Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
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Ce travail a été soutenu en partie par une nomination au programme de participation à la recherche du Center for Devices and Radiological Health administré par l’Oak Ridge Institute for Science and Education dans le cadre d’un accord inter-agences entre le département de l’Énergie des États-Unis et la Food and Drug Administration des États-Unis. Les auteurs remercient Richard Gray, Trent Robertson et Anna Avila pour leurs suggestions et leur assistance technique. L’étude a été financée par l’Office of Science and Engineering Laboratories de la Food and Drug Administration des États-Unis.

1. Préparation des plaques et des supports
REMARQUE : Une aliquote d’hydrogel typique à base de matrice extracellulaire (MEC) est de ~200 μL dans un tube stérile de 1,5 mL stocké à -20 °C.
<ol><li>Dans une hotte de culture tissulaire stérile, préparer une plaque stérile à 6 puits en transférant 2 mL de gélatine à 0,1 % (tableau des matériaux) dans chaque puits. Placez le couvercle sur la plaque à 6 puits et laissez la plaque revêtue incuber à 37 °C pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Un jour avant d’ensemencer les hiPSC-CMs sur le substrat d’hydrogel flexible, décongeler une partie aliquote (table des matières) au réfrigérateur sur glace.</li>
	<li>Préparer le milieu cardiomyocytaire (table des matières) en mélangeant 500 mL de RPMI 1640, 10 mL de supplément 50x B-27 et 5 mL de pénicilline-streptomycine9.</li>
</ol>2. Ensemencement de hiPSC-CM cryoconservés
<ol><li>Deux jours avant d’ensemencer les hiPSC-CMs sur le substrat d’hydrogel flexible, préplaquer les hiPSC-CMs sur des plaques stériles à 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1%. Décongeler les CM-HiPSC à l’aide d’un protocole de décongélation standard 9,25.</li>
	<li>Ensuite, plaquez 1 500 000 hiPSC-CM (Table of Materials) au total par puits conformément aux instructions du fabricant (Figure 1A)26.</li>
	<li>Culture des hiPSC-CMs dans un milieu cardiomyocytaire standard pendant 2 à 4 jours pour permettre aux hiPSC-CMs de récupérer de la cryoconservation à 37 °C et 5% de CO2. Rafraîchir le milieu usé avec un milieu 100% cardiomyocytaire toutes les 48 heures.</li>
</ol>3. Dissociation et comptage des CM-CSPh préplaqués
<ol><li>Vérifiez l’état des hiPSC-CM avant dissociation. Évaluer la santé des CM-CSPh, en assurant la viabilité et un battement stable. REMARQUE : La pureté de la population de CSPhi-CM est importante (p. ex. troponine T > à 90 % cardiaque)7. Une méthode de sélection des cardiomyocytes (par exemple, sélection métabolique ou tri) est recommandée pour réduire la perturbation du substrat hydrogel par les cellules non cardiomyocytaires25,26.</li>
	<li>Laver les hiPSC-CMs 2x avec 4 mL par puits de D-PBS sans CaCl 2 ou MgCl2 (Tableau des matériaux). Aspirer le D-PBS, ajouter 1 mL de réactif de dissociation à température ambiante dans chaque puits, puis incuber pendant 15 min à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de milieu cardiomyocytaire dans un tube conique stérile de 15 mL.</li>
	<li>Dissocier les CM-hiPSC de la plaque à 6 puits à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (Figure 1B). Ajouter la suspension cellulaire au tube conique de 15 ml26.</li>
	<li>Rincer le puits avec 1 mL de milieu cardiomyocytaire frais pour recueillir les CM-HIPSC résiduels et les ajouter au tube conique de 15 mL. Porter le volume final du tube conique à 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min (200 × g). Retirer le surnageant jusqu’à la marque de 1 mL. Resuspendre les cellules dans un milieu cardiomyocytaire jusqu’à un volume final de 5 mL.</li>
	<li>Comptez les hiPSC-CM avec un compteur de cellules manuel ou automatisé.</li>
	<li>Incuber la suspension hiPSC-CM à température ambiante pendant la préparation des substrats d’hydrogel souples (30 min maximum).</li>
</ol>4. Préparation des substrats d’hydrogel souples
<ol><li>Préparez une pipette de 20 μL réglée à 1 μL, une pointe de pipette de 20 μL (p. ex. 20 μL) et une plaque de fond en verre stérile de 48 puits. Assurez-vous qu’un chronomètre / minuterie est prêt avant de fabriquer les substrats d’hydrogel.</li>
	<li>Dans la hotte de culture tissulaire stérile, mélanger le substrat d’hydrogel à base d’ECM en tapotant doucement le tube et le remettre immédiatement sur de la glace.</li>
	<li>Ensuite, démarrez le chronomètre / minuterie immédiatement avant que le premier substrat d’hydrogel ne soit plaqué - c’est le temps zéro.</li>
	<li>Pipeter 1 μL du substrat d’hydrogel de haut en bas ~3x pour refroidir l’embout de la pipette. Appliquer ~1 μL du substrat d’hydrogel non dilué horizontalement au fond de chaque puits de la plaque de 48 puits (figure 1C, figure 2A et figure 3A), en tenant la pipette à un angle de 45°. Plaquez tous les substrats d’hydrogel dans la même orientation dans chaque puits (Figure 2 et Figure 3) pour aider à identifier le substrat lors de la réalisation des expériences à un grossissement 40x 7,9,17,27. REMARQUE : Chaque raie de ~1 μL est un substrat d’hydrogel (Figure 3). En règle générale, il faut ~5 min pour préparer 48 puits. L’utilisation d’un support de microplaques incliné horizontalement (p. ex. 30°) peut permettre une meilleure vue du fond du puits et du substrat d’hydrogel. Assurez-vous d’aller sur toute la longueur du puits (c.-à-d. de gauche à droite). Les substrats d’hydrogel courts peuvent être trop épais, réduisant ainsi la stabilité du substrat. Ne laissez pas le substrat d’hydrogel sécher dans l’embout de la pipette. Si cela se produit, passez rapidement à un nouveau conseil et continuez immédiatement. Alternativement, des pointes de pipettes réfrigérées peuvent être utilisées. Le substrat d’hydrogel à base d’ECM peut polymériser rapidement lorsqu’il n’est pas sur la glace. La préparation de plusieurs puits à la fois (p. ex., 10) est suggérée. De plus, il est recommandé de s’entraîner dans une plaque simulée de 48 puits.</li>
	<li>Placez le couvercle sur la plaque de 48 puits et laissez les substrats d’hydrogel incuber pendant 8 à 10 minutes à température ambiante dans la hotte de culture tissulaire stérile avant d’ajouter les cellules (Figure 2B). REMARQUE: Il est important de respecter les temps d’incubation suggérés. Un temps d’incubation de plus de 10 minutes conduira à des substrats d’hydrogel rigides et aucune contraction visible. Un temps d’incubation de moins de 8 min peut entraîner l’effondrement des substrats.</li>
	<li>Ensemencer immédiatement les hiPSC-CM goutte à goutte directement sur les substrats d’hydrogel, avec ~30 000 hiPSC-CM viables par puits dans un faible volume moyen de ~200 μL de milieu cardiomyocytes, à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (Figure 2B et Figure 3B). NOTE: Ce processus arrête la polymérisation du substrat hydrogel et garantit que les hiPSC-CMs sont sur le substrat 7,9,17,27.</li>
	<li>Placer le couvercle sur la plaque et laisser les hiPSC-CM incuber sans être dérangés pendant 10 à 15 minutes à température ambiante (Figure 2C) dans la hotte de culture tissulaire stérile pour permettre aux hiPSC-CM d’adhérer au substrat d’hydrogel.</li>
	<li>Ajouter doucement ~100 μL de milieu cardiomyocytaire frais à chaque puits (volume final : ~300 μL par puits). Placez le couvercle sur la plaque et transférez-le dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO 2 pendant2-4 jours. Rafraîchir le milieu à 100% toutes les 24 heures avant que les expériences de contraction ne soient effectuées. REMARQUE: Inspecter visuellement les hiPSC-CM pour la morphologie correcte; immédiatement après le placage, les CM-HIPSC doivent apparaître ronds (Figure 3B). Au jour 2 après l’ensemencement, un syncytium monocouche 2D hiPSC-CM confluent sera observé (Figure 3C) (Vidéo supplémentaire S1) avec une contraction visible robuste (Vidéo supplémentaire S2).</li>
</ol>5. Enregistrement et analyse des contractions
<ol><li>Préparer le milieu de dosage CCM, qui est la solution de Tyrode contenant les éléments suivants (en mmol/L) : CaCl2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl21, glucose 10 et HEPES 10, avec un pH ajusté à 7,4 avec NaOH, et équilibrer à 37 °C dans un bain-marie. REMARQUE : Le calcium extracellulaire sous-maximal (0,5 mM) est utilisé pour améliorer la fenêtre d’essai CCM.</li>
	<li>Allumez le microscope et la chambre de contrôle de l’environnement pour équilibrer à 37 °C et 5% de CO2.</li>
	<li>Retirer le milieu cardiomyocytaire de la plaque à 48 puits et rincer doucement chaque puits deux fois avec 600 μL de milieu d’essai CCM.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de milieu d’essai CCM par puits et placer la plaque de 48 puits sur le microscope dans la chambre de contrôle environnemental. Insérez les électrodes et équilibrez les cellules pendant 5 min.</li>
	<li>Utilisez la microscopie vidéo pour enregistrer les vidéos de contraction. Ouvrez le logiciel d’enregistrement vidéo et définissez une fréquence d’images de 100 images / s. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) près du centre de la monocouche hiPSC-CM. REMARQUE: Ne sélectionnez pas un ROI près du bord des monocouches hiPSC-CM car cela peut être instable pour les enregistrements contractiles.</li>
	<li>Ensuite, le champ stimule les cellules avec un générateur d’impulsions commercial (Table of Materials) pour rythmer électriquement les monocouches 2D hiPSC-CM. Rythmer les CM-HIPSC au seuil de 1,5x à 1 Hz avec des paramètres d’impulsion de base (par exemple, des impulsions de stimulation d’ondes carrées monophasiques avec une durée d’impulsion de stimulus de 2 ms de ~14 V/cm)17.</li>
	<li>Enregistrer la vidéo de contraction de la ligne de base, en faisant les cent pas seulement (c.-à-d. avant la CCM) (Figure 1D) pendant au moins cinq temps17,28.</li>
	<li>Ensuite, stimulez la monocouche hiPSC-CM avec un signal électrique expérimental (Figure 1D). Pour suivre ce protocole, utilisez les paramètres de stimulation CCM standard : deux impulsions biphasiques symétriques d’une durée de phase de 5,14 ms (durée totale de 20,56 ms), ~28 V/cm (amplitude de phase), intervalle interphase nul et délai de 30 ms (c.-à-d. temps entre la fin de l’impulsion de stimulation et le début de l’impulsion CCM) (Figure 1D)29,30 , et enregistrez la vidéo de contraction induite par CCM pendant au moins cinq temps.</li>
	<li>Éteignez le signal CCM, stimulez avec une impulsion de stimulation de base et enregistrez une vidéo de contraction de la période de récupération (c.-à-d. après la CCM) pendant au moins cinq temps.</li>
	<li>Utilisez un logiciel de contraction standard pour analyser automatiquement les vidéos de contraction et quantifier les principales propriétés contractiles (par exemple, l’amplitude de contraction, la pente de contraction, la pente de relaxation, le temps jusqu’au pic, le temps jusqu’à la ligne de base 90% et la durée de contraction 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Utilisez les hiPSC-CMs 2D sur le substrat d’hydrogel flexible pour les expériences contractiles du jour 2 au 14 après le placage sur le substrat.</li>
</ol>

Cet article reflète les points de vue des auteurs et ne doit pas être interprété comme représentant les points de vue ou les politiques de la Food and Drug Administration des États-Unis. La mention de produits commerciaux, de leurs sources ou de leur utilisation en relation avec le matériel rapporté ici ne doit pas être interprétée comme une approbation réelle ou implicite de ces produits par le ministère de la Santé et des Services sociaux. Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents pour ce travail.

Le protocole décrit ici décrit une méthode permettant de générer des monocouches 2D hiPSC-CM se contractant de manière robuste sur un substrat d’hydrogel à base de matrice extracellulaire flexible (ECM) avec des réactifs commerciaux 7,17. Les hiPSC-CMs ensemencés sur le substrat d’hydrogel souple restent viables et ont des propriétés contractiles améliorées7. Cette technique repose sur un équipement et des capacités de laboratoire standard7. Plusieurs étapes critiques du protocole, y compris en ce qui concerne le travail avec le substrat d’hydrogel à base d’ECM, nécessitent une attention particulière aux détails. Un problème potentiel est la présence de sérum dans le milieu. Cela peut entraîner la formation de réseaux hiPSC-CM (p. ex. réseaux endothéliaux/vasculaires) au lieu d’une feuille monocouche confluente; par conséquent, un milieu sans sérum est recommandé lors de la mise en place des monocouches hiPSC-CM d’hydrogel flexible (c.-à-d. du jour 0 au jour 4). De même, la préparation d’un trop grand nombre de substrats d’hydrogel à la fois peut entraîner des substrats médiocres ou inégaux en raison de la fatigue de l’opérateur. Bien qu’il soit important de travailler rapidement, l’intégrité de chaque substrat d’hydrogel est essentielle. De même, il faut ensemencer soigneusement les CM-HISP et changer le milieu; Cela ne devrait pas être fait avec force. Lors du changement du milieu, il doit être ajouté doucement à partir du bord supérieur du puits afin de ne pas perturber le substrat d’hydrogel ou les cellules. Comme pour les cultures 2D hiPSC-CM standard (c.-à-d. culture tissulaire conventionnelle en plastique ou en verre), le placage à faible densité entraînera une formation incomplète de monocouches. Il est important d’inspecter visuellement les hiPSC-CM pour confirmer qu’ils sont sur le substrat d’hydrogel et d’utiliser une minuterie pour assurer une synchronisation précise. De plus, la culture des monocouches 2D hiPSC-CM pendant plus de 14 jours sur le substrat d’hydrogel peut entraîner une perturbation de la monocouche, sur la base des propriétés ECM et des instructions du fabricant du substrat.
Il y a plusieurs limites à la méthode actuelle qui doivent être prises en compte. Premièrement, les cellules utilisées dans ce protocole provenaient d’un fournisseur commercial de hiPSC-CMs, et ces cellules forment un syncytium de cellules couplées électriquement. Le syncytium contient un mélange de CSPhi-CM des trois sous-types cardiaques (c.-à-d. ventral, auriculaire et nodale)17. Les études peuvent bénéficier d’une population hiPSC-CM exclusive au sous-type (c.-à-d. 100 % ventriculaire ou 100 % auriculaire). Deuxièmement, cette méthode n’utilisait que des hiPSC-CM, tandis que les non-myocytes, y compris les fibroblastes cardiaques, les cellules endothéliales et les neurones, peuvent améliorer la fonctionnalité hiPSC-CM22,36. Troisièmement, les hiPSC-CM 2D présentent plusieurs caractéristiques de cardiomyocytes relativement immatures, notamment des battements spontanés, une morphologie amorphe et l’absence de réponse inotrope 8,37. Quatrièmement, bien que ce protocole produise des monocouches hiPSC-CM 2D à contraction robuste, il est probable que les modèles 3D hiPSC-CM fonctionnellement améliorés tels que les tissus cardiaques modifiés (ECT) entraîneront une réponse contractile accrue induite par CCM sous des concentrations physiologiquesde calcium 8,38. Enfin, le protocole décrit ici est conçu pour un format de 48 puits. Cependant, avec l’optimisation et l’inclusion de l’automatisation, cela peut être mis à l’échelle à un format à haut débit (par exemple, des plaques à 96 puits ou 384 puits).
L’étalon-or actuel pour les études hiPSC-CM est les conditions de culture 2D rigides conventionnelles (c.-à-d. culture tissulaire plastique ou verre). Bien qu’utile pour l’électrophysiologie3 et la manipulation du calcium39 études, la méthodologie conventionnelle donne des propriétés contractiles minimales 5,6,7. Par conséquent, les conditions de culture 2D rigides conventionnelles ne se prêtent pas à l’évaluation des effets contractiles de la CCM8. Les méthodes 3D HIPSC-CM ECT38 fonctionnellement améliorées sont techniquement difficiles, prennent beaucoup de temps et nécessitent un équipement sophistiqué qui n’est pas facilement disponible dans tous les laboratoires. Dans ce protocole, nous décrivons une méthodologie simple pour générer des monocouches 2D hiPSC-CM à contraction robuste dans un délai plus court que les méthodes ECT 3D ou les méthodes 2D conventionnellesà long terme 7,40,41. De plus, les réactifs utilisés ici sont disponibles dans le commerce, y compris le substrat d’hydrogel et les hiPSC-CM, et les deux ont une consistance considérable d’un lot à l’autre. Bien que nous ayons utilisé des électrodes amovibles en fil de platine (distance entre électrodes : 2,0 mm, largeur : 1,0 mm), divers matériaux et configurations d’électrodes se prêtent à des évaluations contractiles CCM in vitro 8,15,17,18,22. De même, il existe plusieurs logiciels automatisés qui permettent l’analyse des vidéos de contraction 7,31,32.
La majorité des méthodes non cliniques d’évaluation de la contractilité des dispositifs médicaux cardiaques reposent en grande partie sur des modèles animaux in vivo coûteux (p. ex. chiens ou porcs) et sur des bandelettes musculaires papillaires techniquement difficiles (p. ex. lapins)18. Cet article décrivait un modèle humain in vitro pour évaluer les effets des signaux des dispositifs médicaux d’électrophysiologie cardiaque sur la contractilité. Cet outil pourrait réduire la dépendance aux études animales et être utile pour l’évaluation in vitro des propriétés contractiles des appareils d’électrophysiologie cardiaque.

À mesure que la population des États-Unis vieillit, le nombre de patients atteints d’insuffisance cardiaque continue d’augmenter, ainsi que les coûts médicaux directs 1,2. Il existe un besoin critique de développer de nouvelles thérapies pour traiter l’insuffisance cardiaque et des méthodologies non cliniques innovantes pour tester de telles thérapies. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) ont été proposés comme outil in vitro pour faciliter le processus de développement thérapeutique et ont été utilisés dans les soumissions réglementaires 3,4. Cependant, leur utilisation généralisée a été limitée pour les études de contractilité en raison de l’absence de propriétés contractiles robustes lorsqu’elles sont plaquées dans des conditions de culture 2D rigides standard (c.-à-d. plastique ou verre de culture tissulaire conventionnelle)5,6,7,8. Nous avons précédemment démontré l’utilité du placage de hiPSC-CM isolés sur un substrat d’hydrogel flexible pour générer des propriétés contractiles visiblesrobustes 9. Nous avons montré que les hiPSC-CM isolés ont des propriétés contractiles comparables à celles des cardiomyocytes ventriculaires de lapin adulte fraîchement isolé. De plus, nous avons démontré l’utilité de cette méthode pour évaluer les réponses contractiles aux agents pharmacologiques7. En outre, d’autres études ont appliqué cette technologie aux évaluations mécanistes pour la science fondamentale et la modélisation des maladies10,11,12. Ici, cette méthodologie a été étendue aux monocouches 2D hiPSC-CM, et son utilité dans l’évaluation des signaux électriques des dispositifs médicaux de modulation de contractilité cardiaque (CCM) physiologiquement pertinents in vitro est démontrée.
La CCM est une thérapie intracardiaque d’insuffisance cardiaque dans laquelle des signaux électrophysiologiques non excitateurs sont délivrés au myocarde pendant la période réfractaire absolue du cycle cardiaque13,14. Il n’existe pas de méthodes reproductibles pour évaluer la CCM dans des modèles de cellules cardiaques humaines. Des travaux antérieurs ont utilisé divers modèles de cellules cardiaques pour évaluer la réponse contractile de la CCM. Nous avons démontré in vitro que les cardiomyocytes ventriculaires de lapin fraîchement isolés répondent à la stimulation CCM par une augmentation transitoire du calcium et de l’amplitude de contraction15. Une autre étude sur des cardiomyocytes ventriculaires canins isolés a démontré une augmentation induite par CCM de l’amplitude transitoire intracellulairedu calcium 16. Cependant, la majorité des études de CCM ont utilisé des préparations animales ex vivo et in vivo. Ces études sont difficiles à corréler entre elles parce qu’elles appliquent une variété de paramètres d’impulsion CCM et d’espèces17. Une étude portant sur un modèle papillaire isolé de lapin a révélé une augmentation de la contractilité induite par la CCM8,18, et un éventail d’études sur le cœur entier ont démontré une amélioration de la fonction contractile induite par la CCM19,20,21. Ces études ont fourni d’importantes informations mécanistes. Cependant, il y a un manque de modèles humains reproductibles pour les études contractiles cardiaques in vitro sur la PE, y compris la CCM. À cette fin, nous avons développé plusieurs modèles hiPSC 2D et 3D et démontré l’amélioration des propriétés contractiles induite par CCM d’une manière dépendante des paramètres. De plus, les effets inotropes induits par la CCM se sont avérés être en partie médiés par l’entrée neuronale et la signalisation β-adrénergique 8,17,22. Néanmoins, il faut en savoir plus sur les mécanismes de la thérapie CCM, et l’utilisation de cardiomyocytes humains contractants peut aider à atteindre ce résultat. À ce titre, il existe un besoin important de développer des outils humains non cliniques pour évaluer les nouveaux dispositifs et signaux de CCM, accélérer le processus réglementaire, réduire le fardeau sur les modèles animaux et aider les développeurs de dispositifs à prendre des décisions 8,17,23,24. Il est important de développer des protocoles faciles à faire soi-même qui peuvent être transférés à n’importe quel laboratoire et qui utilisent un équipement standard et de faibles exigences en matière de cellules pour réduire les coûts. Cette méthode élucide les effets de la stimulation CCM sur la fonction cardiomyocytaire humaine et fournit des informations importantes sur l’innocuité ou l’efficacité de la CCM17. Ici, nous décrivons la méthode de génération de monocouches 2D hiPSC-CM sur un substrat d’hydrogel flexible afin de produire un outil non clinique normalisé pour quantifier les réponses contractiles des dispositifs médicaux d’électrophysiologie cardiaque aiguë (c.-à-d. CCM) dans la santé et la maladie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) sont actuellement à l’étude pour de multiples applications in vitro et ont été utilisés dans des soumissions réglementaires. Ici, nous étendons leur utilisation aux évaluations de la sécurité ou des performances des dispositifs médicaux cardiaques. Nous avons développé une nouvelle méthode pour évaluer les propriétés contractiles des dispositifs médicaux cardiaques dans la contraction robuste des monocouches 2D hiPSC-CMs plaquées sur un substrat d’hydrogel flexible à base de matrice extracellulaire (ECM). Cet outil permet de quantifier les effets des signaux des appareils d’électrophysiologie cardiaque sur la fonction cardiaque humaine (p. ex., propriétés contractiles) avec un équipement de laboratoire standard. Les monocouches 2D hiPSC-CM ont été cultivées pendant 2 à 4 jours sur un substrat d’hydrogel flexible dans un format de 48 puits.
Les hiPSC-CM ont été exposés à des signaux électriques standard de modulation de contractilité cardiaque (CCM) et comparés à des hiPSC-CM de contrôle (c.-à-d. stimulation seulement). Les propriétés contractiles de base des hiPSC-CM 2D ont été quantifiées par une analyse de détection vidéo basée sur le déplacement des pixels. Les CM 2D hiPSC-CM stimulés par CCM plaqués sur le substrat d’hydrogel flexible présentaient des propriétés contractiles significativement améliorées par rapport à la ligne de base (c.-à-d. avant la stimulation CCM), y compris une amplitude de contraction maximale accrue et une cinétique de contraction et de relaxation accélérée. De plus, l’utilisation du substrat d’hydrogel flexible permet le multiplexage des lectures de couplage de contraction d’excitation cardiaque basées sur la vidéo (c.-à-d. électrophysiologie, manipulation du calcium et contraction) dans des CM-HiPSC sains et malades. La détection et la quantification précises des effets des signaux électrophysiologiques cardiaques sur la contraction cardiaque humaine sont essentielles au développement, à l’optimisation et à la réduction des risques des dispositifs médicaux cardiaques. Cette méthode permet la visualisation et la quantification robustes des propriétés contractiles du syncytium cardiaque, ce qui devrait être utile pour les tests d’innocuité ou d’efficacité des dispositifs médicaux cardiaques non cliniques. Cet article décrit, en détail, la méthodologie pour générer des monocouches de substrat d’hydrogel hiPSC-CM 2D.

Ce protocole décrit est un outil simple et robuste pour générer des monocouches hiPSC-CM 2D en contraction visible sur un substrat d’hydrogel flexible. La mesure des propriétés contractiles est réalisée avec un enregistrement vidéo couplé à un logiciel d’analyse de contractilité. Cela permet de quantifier les paramètres clés de la contractilité des cardiomyocytes, y compris l’amplitude de contraction, la pente de contraction, la pente de relaxation, le temps jusqu’au pic, le temps jusqu’à la ligne de base 90% et la durée de contraction 50%. Le modèle est utilisé pour caractériser les propriétés contractiles de base des CM-CSPhi (figure 4) provenant de divers donneurs « sains » et peut être étendu à l’évaluation des signaux des dispositifs médicaux d’électrophysiologie cardiaque (c.-à-d. CCM). L’application des paramètres standard de stimulation CCM (Figure 1D)29,30 a permis d’améliorer les propriétés contractiles in vitro (Figure 5 et Tableau 1)17.
Nous avons en outre démontré que cette méthode peut être utilisée pour évaluer les effets de la modulation des concentrations extracellulaires de calcium sur les propriétés contractiles humaines avec et sans stimulation CCM (Figure 6)17. La dépendance au calcium attendue de base de la contraction a été observée 7,17, ainsi qu’une augmentation de la sensibilité au calcium induite par CCM au niveau de la monocouche cardiomyocytes. De plus, l’interrogation pharmacologique de la voie de signalisation β-adrénergique (Figure 7) a révélé que les effets inotropes induits par la CCM étaient en partie médiés par la signalisation β-adrénergique17. De plus, cet outil peut être étendu aux cardiomyocytes pathologiques spécifiques au patient, y compris ceux de la cardiomyopathie dilatée (DCM)33,34,35 (Figure 8), afin de comprendre l’effet de la CCM dans le contexte des états pathologiques ; en effet, une amplitude contractile accrue et une cinétique de contraction et de relaxation accélérée ont été observées à la « dose » CCM testée ici (figure 8). Bien que nous ayons un dispositif imitant la CCM dans notre laboratoire, la méthodologie utilisée ici n’est pas spécifique à ce système et pourrait être appliquée à d’autres appareils d’électrophysiologie cardiaque.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Figure 1 : Résumé schématique du modèle 2D hiPSC-CM in vitro de CCM. (A) Les CM-hiPSC sont préplaqués en monocouche sur des plaques à 6 puits revêtues de gélatine (0,1 %). (B) Après 2 jours en culture, les hiPSC-CMs sont dissociés et préparés pour le placage sur un substrat d’hydrogel souple. (C) Les hiPSC-CM isolés sont plaqués à haute densité sur des substrats d’hydrogel disposés dans un format de 48 puits (à gauche) et sont dosés dans (0,5 mM) de solution de Tyrode de calcium extracellulaire (à droite). (D) Un générateur d’impulsions commercial et des paramètres d’impulsion CCM cliniques standard29,30 (à droite) sont utilisés pour stimuler les CM-HIPSC; La fonction cardiaque est évaluée par analyse vidéo (à gauche). E) Enregistrements représentatifs de la contraction avant la CCM (ligne de base: 5 V), pendant la CCM (CCM: 10 V) et après la CCM (récupération: 5 V). Cette figure a été réimprimée à partir de Feaster et al.17. Abréviations : hiPSC-CM = cardiomyocyte dérivé de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; CCM = modulation de la contractilité cardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma du collage et de l’ensemencement du substrat d’hydrogel flexible. (A) Un substrat d’hydrogel à base d’ECM complètement décongelé et non dilué est appliqué sur une plaque stérile de 48 puits (panneau de gauche), avec 1 μL de substrat d’hydrogel par puits (panneau de droite). (B) Le substrat d’hydrogel est laissé incuber à température ambiante pendant 8-10 min (panneau de droite), suivi du placage des hiPSC-CM haute densité dans un faible volume moyen (~ 200 μL) (panneau de gauche). (C) Après 10-15 minutes d’incubation, du milieu est ajouté à chaque puits (panneau de gauche) et les plaques sont déplacées vers un incubateur de culture tissulaire standard (panneau de droite). Abréviations : ECM = matrice extracellulaire, hiPSC-CM = cardiomyocyte dérivé de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; RT = température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Figure 3 : Substrat d’hydrogel à base de matrice extracellulaire. (A) Substrat d’hydrogel représentatif (pas de cellules) dans un puits d’une plaque de fond en verre de 48 puits immédiatement après l’application du substrat sur le puits. (B) Temps 0 après l’ensemencement des CM-HIPSC. (C) Temps de 24 h après l’ensemencement des CM-HIPSC. Ce panneau a été réimprimé à partir de Feaster et al.17. Les flèches blanches indiquent le bord du substrat d’hydrogel, grossissement 4x. Barre d’échelle = 1 mm. Abréviation : hiPSC-CM = cardiomyocyte induit par des cellules souches pluripotentes induites par l’homme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Figure 4 : Caractérisation des propriétés contractiles de la monocouche 2D hiPSC-CM. (A) Enregistrement représentatif de la contraction des hiPSC-CM 2D rythmés à 1 Hz (5 V). (B) Des traces de contraction représentatives représentant un cycle de contraction. (C) Graphiques à barres récapitulatifs. Les données sont moyennes ± SEM. n = 18. Abréviation : hiPSC-CM = cardiomyocyte induit par des cellules souches pluripotentes induites par l’homme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Figure 5 : Effet aigu de la CCM sur les propriétés contractiles 2D hiPSC-CM. (A) Enregistrement représentatif de la contraction avant CCM (5 V), pendant CCM (10 V) et après CCM (5 V). (B) Traces de contraction représentatives des effets immédiats (c’est-à-dire dernier avant le battement CCM, premier battement CCM et premier battement après CCM, indiqué par +). (C) Graphiques à barres récapitulatifs des effets immédiats. Variation en pourcentage, les données sont moyennes ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Cette figure a été réimprimée à partir de Feaster et al.17. Abréviations : hiPSC-CM = cardiomyocyte dérivé de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; CCM = modulation de la contractilité cardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Figure 6 : Effet de la modulation extracellulaire du calcium sur la réponse de la CCM. (A) Des traces de contraction représentatives des effets immédiats pour chaque groupe avant la CCM (5 V), pendant la CCM (10 V) et après la CCM (5 V); les HCPhi-CM ont été exposés à des concentrations croissantes de calcium extracellulaire (Cao) de 0,25 à 2 mM. (B-D) Données transformées (sigmoïdes) pour guider l’œil démontrant l’effet de la CCM sur la sensibilité au calcium des propriétés contractiles (c.-à-d. l’amplitude et la cinétique) (pente de la colline = 1,0). n = 6-8 par groupe. Cette figure a été réimprimée à partir de Feaster et al.17. Abréviations : hiPSC-CM = cardiomyocyte dérivé de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; CCM = modulation de la contractilité cardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Figure 7 : Défi pharmacologique. Des traces de contraction représentatives pour chaque groupe avant CCM (5 V), pendant CCM (10 V) et après CCM (5V); les hiPSC-CM ont été prétraités avec (A) véhicule ou (B) métoprolol (2 μM). (C, D) Graphiques à barres récapitulatifs pour chaque condition. Variation en pourcentage, les données sont moyennes ± SEM. n = 10 par groupe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Cette figure a été réimprimée à partir de Feaster et al.17. Abréviations : hiPSC-CM = cardiomyocyte dérivé de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; CCM = modulation de la contractilité cardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Figure 8 : Effet aigu de la CCM sur les propriétés contractiles des hiPSC-CM 2D malades. (A) Trace de contraction représentative pour DCM L35P, ligne de base de contrôle (avant, 6 V) et DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Graphiques à barres récapitulatifs. Variation en pourcentage, les données sont moyennes ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abréviations : hiPSC-CM = cardiomyocyte dérivé de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; CCM = modulation de la contractilité cardiaque; DCM = cardiomyopathie dilatée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Vidéo supplémentaire S1: Timelapse des hiPSC-CMs sur l’hydrogel à base de matrice extracellulaire. HiPSC-CMs bidimensionnels plaqués sur le substrat d’hydrogel flexible; Durée: 0-90 h; un puits d’une plaque de fond en verre de 48 puits; Grossissement 4x. Les hiPSC-CM forment un syncytium monocouche horizontal (c.-à-d. de gauche à droite). Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo supplémentaire S2: hiPSC-CMs sur l’hydrogel à base de matrice extracellulaire. HiPSC-CMs bidimensionnels plaqués sur le substrat d’hydrogel flexible; Durée: ~24 h; un puits d’une plaque de fond en verre de 48 puits; Grossissement 4x. Les hiPSC-CM forment une morphologie monocouche et montrent une contraction robuste à ~24 h après le placage. Barre d’échelle = 1 mm. Cette vidéo est tirée de Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Paramètre</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Après</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Temps pour atteindre un pic de 50 %</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Temps pour atteindre un pic de 90 %</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Délai jusqu’au niveau de référence 50 %</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Délai jusqu’à la base de référence 90 %</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Durée de contraction 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Durée de contraction 50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Durée de contraction 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Propriétés contractiles. Variation en pourcentage par rapport à avant CCM (5 V); les données sont ± MEB moyennes pour tous les battements de chaque groupe pendant la CCM (10 V) et après la CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Ce tableau a été réimprimé à partir de Feaster et al.17.

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Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Ici, nous démontrons une méthode non invasive d’évaluation de la contractilité des dispositifs médicaux cardiaques utilisant des monocouches 2D de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM), plaquées sur un substrat flexible, couplées à une microscopie vidéo. Cet outil sera utile pour l’évaluation in vitro des propriétés contractiles des appareils d’électrophysiologie cardiaque.

Évaluation de la thérapie de modulation de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes 2D dérivés de cellules souches humaines

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

L’Office of Science and Engineering Laboratories de la FDA développe des outils scientifiques réglementaires pour aider les développeurs de dispositifs médicaux et les examinateurs de la FDA. Notre objectif ultime est d’accélérer l’accès des patients à des dispositifs médicaux innovants, sûrs et efficaces grâce aux meilleures données scientifiques disponibles. Dans ce protocole, nous appliquons une technologie de pointe des cellules souches pluripotentes induites à l’évaluation des dispositifs médicaux utilisés pour traiter des maladies cardiaques potentiellement mortelles.Cet outil simple permet une évaluation reproductible des appareils d’électrophysiologie cardiaque dans la boîte à l’aide d’un équipement de laboratoire standard. Il peut également être utilisé avec des cellules spécifiques au patient dérivées de donneurs atteints de diverses maladies cardiaques. Pour commencer, plaquez les cardiomyocytes humains décongelés dérivés de l’iPSC sur des plaques stériles à six puits recouvertes de gélatine à 0,1% au moins deux jours avant l’ensemencement des cardiomyocytes sur le substrat d’hydrogel flexible.Culture des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC dans un milieu cardiomyocytaire standard pendant deux à quatre jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour leur permettre de récupérer de la cryoconservation. Rafraîchir le milieu usé avec un milieu 100% cardiomyocytaire toutes les 48 heures. Vérifier l’état des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC avant la dissociation en évaluant la santé des cellules, en assurant la viabilité et un battement stable.Lavez les cardiomyocytes avec quatre millilitres par puits de DPBS sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium. Ajouter un millilitre de réactif de dissociation à température ambiante à chaque puits et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu cardiomyocytaire dans un tube conique stérile de 15 millilitres.Dissocier les cardiomyocytes des plaques à six puits avec une pipette de 1 000 microlitres et ajouter la suspension cellulaire au tube conique. Rincez les puits avec un millilitre de milieu cardiomyocytaire frais pour recueillir les cardiomyocytes résiduels et les ajouter au tube conique. Amenez ensuite le volume final du tube conique à 15 millilitres avec le milieu.Centrifuger le tube à 200 G pendant cinq minutes et retirer le surnageant jusqu’à la marque d’un millilitre. Remettez en suspension les cellules dans le milieu cardiomyocytaire jusqu’à un volume final de cinq millilitres et comptez les cardiomyocytes avec un compteur de cellules manuel ou automatisé. Ensuite, incuber la suspension cellulaire cardiomyocytaire pendant environ 30 minutes à température ambiante pendant que les substrats d’hydrogel flexibles sont préparés.Préparez une pipette de 20 microlitres réglée à un microlitre, des pointes de pipettes, une plaque inférieure en verre stérile de 48 puits et une minuterie de chronomètre dans la hotte de culture tissulaire. Mélangez la matrice extracellulaire ou le substrat d’hydrogel à base d’ECM en tapotant doucement le tube et en le replaçant immédiatement sur la glace. Démarrez la minuterie du chronomètre immédiatement avant de plaquer le premier substrat d’hydrogel et marquez-la comme temps zéro.Pipeter un microlitre du substrat d’hydrogel de haut en bas environ trois fois pour refroidir l’extrémité de la pipette. Appliquez ensuite environ un microlitre du substrat d’hydrogel non dilué horizontalement au fond de chaque puits dans la plaque de 48 puits, en tenant la pipette à un angle de 45 degrés. Plaquez tous les substrats d’hydrogel dans la même orientation dans chaque puits pour aider à identifier le substrat lors de l’exécution des expériences à un grossissement de 40X.Placez le couvercle sur la plaque de 48 puits et laissez les substrats d’hydrogel incuber pendant huit à 10 minutes à température ambiante dans la hotte de culture tissulaire avant d’ajouter les cellules. Après l’incubation, ensemencer immédiatement les cardiomyocytes goutte à goutte directement sur les substrats d’hydrogel avec environ 30 000 cardiomyocytes viables par puits dans un faible volume moyen d’environ 200 microlitres de milieu cardiomyocytes. Après avoir fermé le couvercle, laissez les cardiomyocytes incuber sans être dérangés pendant 10 à 15 minutes à température ambiante dans la hotte pour permettre aux cellules d’adhérer au substrat d’hydrogel.Ajouter doucement 100 microlitres de milieu cardiomyocytaire frais à chaque puits. Placez la plaque fermée du couvercle sur un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à quatre jours. Allumez le microscope et la chambre de contrôle de l’environnement pour équilibrer à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Retirer le milieu cardiomyocytaire de la plaque à 48 puits et rincer doucement chaque puits deux fois avec 600 microlitres de milieu de dosage de la contractilité cardiaque ou CCM. Ajoutez ensuite 300 microlitres de milieu d’essai CCM par puits et placez la plaque de 48 puits au microscope dans la chambre de contrôle de l’environnement. Insérez les électrodes et équilibrez les cellules pendant cinq minutes.Pour enregistrer les vidéos de contraction à l’aide de la microscopie vidéo, ouvrez le logiciel d’enregistrement vidéo et définissez une fréquence d’images de 100 images par seconde. Sélectionnez ensuite une région d’intérêt ou un retour sur investissement près du centre de la monocouche hiPSC-CM. Ensuite, le champ stimule les cellules avec un générateur d’impulsions commercial pour rythmer électriquement les monocouches de cardiomyocytes 2D.Placez le cardiomyocyte à 1,5 fois le seuil à un hertz avec des paramètres de pouls de base. Par exemple, des impulsions de stimulation monophasiques à ondes carrées avec une durée d’impulsion de stimulus de deux millisecondes de cinq volts. Enregistrez la vidéo de contraction de la ligne de base avant le CCM pendant au moins cinq temps.Stimulez ensuite la monocouche de cardiomyocytes avec un signal électrique expérimental de retard de 30 millisecondes, deux impulsions biphasiques symétriques d’une durée de phase de 5,14 millisecondes, avec une durée totale de 20,56 millisecondes, une amplitude de phase de 10 volts et un intervalle d’interphase nul. Enregistrez la vidéo de contraction induite par CCM pendant au moins cinq temps. Éteignez le signal CCM, stimulez avec une impulsion de stimulation de base et enregistrez une vidéo de contraction de la période de récupération après le CCM pendant au moins cinq temps.Utilisez un logiciel de contraction standard pour analyser automatiquement les vidéos de contraction et quantifier les propriétés contractiles clés telles que l’amplitude de contraction, la pente de contraction, la pente de relaxation, le temps jusqu’au pic, le temps jusqu’à la ligne de base 90% et la durée de contraction 50%Les propriétés contractuelles monocouches des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC humain 2D ont été caractérisées et les paramètres clés de la contractilité des cardiomyocytes ont été quantifiés. L’application des paramètres de stimulation standard de la CCM a permis d’améliorer les propriétés contractiles in vitro. Les effets de la modulation extracellulaire des concentrations de calcium sur les propriétés contractiles humaines avec et sans stimulation CCM ont été évalués.La dépendance au calcium attendue à l’inclusion de la contraction a été observée, ainsi qu’une augmentation de la sensibilité au calcium induite par CCM au niveau de la monocouche cardiomyocytes. En outre, l’interrogation pharmacologique de la voie de signalisation bêta androgénique a révélé que les effets inotropes induits par la CCM étaient en partie médiés par la signalisation bêta-adrénergique. De plus, cet outil peut être étendu aux cardiomyocytes pathologiques spécifiques au patient, y compris ceux de la cardiomyopathie dilatée afin de comprendre l’effet de la CCM dans le contexte des états pathologiques.Ici, nous nous concentrons principalement sur l’évaluation des propriétés contractiles humaines. Cependant, en utilisant cet outil, on pourrait également évaluer d’autres lectures de couplage de contraction d’excitation cardiaque, y compris les potentiels d’action et la manipulation du calcium. Il s’agit du premier outil scientifique réglementaire à combiner les cellules souches pluripotentes induites par la technologie avec l’évaluation des dispositifs cardiaques.Cette méthode alternative ouvre la voie à l’évaluation des dispositifs médicaux dans une boîte et a le potentiel de réduire le besoin de tests sur des sujets animaux et humains.

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