en 5 ml penicilline-streptomycine9 te mengen.</li>
</ol>2. Zaaien van gecryopreserveerde hiPSC-CMs
<ol><li>Twee dagen voor het zaaien van de hiPSC-CMs op het flexibele hydrogelsubstraat, pre-plate de hiPSC-CMs op 0,1% gelatine-gecoate steriele 6-well platen. Ontdooi de hiPSC-CMs met behulp van een standaard ontdooiprotocol 9,25.</li>
	<li>Vervolgens plaat 1.500.000 totale hiPSC-CMs (Table of Materials) per put volgens de instructies van de fabrikant (figuur 1A)26.</li>
	<li>Kweek de hiPSC-CMs gedurende 2-4 dagen in standaard cardiomyocytenmedium om de hiPSC-CMs te laten herstellen van de cryopreservatie bij 37 °C en 5% CO2. Ververs het gebruikte medium elke 48 uur met 100% cardiomyocytenmedium.</li>
</ol>3. Dissociatie en telling van de voorgeplateerde hiPSC-CMs
<ol><li>Controleer de status van de hiPSC-CMs vóór dissociatie. Evalueer de gezondheid van de hiPSC-CMs, zorg voor levensvatbaarheid en stabiel kloppen. OPMERKING: De zuiverheid van de hiPSC-CM-populatie is belangrijk (bijv. >90% cardiale troponine T)7. Een cardiomyocytenselectiemethode (bijv. metabole selectie of sortering) wordt aanbevolen om de verstoring van het hydrogelsubstraat door niet-cardiomyocytencellen te verminderen25,26.</li>
	<li>Was de hiPSC-CMs 2x met 4 ml per putje D-PBS zonder CaCl 2 of MgCl2 (Materiaalopgave). Zuig de D-PBS op, voeg 1 ml dissociatiereagens bij kamertemperatuur toe aan elk putje en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 10 ml cardiomyocytenmedium toe aan een steriele conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Dissocieer de hiPSC-CMs van de 6-well plaat met een pipet van 1.000 μL (figuur 1B). Voeg de celsuspensie toe aan de 15 ml conische buis26.</li>
	<li>Spoel de put af met 1 ml vers cardiomyocytenmedium om eventuele resterende hiPSC-CMs te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis van 15 ml. Breng het uiteindelijke volume van de conische buis op 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten (200 × g). Verwijder het supernatant tot de 1 ml markering. Resuspendeer de cellen in cardiomyocytenmedium tot een eindvolume van 5 ml.</li>
	<li>Tel de hiPSC-CMs met een handmatige of geautomatiseerde celteller.</li>
	<li>Incubeer de hiPSC-CM suspensie bij kamertemperatuur terwijl de flexibele hydrogelsubstraten worden voorbereid (maximaal 30 minuten).</li>
</ol>4. Bereiding van de flexibele hydrogelsubstraten
<ol><li>Bereid een pipet van 20 μL op 1 μL, 20 μL pipetpunten (bijv. 20 μL) en een steriele glazen bodemplaat van 48 well. Zorg ervoor dat er een stopwatch/timer klaar staat voordat je de hydrogelsubstraten maakt.</li>
	<li>Meng in de steriele weefselkweekkap het op ECM gebaseerde hydrogelsubstraat door zachtjes op de buis te tikken en plaats deze onmiddellijk terug op ijs.</li>
	<li>Start vervolgens de stopwatch / timer onmiddellijk voordat het eerste hydrogelsubstraat is verguld - dit is tijd nul.</li>
	<li>Pipetteer 1 μL van het hydrogelsubstraat op en neer ~3x om de pipetpunt te koelen. Breng ~ 1 μL van het onverdunde hydrogelsubstraat horizontaal aan op de bodem van elke put van de 48-putplaat (figuur 1C, figuur 2A en figuur 3A), waarbij u de pipet in een hoek van 45° houdt. Plaats alle hydrogelsubstraten in dezelfde richting in elke put (figuur 2 en figuur 3) om het substraat te helpen identificeren bij het uitvoeren van de experimenten met 40x vergroting 7,9,17,27. OPMERKING: Elke ~1 μL lijn is één hydrogelsubstraat (figuur 3). Meestal duurt het ~ 5 minuten om 48 putten voor te bereiden. Het gebruik van een horizontaal gekantelde microplaatstandaard (bijv. 30°) kan een beter zicht op de bodem van de put en het hydrogelsubstraat mogelijk maken. Zorg ervoor dat u de hele lengte van de put gaat (d.w.z. van links naar rechts). Korte hydrogelsubstraten kunnen te dik zijn, waardoor de stabiliteit van het substraat afneemt. Laat het hydrogelsubstraat niet drogen in de pipetpunt. Als dit gebeurt, schakel dan snel over naar een nieuwe tip en ga onmiddellijk verder. Als alternatief kunnen gekoelde pipetpunten worden gebruikt. Het op ECM gebaseerde hydrogelsubstraat kan snel polymeriseren wanneer het niet op ijs ligt. De voorbereiding van meerdere putten tegelijk (bijv. 10) wordt voorgesteld. Daarnaast wordt het oefenen in een mock 48-well plaat aanbevolen.</li>
	<li>Plaats het deksel op de 48-putplaat en laat de hydrogelsubstraten 8-10 minuten bij kamertemperatuur in de steriele weefselkweekkap incuberen voordat u de cellen toevoegt (figuur 2B). OPMERKING: Het is belangrijk om je te houden aan de voorgestelde incubatietijden. Een incubatietijd van meer dan 10 min zal leiden tot stijve hydrogelsubstraten en geen zichtbare samentrekkingen. Een incubatietijd van minder dan 8 min kan leiden tot substraten die instorten.</li>
	<li>Zaai de hiPSC-CMs onmiddellijk druppelsgewijs rechtstreeks op de hydrogelsubstraten, met ~ 30.000 levensvatbare hiPSC-CMs per put in een laag gemiddeld volume van ~ 200 μL cardiomyocytenmedium, met behulp van een pipet van 1.000 μL (figuur 2B en figuur 3B). OPMERKING: Dit proces stopt de polymerisatie van het hydrogelsubstraat en zorgt ervoor dat de hiPSC-CMs zich op het substraat 7,9,17,27 bevinden.</li>
	<li>Plaats het deksel op de plaat en laat de hiPSC-CMs gedurende 10-15 minuten ongestoord incuberen bij kamertemperatuur (figuur 2C) in de steriele weefselkweekkap om de hiPSC-CMs in staat te stellen zich aan het hydrogelsubstraat te hechten.</li>
	<li>Voeg voorzichtig ~ 100 μL vers cardiomyocytenmedium toe aan elke put (eindvolume: ~ 300 μL per put). Plaats het deksel op de plaat en breng het over naar een incubator bij 37 °C, 5% CO 2 gedurende2-4 dagen. Ververs het 100% medium elke 24 uur voordat de contractie-experimenten worden uitgevoerd. OPMERKING: Inspecteer de hiPSC-CMs visueel op de juiste morfologie; onmiddellijk na het plateren moeten de hiPSC-CMs rond verschijnen (figuur 3B). Op dag 2 na het zaaien zal een confluent 2D hiPSC-CM monolayer syncytium worden waargenomen (Figuur 3C) (Supplemental Video S1) met robuuste zichtbare contractie (Supplemental Video S2).</li>
</ol>5. Registratie en analyse van de contractie
<ol><li>Bereid het CCM-testmedium, de oplossing van Tyrode die het volgende bevat (in mmol/L): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glucose 10 en HEPES 10, met de pH aangepast tot 7,4 met NaOH en evenwicht tot 37 °C in een waterbad. OPMERKING: Submaximaal extracellulair calcium (0,5 mM) wordt gebruikt om het CCM-testvenster te verbeteren.</li>
	<li>Zet de microscoop en de omgevingscontrolekamer aan om in evenwicht te komen tot 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder het cardiomyocytenmedium uit de 48-putplaat en spoel elk putje voorzichtig tweemaal af met 600 μL CCM-testmedium.</li>
	<li>Voeg 300 μL CCM-testmedium per put toe en plaats de 48-well-plaat op de microscoop in de omgevingscontrolekamer. Plaats de elektroden en breng de cellen gedurende 5 minuten in evenwicht.</li>
	<li>Gebruik videogebaseerde microscopie om de contractievideo's op te nemen. Open de video-opnamesoftware en stel een framesnelheid van 100 frames / s in. Selecteer een interessegebied (ROI) in de buurt van het midden van de hiPSC-CM monolaag. OPMERKING: Selecteer geen ROI aan de rand van de hiPSC-CM monolagen, omdat dit onstabiel kan zijn voor contractiele opnames.</li>
	<li>Vervolgens stimuleert het veld de cellen met een commerciële pulsgenerator (Table of Materials) om de 2D hiPSC-CM monolagen elektrisch te versnellen. Tempo de hiPSC-CMs op 1,5x drempel bij 1 Hz met baseline pulsparameters (bijv. monofasische blokgolf pacing pulsen met een 2 ms stimulus pulsduur van ~14 V/cm)17.</li>
	<li>Neem de basislijn op, alleen pacing (d.w.z. vóór de CCM) (figuur 1D) contractievideo voor minimaal vijf slagen17,28.</li>
	<li>Stimuleer vervolgens de hiPSC-CM monolaag met een experimenteel elektrisch signaal (figuur 1D). Gebruik voor het volgen van dit protocol de standaard CCM-stimulatieparameters: twee symmetrische bifasische pulsen van 5,14 ms faseduur (20,56 ms totale duur), ~28 V/cm (faseamplitude), nul interfase-interval en een vertraging van 30 ms (d.w.z. tijd vanaf het einde van de pacingpuls tot het begin van de CCM-puls) (Figuur 1D)29,30 en neem de CCM-geïnduceerde contractievideo op voor minimaal vijf slagen.</li>
	<li>Schakel het CCM-signaal uit, stimuleer met een baseline pacing-puls en neem een contractievideo op van de herstelperiode (d.w.z. na de CCM) voor minimaal vijf slagen.</li>
	<li>Gebruik standaard contractiesoftware om de contractievideo's automatisch te analyseren en de belangrijkste contractiele eigenschappen te kwantificeren (bijv. De contractieamplitude, contractiehelling, ontspanningshelling, tijd tot piek, tijd tot basislijn 90% en contractieduur 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Gebruik de 2D hiPSC-CMs op het flexibele hydrogelsubstraat voor contractiele experimenten van dag 2-14 na het plateren op het substraat.</li>
</ol>

Dit artikel weerspiegelt de standpunten van de auteurs en mag niet worden opgevat als een weergave van de standpunten of het beleid van de Amerikaanse Food and Drug Administration. De vermelding van commerciële producten, hun bronnen of hun gebruik in verband met het hierin gerapporteerde materiaal mag niet worden opgevat als een feitelijke of impliciete goedkeuring van dergelijke producten door het ministerie van Volksgezondheid en Human Services. De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen voor dit werk.

Het hierin beschreven protocol beschrijft een methode om robuust samentrekkende 2D hiPSC-CM monolagen te genereren op een flexibel extracellulair matrix (ECM)-gebaseerd hydrogelsubstraat met commerciële reagentia 7,17. De hiPSC-CMs die op het flexibele hydrogelsubstraat zijn gezaaid, blijven levensvatbaar en hebben verbeterde contractiele eigenschappen7. Deze techniek is gebaseerd op standaard laboratoriumapparatuur en mogelijkheden7. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, waaronder met betrekking tot het werken met het op ECM gebaseerde hydrogelsubstraat, die zorgvuldige aandacht voor detail vereisen. Een mogelijk probleem is de aanwezigheid van serum in het medium. Dit kan ertoe leiden dat de hiPSC-CMs netwerken vormen (bijv. endotheel/vasculaire netwerken) in plaats van een confluente monolaagplaat; daarom wordt een serumvrij medium aanbevolen tijdens de oprichting van de flexibele hydrogel hiPSC-CM monolagen (d.w.z. dag 0 tot dag 4). Evenzo kan het bereiden van te veel hydrogelsubstraten tegelijk resulteren in slechte of ongelijke substraten als gevolg van vermoeidheid van de operator. Hoewel het belangrijk is om snel te werken, is de integriteit van elk hydrogelsubstraat van cruciaal belang. Evenzo moet men de hiPSC-CMs zorgvuldig zaaien en het medium veranderen; Dat moet niet met geweld gebeuren. Bij het veranderen van het medium moet het voorzichtig vanaf de bovenrand van de put worden toegevoegd om het hydrogelsubstraat of de cellen niet te verstoren. Net als bij standaard 2D hiPSC-CM-culturen (d.w.z. conventioneel weefselkweekplastic of glas), zal plating met een lage dichtheid resulteren in onvolledige monolaagvorming. Het is belangrijk om de hiPSC-CMs visueel te inspecteren om te bevestigen dat ze zich op het hydrogelsubstraat bevinden en om een timer te gebruiken om een nauwkeurige timing te garanderen. Bovendien kan het kweken van de 2D hiPSC-CM monolagen gedurende meer dan 14 dagen op het hydrogelsubstraat resulteren in verstoring van de monolaag, op basis van de ECM-eigenschappen en instructies van de fabrikant van het substraat.
Er zijn verschillende beperkingen aan de huidige methode die moeten worden overwogen. Ten eerste waren de cellen die in dit protocol werden gebruikt afkomstig van een commerciële hiPSC-CMs-provider, en die cellen vormen een syncytium van elektrisch gekoppelde cellen. Het syncytium bevat een mengsel van hiPSC-CMs van alle drie de cardiale subtypen (d.w.z. ventriculair, atriale en nodale)17. Studies kunnen baat hebben bij een subtype-exclusieve hiPSC-CM-populatie (d.w.z. 100% ventrikel of 100% atrial). Ten tweede gebruikte deze methode alleen hiPSC-CM's, terwijl niet-myocyten, waaronder cardiale fibroblasten, endotheelcellen en neuronen, de hiPSC-CM-functionaliteit kunnen verbeteren22,36. Ten derde vertonen 2D hiPSC-CMs verschillende kenmerken van relatief onrijpe cardiomyocyten, waaronder spontaan kloppen, amorfe morfologie en het ontbreken van een inotrope respons 8,37. Ten vierde, terwijl dit protocol robuust samentrekkende 2D hiPSC-CM monolagen produceert, is het waarschijnlijk dat functioneel verbeterde 3D hiPSC-CM-modellen zoals gemanipuleerde hartweefsels (ECT's) zullen resulteren in een verbeterde CCM-geïnduceerde contractiele respons onder fysiologische calciumconcentraties 8,38. Ten slotte is het hier beschreven protocol ontworpen voor een 48-well-formaat. Met optimalisatie en de opname van automatisering kan dit echter worden geschaald naar een formaat met een hoge doorvoer (bijv. 96-well of 384-well platen).
De huidige gouden standaard voor hiPSC-CM-studies is conventionele rigide 2D-kweekomstandigheden (d.w.z. weefselkweekplastic of glas). Hoewel nuttig voor elektrofysiologie3 en calciumbehandeling39 studies, resulteert de conventionele methodologie in minimale contractiele eigenschappen 5,6,7. Als gevolg hiervan zijn conventionele rigide 2D-cultuuromstandigheden niet vatbaar voor de beoordeling van CCM-contractiele effecten8. Functioneel verbeterde 3D hiPSC-CM ECT-methoden38 zijn technisch uitdagend, tijdrovend en vereisen geavanceerde apparatuur die niet in elk laboratorium direct beschikbaar is. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methodologie om robuust samentrekkende 2D hiPSC-CM monolagen te genereren in een korter tijdsbestek dan 3D ECT-methoden of langdurige, conventionele 2D-methoden 7,40,41. Bovendien zijn de hier gebruikte reagentia in de handel verkrijgbaar, waaronder het hydrogelsubstraat en de hiPSC-CMs, en beide hebben een aanzienlijke consistentie van lot-to-lot. Hoewel we verwijderbare platinadraadelektroden hebben gebruikt (interelektrodeafstand: 2,0 mm, breedte: 1,0 mm), zijn verschillende elektrodematerialen en -configuraties vatbaar voor CCM-contractiele beoordelingen in vitro 8,15,17,18,22. Evenzo zijn er meerdere geautomatiseerde software beschikbaar die de analyse van contractievideo's 7,31,32 mogelijk maakt.
De meeste niet-klinische methoden om de contractiliteit van cardiale medische hulpmiddelen te evalueren, zijn grotendeels afhankelijk van dure in vivo diermodellen (bijv. Honden of varkens) en technisch uitdagende papillaire spierstrips (bijv. Konijnen)18. Dit artikel beschreef een menselijk in vitro model om de effecten van cardiale elektrofysiologische medische apparaatsignalen op contractiliteit te evalueren. Dit instrument zou de afhankelijkheid van dierstudies kunnen verminderen en nuttig kunnen zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Naarmate de bevolking van de Verenigde Staten ouder wordt, blijft het aantal patiënten met hartfalen stijgen, samen met de directe medische kosten 1,2. Er is een kritieke behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor de behandeling van hartfalen en innovatieve niet-klinische methoden om dergelijke therapieën te testen. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn voorgesteld als een in vitro instrument om het therapeutische ontwikkelingsproces te ondersteunen en zijn gebruikt in regelgevende indieningen 3,4. Het wijdverbreide gebruik ervan is echter beperkt voor contractiliteitsstudies vanwege het gebrek aan robuuste contractiele eigenschappen wanneer ze worden geplateerd in standaard stijve 2D-kweekomstandigheden (d.w.z. conventioneel weefselkweekplastic of glas)5,6,7,8. We hebben eerder het nut aangetoond van het plateren van geïsoleerde enkele hiPSC-CMs op een flexibel hydrogelsubstraat om robuuste zichtbare contractiele eigenschappen te genereren9. We toonden aan dat geïsoleerde hiPSC-CMs vergelijkbare contractiele eigenschappen hebben als die van vers geïsoleerde volwassen konijnenventrikel cardiomyocyten. Bovendien hebben we het nut van deze methode aangetoond voor het beoordelen van de contractiele reacties op farmacologische middelen7. Bovendien hebben andere studies deze technologie toegepast op mechanistische beoordelingen voor basiswetenschap en ziektemodellering10,11,12. Hier is deze methodologie uitgebreid naar 2D hiPSC-CM monolagen, en het nut ervan bij het evalueren van fysiologisch relevante cardiale contractiliteitsmodulatie (CCM) medische apparaat elektrische signalen in vitro wordt aangetoond.
CCM is een intracardiale hartfalentherapie waarbij niet-exciterende elektrofysiologische signalen aan het myocard worden afgegeven tijdens de absolute refractaire periode van de hartcyclus13,14. Reproduceerbare methoden om CCM in menselijke hartcelmodellen te evalueren ontbreken. Eerder werk heeft verschillende hartcelmodellen gebruikt om de CCM-contractiele respons te evalueren. We toonden in vitro aan dat vers geïsoleerde konijnenventrikel cardiomyocyten reageren op CCM-stimulatie door een voorbijgaande toename van calcium en contractieamplitude15. Een andere studie in geïsoleerde ventriculaire cardiomyocyten bij honden toonde CCM-geïnduceerde versterking van de intracellulaire calciumtransiënte amplitude16. In de meeste CCM-onderzoeken zijn echter ex vivo en in vivo dierpreparaten gebruikt. Deze studies zijn moeilijk met elkaar te correleren omdat ze een verscheidenheid aan CCM-pulsparameters en soortentoepassen 17. Een studie in een geïsoleerd konijn papillair model onthulde verhoogde CCM-geïnduceerde contractiliteit8,18, en een reeks van hele hartstudies hebben CCM-geïnduceerde verbetering van de contractiele functie aangetoond19,20,21. Deze studies hebben belangrijke mechanistische inzichten opgeleverd. Er is echter een gebrek aan reproduceerbare menselijke modellen voor in vitro cardiale EP-contractiele studies, waaronder CCM. Daartoe hebben we verschillende 2D- en 3D-hiPSC-modellen ontwikkeld en CCM-geïnduceerde verbetering van contractiele eigenschappen op een parameterafhankelijke manier aangetoond. Bovendien is gebleken dat de CCM-geïnduceerde inotrope effecten gedeeltelijk worden gemedieerd door neuronale input en β-adrenerge signalering 8,17,22. Toch moet er meer bekend zijn over de mechanismen van CCM-therapie, en het gebruik van samentrekkende menselijke cardiomyocyten kan helpen bij het bereiken van dit resultaat. Als zodanig is er een aanzienlijke behoefte aan het ontwikkelen van niet-klinische hulpmiddelen voor mensen om nieuwe CCM-apparaten en -signalen te evalueren, het regelgevingsproces te versnellen, de belasting van diermodellen te verminderen en de besluitvorming van ontwikkelaars van apparaten te ondersteunen 8,17,23,24. Het is belangrijk om eenvoudige, doe-het-zelfprotocollen te ontwikkelen die naar elk laboratorium kunnen worden overgebracht en die standaardapparatuur en lage celvereisten gebruiken om de kosten te verlagen. Deze methode verduidelijkt de effecten van CCM-stimulatie op de menselijke cardiomyocytenfunctie en biedt belangrijke inzichten over CCM-veiligheid of -effectiviteit17. Hier beschrijven we de methode voor het genereren van 2D hiPSC-CM monolagen op een flexibel hydrogelsubstraat om een gestandaardiseerd niet-klinisch hulpmiddel te produceren om acute cardiale elektrofysiologische medische hulpmiddelen (d.w.z. CCM) contractiele reacties in gezondheid en ziekte te kwantificeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) worden momenteel onderzocht voor meerdere in vitro toepassingen en zijn gebruikt in regelgevende indieningen. Hier breiden we het gebruik ervan uit naar de veiligheid van cardiale medische hulpmiddelen of prestatiebeoordelingen. We ontwikkelden een nieuwe methode om contractiele eigenschappen van cardiale medische hulpmiddelen te evalueren in robuust samentrekkende 2D hiPSC-CMs monolagen verguld op een flexibel extracellulair matrix (ECM) -gebaseerd hydrogelsubstraat. Deze tool maakt het mogelijk om de effecten van cardiale elektrofysiologische apparaatsignalen op de menselijke hartfunctie (bijv. Contractiele eigenschappen) te kwantificeren met standaard laboratoriumapparatuur. De 2D hiPSC-CM monolagen werden gedurende 2-4 dagen gekweekt op een flexibel hydrogelsubstraat in een 48-well formaat.
De hiPSC-CM's werden blootgesteld aan standaard cardiale contractiliteitsmodulatie (CCM) elektrische signalen van medische apparaten en vergeleken met controle (d.w.z. alleen pacing) hiPSC-CMs. De baseline contractiele eigenschappen van de 2D hiPSC-CMs werden gekwantificeerd door video-gebaseerde detectieanalyse op basis van pixelverplaatsing. De CCM-gestimuleerde 2D hiPSC-CMs die op het flexibele hydrogelsubstraat waren geplateerd, vertoonden aanzienlijk verbeterde contractiele eigenschappen ten opzichte van de uitgangswaarde (d.w.z. vóór CCM-stimulatie), waaronder een verhoogde piekcontractieamplitude en versnelde contractie- en relaxatiekinetiek. Bovendien maakt het gebruik van het flexibele hydrogelsubstraat de multiplexing mogelijk van de op video gebaseerde hart-excitatiecontractiekoppelingsuitlezingen (d.w.z. elektrofysiologie, calciumbehandeling en contractie) in gezonde en zieke hiPSC-CMs. De nauwkeurige detectie en kwantificering van de effecten van cardiale elektrofysiologische signalen op menselijke hartcontractie is van vitaal belang voor de ontwikkeling, optimalisatie en de-risking van cardiale medische hulpmiddelen. Deze methode maakt de robuuste visualisatie en kwantificering van de contractiele eigenschappen van het cardiale syncytium mogelijk, wat waardevol zou moeten zijn voor niet-klinische cardiale medische hulpmiddelenveiligheids- of effectiviteitstests. Dit artikel beschrijft in detail de methodologie om 2D hiPSC-CM hydrogel substraat monolagen te genereren.

Beschreven in dit protocol is een eenvoudige, robuuste tool om zichtbaar samentrekkende 2D hiPSC-CM monolagen te genereren op een flexibel hydrogel substraat. De meting van de contractiele eigenschappen wordt bereikt met video-gebaseerde opname in combinatie met contractiliteitsanalysesoftware. Dit maakt de kwantificering mogelijk van de belangrijkste parameters van cardiomyocytencontractiliteit, waaronder de contractieamplitude, contractiehelling, ontspanningshelling, tijd tot piek, tijd tot baseline 90% en contractieduur 50%. Het model wordt gebruikt om de baseline contractiele eigenschappen van hiPSC-CMs te karakteriseren (figuur 4) van verschillende "gezonde" donoren en kan worden uitgebreid tot de evaluatie van cardiale elektrofysiologische signalen van medische hulpmiddelen (d.w.z. CCM). De toepassing van de standaard CCM-stimulatieparameters (figuur 1D)29,30 resulteerde in verbeterde contractiele eigenschappen in vitro (figuur 5 en tabel 1)17.
We hebben verder aangetoond dat deze methode kan worden gebruikt om de effecten van de modulatie van extracellulaire calciumconcentraties op menselijke contractiele eigenschappen met en zonder CCM-stimulatie te evalueren (figuur 6)17. De verwachte baseline calciumafhankelijkheid van contractie werd waargenomen 7,17, evenals een CCM-geïnduceerde toename van de calciumgevoeligheid op het niveau van de cardiomyocytenmonolaag. Bovendien bleek uit de farmacologische ondervraging van de β-adrenerge signaleringsroute (figuur 7) dat de CCM-geïnduceerde inotrope effecten gedeeltelijk werden gemedieerd door β-adrenerge signalering17. Bovendien kan dit hulpmiddel worden uitgebreid naar patiëntspecifieke ziektecardiomyocyten, waaronder die van gedilateerde cardiomyopathie (DCM)33,34,35 (figuur 8), om het effect van CCM in de context van ziektetoestanden te begrijpen; inderdaad, verhoogde contractiele amplitude en versnelde contractie- en relaxatiekinetiek werden waargenomen bij de CCM "dosis" die hier werd getest (figuur 8). Hoewel we een CCM-nabootsend apparaat in ons laboratorium hebben, is de hier gebruikte methodologie niet specifiek voor dat systeem en kan deze worden toegepast op andere cardiale elektrofysiologische apparaten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische samenvatting van het 2D hiPSC-CM in vitro CCM model. (A) De hiPSC-CM's zijn voorgeplateerd in monolaagformaat op gelatine (0,1%) gecoate 6-well platen. (B) Na 2 dagen in cultuur worden de hiPSC-CMs gedissocieerd en voorbereid voor plating op een flexibel hydrogelsubstraat. (C) De geïsoleerde hiPSC-CMs worden met een hoge dichtheid geplateerd op hydrogelsubstraten die zijn opgesteld in een 48-well-formaat (links) en worden getest in (0,5 mM) extracellulaire calcium Tyrode's oplossing (rechts). D) Een commerciële pulsgenerator en standaard klinische CCM-pulsparameters29,30 (rechts) worden gebruikt om de hiPSC-CMs te stimuleren; De hartfunctie wordt beoordeeld door middel van video-gebaseerde analyse (links). (E) Representatieve contractieopnamen vóór CCM (uitgangswaarde: 5 V), tijdens CCM (CCM: 10 V) en na CCM (herstel: 5 V). Deze figuur is herdrukt uit Feaster et al.17. Afkortingen: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt; CCM = cardiale contractiliteitsmodulatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Figuur 2: Schema van de flexibele hydrogelsubstraat plating en zaaien. (A) Volledig ontdooid, onverdund hydrogelsubstraat op basis van ECM wordt aangebracht op een steriele 48-putplaat (linkerpaneel), met 1 μL hydrogelsubstraat per put (rechterpaneel). (B) Het hydrogelsubstraat mag gedurende 8-10 minuten bij kamertemperatuur incuberen (rechterpaneel), gevolgd door het bekleden van de hiPSC-CMs met hoge dichtheid in een laag middelgroot volume (~ 200 μL) (linkerpaneel). (C) Na 10-15 minuten incubatie wordt medium toegevoegd aan elke put (linkerpaneel) en worden de platen verplaatst naar een standaard weefselkweekincubator (rechterpaneel). Afkortingen: ECM = extracellulaire matrix, hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt; RT = kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Figuur 3: Extracellulair matrixgebaseerd hydrogelsubstraat. (A) Representatief hydrogelsubstraat (geen cellen) in één put van een 48-puts glazen bodemplaat onmiddellijk nadat het substraat op de put is aangebracht. (B) Tijd 0 nadat de hiPSC-CMs zijn gezaaid. (C) Tijd 24 uur nadat de hiPSC-CMs zijn gezaaid. Dit paneel is herdrukt uit Feaster et al.17. De witte pijlen geven de rand van het hydrogelsubstraat aan, 4x vergroting. Schaalbalk = 1 mm. Afkorting: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Figuur 4: Karakterisering van de 2D hiPSC-CM monolayer contractiele eigenschappen. (A) Representatieve contractieregistratie van de 2D hiPSC-CMs bij 1 Hz (5 V). (B) Representatieve contractiesporen die één contractiecyclus weergeven. (C) Samenvattende staafdiagrammen. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM. n = 18. Afkorting: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Figuur 5: Acuut effect van CCM op de 2D hiPSC-CM contractiele eigenschappen. (A) Representatieve contractieregistratie voor vóór CCM (5 V), tijdens CCM (10 V) en na CCM (5 V). (B) Representatieve contractiesporen van de onmiddellijke effecten (d.w.z. laatste voor-CCM-beat, eerste CCM-beat en eerste after-CCM-beat, aangegeven met +). (C) Beknopte staafdiagrammen van de onmiddellijke effecten. Procentuele verandering, gegevens zijn gemiddeld ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Deze figuur is herdrukt uit Feaster et al.17. Afkortingen: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt; CCM = cardiale contractiliteitsmodulatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Figuur 6: Effect van extracellulaire calciummodulatie op de CCM-respons. (A) Representatieve contractiesporen van de onmiddellijke effecten voor elke groep vóór CCM (5 V), tijdens CCM (10 V) en na CCM (5 V); de hiPSC-CMs werden blootgesteld aan toenemende concentraties extracellulair calcium (Cao) van 0,25-2 mM. (B-D) Getransformeerde gegevens (sigmoïdaal) om het oog te leiden die het effect van CCM op de calciumgevoeligheid van de contractiele eigenschappen (d.w.z. de amplitude en kinetiek) aantonen (heuvelhelling = 1,0). n = 6-8 per groep. Deze figuur is herdrukt uit Feaster et al.17. Afkortingen: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt; CCM = cardiale contractiliteitsmodulatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Figuur 7: Farmacologische uitdaging. Representatieve contractiesporen voor elke groep vóór CCM (5 V), tijdens CCM (10 V) en na CCM (5V); de hiPSC-CMs werden voorbehandeld met (A) medium of (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Overzichtsstaafdiagrammen voor elke voorwaarde. Procentuele verandering, gegevens zijn gemiddeld ± SEM. n = 10 per groep. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Deze figuur is herdrukt uit Feaster et al.17. Afkortingen: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt; CCM = cardiale contractiliteitsmodulatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Figuur 8: Acuut effect van CCM op de contractiele eigenschappen van zieke 2D hiPSC-CMs. (A) Representatief contractiespoor voor DCM L35P, controle baseline (vóór, 6 V) en DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Samenvattende staafdiagrammen. Procentuele verandering, gegevens zijn gemiddeld ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Afkortingen: hiPSC-CM = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyt; CCM = cardiale contractiliteitsmodulatie; DCM = gedilateerde cardiomyopathie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende video S1: Timelapse van de hiPSC-CMs op de extracellulaire matrix-gebaseerde hydrogel. Tweedimensionale hiPSC-CMs verguld op het flexibele hydrogelsubstraat; Tijd: 0-90 uur; een put van een 48-well glazen bodemplaat; 4x vergroting. De hiPSC-CMs vormen een horizontale monolayer syncytium (d.w.z. van links naar rechts). Schaalbalk = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende video S2: hiPSC-CMs op de extracellulaire matrix-gebaseerde hydrogel. Tweedimensionale hiPSC-CMs verguld op het flexibele hydrogelsubstraat; Tijd: ~ 24 uur; een put van een 48-well glazen bodemplaat; 4x vergroting. De hiPSC-CMs vormen monolaagmorfologie en vertonen een robuuste contractie bij ~24 h post plating. Schaalbalk = 1 mm. Deze video komt uit Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Na</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tijd tot piek 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tijd tot piek 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tijd tot basislijn 50%</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Tijd tot basislijn 90%</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Contractduur 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Contractduur 50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Contractduur 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Contractiele eigenschappen. Procentuele verandering ten opzichte van vóór CCM (5 V); de gegevens zijn gemiddeld ± SEM voor alle slagen in elke groep tijdens CCM (10 V) en na CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Deze tabel is herdrukt uit Feaster et al.17.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Hier demonstreren we een niet-invasieve contractiliteitsevaluatiemethode voor cardiale medische hulpmiddelen met behulp van 2D-door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) monolagen, verguld op een flexibel substraat, gekoppeld aan videogebaseerde microscopie. Deze tool zal nuttig zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Office of Science and Engineering Laboratories bij de FDA ontwikkelt regelgevende wetenschappelijke hulpmiddelen om ontwikkelaars van medische hulpmiddelen en FDA-reviewers te helpen. Ons uiteindelijke doel is om de toegang van patiënten tot innovatieve, veilige en effectieve medische hulpmiddelen te versnellen door middel van de best beschikbare wetenschap. In dit protocol passen we geavanceerde geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie toe op de beoordeling van medische hulpmiddelen die worden gebruikt voor de behandeling van levensbedreigende hartaandoeningen.Deze eenvoudige tool maakt reproduceerbare evaluatie van cardiale elektrofysiologische apparaten in de schotel mogelijk met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Het kan ook worden gebruikt met patiëntspecifieke cellen afkomstig van donoren met verschillende hartaandoeningen. Om te beginnen, plaat de ontdooide menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten op 0,1% gelatine gecoate steriele zes-well platen ten minste twee dagen voorafgaand aan het zaaien van de cardiomyocyten op het flexibele hydrogel substraat.Kweek de menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten in standaard cardiomyocytenmedium gedurende twee tot vier dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om hen in staat te stellen te herstellen van de cryopreservatie. Ververs het gebruikte medium elke 48 uur met 100% cardiomyocytenmedium. Controleer de status van de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten vóór dissociatie door de gezondheid van de cellen te evalueren, waardoor de levensvatbaarheid en stabiele kloppen worden gewaarborgd.Was de cardiomyocyten met vier milliliter DPBS per putje zonder calciumchloride of magnesiumchloride. Voeg een milliliter dissociatiereagens op kamertemperatuur toe aan elke put en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 milliliter cardiomyocytenmedium toe aan een steriele conische buis van 15 milliliter.Dissocieer de cardiomyocyten van de zesputplaten met een pipet van 1.000 microliter en voeg de celsuspensie toe aan de conische buis. Spoel de putjes af met één milliliter vers cardiomyocytenmedium om eventuele resterende cardiomyocyten te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis. Breng vervolgens het uiteindelijke volume van de conische buis op 15 milliliter met het medium.Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 200 G en verwijder het supernatant tot de één milliliter. Resuspendeer de cellen in het cardiomyocytenmedium tot een eindvolume van vijf milliliter en tel de cardiomyocyten met een handmatige of geautomatiseerde celteller. Incubeer vervolgens de cardiomyocytencelsuspensie gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl de flexibele hydrogelsubstraten worden bereid.Maak een pipet van 20 microliter klaar op één microliter, pipetpunten, een steriele 48-well glazen bodemplaat en een stopwatchtimer in de weefselkweekkap. Meng de extracellulaire matrix of het op ECM gebaseerde hydrogelsubstraat door zachtjes op de buis te tikken en deze onmiddellijk weer op ijs te plaatsen. Start de stopwatchtimer onmiddellijk voor het bekleden van het eerste hydrogelsubstraat en markeer dit als tijd nul.Pipetteer een microliter van het hydrogelsubstraat ongeveer drie keer op en neer om de pipetpunt te koelen. Breng vervolgens ongeveer één microliter van het onverdunde hydrogelsubstraat horizontaal aan op de bodem van elke put in de 48-putplaat, waarbij de pipet in een hoek van 45 graden wordt gehouden. Plaats alle hydrogelsubstraten in dezelfde richting in elke put om het substraat te helpen identificeren bij het uitvoeren van de experimenten met een vergroting van 40x.Plaats het deksel op de 48-putsplaat en laat de hydrogelsubstraten acht tot 10 minuten bij kamertemperatuur in de weefselkweekkap incuberen voordat u de cellen toevoegt. Na de incubatie zaait u de cardiomyocyten onmiddellijk druppelsgewijs rechtstreeks op de hydrogelsubstraten met ongeveer 30.000 levensvatbare cardiomyocyten per put in een laag gemiddeld volume van ongeveer 200 microliter cardiomyocytenmedium. Laat de cardiomyocyten na het sluiten van het deksel 10 tot 15 minuten ongestoord bij kamertemperatuur in de kap incuberen, zodat de cellen zich aan het hydrogelsubstraat kunnen hechten.Voeg voorzichtig 100 microliter vers cardiomyocytenmedium toe aan elk putje. Plaats de gesloten dekselplaat op een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee tot vier dagen. Zet de microscoop en de omgevingscontrolekamer aan om in evenwicht te komen tot 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Verwijder het cardiomyocytenmedium uit de 48-putplaat en spoel elke put voorzichtig tweemaal af met 600 microliter van de cardiale contractiliteitsmodulatie of CCM-testmedium. Voeg vervolgens 300 microliter CCM-testmedium per put toe en plaats de 48-putplaat op de microscoop in de omgevingscontrolekamer. Plaats de elektroden en breng de cellen gedurende vijf minuten in evenwicht.Als u de contractievideo's wilt opnemen met behulp van videogebaseerde microscopie, opent u de video-opnamesoftware en stelt u een framesnelheid van 100 frames per seconde in. Selecteer vervolgens een interessegebied of ROI in de buurt van het midden van de hiPSC-CM monolayer. Vervolgens stimuleert het veld de cellen met een commerciële pulsgenerator om de 2D-cardiomyocyten monolagen elektrisch te versnellen.Plaats de cardiomyocyt op 1,5 maal de drempel op één hertz met baseline pulsparameters. Monofasische blokgolfpacingpulsen met een stimuluspulsduur van twee milliseconden van vijf volt. Neem de baseline pacing alleen contractie video op vóór de CCM voor een minimum van vijf slagen.Stimuleer vervolgens de cardiomyocyten monolaag met een experimenteel elektrisch signaal van 30 milliseconden vertraging, twee symmetrische bifasische pulsen van 5,14 milliseconden faseduur, met 20,56 milliseconden totale duur, 10 volt faseamplitude en nul interfase-interval. Neem de CCM-geïnduceerde contractievideo op voor minimaal vijf slagen. Schakel het CCM-signaal uit, stimuleer met een baseline pacing-puls en neem een contractievideo op van de herstelperiode na de CCM voor minimaal vijf slagen.Gebruik een standaard contractiesoftware om de contractievideo's automatisch te analyseren en de belangrijkste contractiele eigenschappen te kwantificeren, zoals contractieamplitude, contractiehelling, ontspanningshelling, tijd tot piek, tijd tot baseline 90% en contractieduur 50%De 2D menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten monolayer contractuele eigenschappen werden gekarakteriseerd en de belangrijkste parameters van cardiomyocytencontractiliteit werden gekwantificeerd. De toepassing van de standaard CCM-stimulatieparameters resulteerde in verbeterde contractiele eigenschappen in vitro. De effecten van extracellulaire calciumconcentratiemodulatie op menselijke contractiele eigenschappen met en zonder CCM-stimulatie werden geëvalueerd.De verwachte baseline calciumafhankelijkheid van contractie werd waargenomen, evenals een CCM-geïnduceerde toename van de calciumgevoeligheid op het niveau van de cardiomyocytenmonolaag. Bovendien onthulde de farmacologische ondervraging van de bèta-androgene signaleringsroute dat de CCM-geïnduceerde inotrope effecten gedeeltelijk werden gemedieerd door bèta-adrenerge signalering. Bovendien kan deze tool worden uitgebreid naar patiëntspecifieke ziektecardiomyocyten, inclusief die van gedilateerde cardiomyopathie om het effect van CCM in de context van ziektetoestanden te begrijpen.Hier richten we ons voornamelijk op het evalueren van menselijke contractiele eigenschappen. Met behulp van deze tool kan men echter ook andere uitlezingen van cardiale excitatiecontractiekoppelingen evalueren, inclusief actiepotentialen en calciumbehandeling. Dit is het eerste regelgevende wetenschappelijke instrument dat geïnduceerde pluripotente stamcellen door technologie combineert met de beoordeling van hartapparaten.Deze alternatieve methode maakt de weg vrij voor medische hulpmiddelen om in een schaal te worden beoordeeld en heeft het potentieel om de noodzaak van dier- en menselijke proefpersonen te verminderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomische Reconstructies van de Mens Cardiac veneuze systeem met contrastdetectie computertomografie van perfusie-vaste Monsters

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave Toepassing op celculturen

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...