Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מינוי לתוכנית השתתפות במחקר במרכז למכשירים ובריאות רדיולוגית המנוהלת על ידי מכון אוק רידג' למדע וחינוך באמצעות הסכם בין-סוכנותי בין משרד האנרגיה של ארצות הברית לבין מנהל המזון והתרופות האמריקאי. המחברים מודים לריצ'רד גריי, טרנט רוברטסון ואנה אווילה על הצעותיהם ועזרתם הטכנית. המחקר מומן באמצעות מנהל המזון והתרופות האמריקאי, משרד המדע וההנדסה מעבדות.

1. הכנת הצלחות והמדיה
הערה: אליציטוט הידרוג'ל טיפוסי מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM) הוא ~ 200 μL בצינור סטרילי של 1.5 מ"ל המאוחסן ב -20 ° C.
<ol><li>בתרבית רקמה סטרילית מכינים צלחת סטרילית בעלת 6 בארות על ידי העברת 2 מ"ל של 0.1% ג'לטין (טבלת חומרים) לכל באר. מניחים את המכסה על צלחת 6 בארות, ומאפשרים לצלחת המצופה לדגור ב 37 ° C למשך מינימום של 1 שעות.</li>
	<li>יום אחד לפני זריעת hiPSC-CMs על מצע הידרוג'ל גמיש, להפשיר aliquot הידרוג'ל (טבלה של חומרים) במקרר על קרח.</li>
	<li>הכן את המדיום cardiomyocyte (טבלה של חומרים) על ידי ערבוב 500 מ"ל של RPMI 1640, 10 מ"ל של 50x B-27 מוסף, ו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין9.</li>
</ol>2. זריעה של hiPSC-CMs שמורים בהקפאה
<ol><li>יומיים לפני זריעת hiPSC-CMs על מצע ההידרוג'ל הגמיש, יש לצלחת מראש את hiPSC-CMs על צלחות סטריליות 6 בארות מצופות ג'לטין 0.1%. הפשירו את hiPSC-CMs באמצעות פרוטוקול הפשרה סטנדרטי 9,25.</li>
	<li>לאחר מכן, צלחת 1,500,000 hiPSC-CMs (טבלת חומרים) לכל באר בהתאם להוראות היצרן (איור 1A)26.</li>
	<li>תרבית את hiPSC-CMs בתווך קרדיומיוציטים סטנדרטי במשך 2-4 ימים כדי לאפשר hiPSC-CMs להתאושש מההקפאה ב 37 ° C ו 5% CO2. רענן את המדיום בילה עם 100% cardiomyocyte בינוני כל 48 שעות.</li>
</ol>3. דיסוציאציה וספירה של hiPSC-CMs מצופים מראש
<ol><li>בדוק את המצב של hiPSC-CMs לפני דיסוציאציה. להעריך את הבריאות של hiPSC-CMs, הבטחת כדאיות פעימות יציבות. הערה: טוהר אוכלוסיית hiPSC-CM חשוב (למשל, >90% טרופונין T לבבי)7. שיטת בחירת קרדיומיוציטים (למשל, בחירה מטבולית או מיון) מומלצת כדי להפחית את ההפרעה של מצע הידרוג'ל על ידי תאים שאינם קרדיומיוציטים25,26.</li>
	<li>שטפו את hiPSC-CMs 2x עם 4 מ"ל לכל באר של D-PBS ללא CaCl 2 או MgCl2 (טבלת חומרים). לשאוף את D-PBS, להוסיף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה בטמפרטורת החדר לכל באר, ולאחר מכן לדגור במשך 15 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של מדיום קרדיומיוציטים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.</li>
	<li>נתקו את hiPSC-CMs מהלוח בעל 6 הקידוחים בעזרת פיפטה של 1,000 μL (איור 1B). הוסף את תרחיף התא לצינור החרוטי 15 מ"ל26.</li>
	<li>לשטוף את הבאר עם 1 מ"ל של מדיום cardiomyocyte טרי כדי לאסוף כל hiPSC-CMs שיורית, ולהוסיף אותם צינור חרוטי 15 מ"ל. הביאו את הנפח הסופי של הצינור החרוטי ל -15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 5 דקות (200 × גרם). הסר את supernatant עד סימן 1 מ"ל. להשעות מחדש את התאים במדיום קרדיומיוציטים לנפח סופי של 5 מ"ל.</li>
	<li>ספור את hiPSC-CMs עם מונה תאים ידני או אוטומטי.</li>
	<li>יש לדגור על מתלה hiPSC-CM בטמפרטורת החדר בזמן הכנת מצעי ההידרוג'ל הגמישים (30 דקות לכל היותר).</li>
</ol>4. הכנת מצעי ההידרוג'ל הגמישים
<ol><li>הכינו פיפטה של 20 μL בטמפרטורה של 1 μL, קצוות פיפטה של 20 μL (למשל, 20 μL), וצלחת תחתונה סטרילית מזכוכית עם 48 בארות. ודא כי סטופר / טיימר מוכן לפני ביצוע מצעי הידרוג'ל.</li>
	<li>במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית, ערבבו את מצע ההידרוג'ל מבוסס ECM על ידי הקשה עדינה על הצינור, ומיד הניחו אותו בחזרה על קרח.</li>
	<li>לאחר מכן, הפעל את שעון העצר / טיימר מיד לפני שמצע ההידרוג'ל הראשון מצופה - זהו זמן אפס.</li>
	<li>פיפטה 1 μL של מצע הידרוג'ל למעלה ולמטה ~ 3x כדי לקרר את קצה פיפטה. מרחו ~1 μL של מצע ההידרוג'ל הלא מדולל אופקית על תחתית כל באר של צלחת 48 הקידוחים (איור 1C, איור 2A ואיור 3A), והחזיקו את הפיפטה בזווית של 45°. לוחמו את כל מצעי ההידרוג'ל באותו כיוון בכל באר (איור 2 ואיור 3) כדי לסייע בזיהוי המצע בעת ביצוע הניסויים בהגדלה של פי40 7,9,17,27. הערה: כל קו ~1 μL הוא מצע הידרוג'ל אחד (איור 3). בדרך כלל, לוקח ~ 5 דקות להכין 48 בארות. השימוש במעמד מיקרו-פלטה מוטה אופקית (למשל, 30°) עשוי לאפשר תצוגה טובה יותר של תחתית הבאר ומצע ההידרוג'ל. הקפד ללכת לכל אורך הבאר (כלומר, משמאל לימין). מצעי הידרוג'ל קצרים עלולים להיות עבים מדי, ובכך להפחית את יציבות המצע. אין לאפשר למצע ההידרוג'ל להתייבש בקצה הפיפטה. במקרה כזה, עבור במהירות לעצה חדשה והמשך מיד. לחלופין, ניתן להשתמש בקצוות פיפטה צוננים. מצע הידרוג'ל מבוסס ECM עשוי להתפלמר במהירות כאשר הוא אינו על קרח. מומלץ להכין כמה בארות בכל פעם (למשל, 10). בנוסף, מומלץ להתאמן בצלחת מדומה של 48 בארות.</li>
	<li>הניחו את המכסה על צלחת 48 הקידוחים, ואפשרו למצעי ההידרוג'ל לדגור במשך 8-10 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית לפני הוספת התאים (איור 2B). הערה: חשוב להקפיד על זמני הדגירה המוצעים. זמן דגירה של יותר מ-10 דקות יוביל למצעי הידרוג'ל נוקשים וללא התכווצויות נראות לעין. זמן דגירה של פחות מ-8 דקות עלול להוביל לקריסת מצעים.</li>
	<li>זרעו מיד את hiPSC-CMs ישירות על מצעי ההידרוג'ל, עם ~30,000 hiPSC-CMs בני קיימא לכל באר בנפח בינוני נמוך של ~200 μL של תווך קרדיומיוציטים, באמצעות פיפטה של 1,000 μL (איור 2B ואיור 3B). הערה: תהליך זה עוצר את פילמור מצע ההידרוג'ל ומבטיח שה-hiPSC-CMs נמצאים על המצע 7,9,17,27.</li>
	<li>הניחו את המכסה על הצלחת, ואפשרו ל-hiPSC-CMs לדגור ללא הפרעה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2C) במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית כדי לאפשר ל-hiPSC-CMs להיצמד למצע ההידרוג'ל.</li>
	<li>הוסף בעדינות ~ 100 μL של מדיום קרדיומיוציטים טרי לכל באר (נפח סופי: ~ 300 μL לכל באר). מניחים את המכסה על הצלחת, ומעבירים לאינקובטור ב 37 ° C, 5% CO 2 במשך2-4 ימים. רענן את המדיום 100% כל 24 שעות לפני ביצוע ניסויי ההתכווצות. הערה: בדוק חזותית את hiPSC-CMs עבור המורפולוגיה הנכונה; מיד לאחר הציפוי, hiPSC-CMs אמורים להופיע עגולים (איור 3B). ביום השני לאחר הזריעה, ייצפה סינקיטיום חד-שכבתי דו-ממדי hiPSC-CM (איור 3C) (וידאו משלים S1) עם כיווץ גלוי חזק (וידאו משלים S2).</li>
</ol>5. רישום וניתוח התכווצות
<ol><li>הכינו את מדיום בדיקת CCM, שהוא הפתרון של Tyrode המכיל את הדברים הבאים (ב-mmol / L): CaCl 2 0.5, NaCl 134, KCl 5.4, MgCl2 1, גלוקוז 10 ו-HEPES 10, כאשר ה-pH מותאם ל-7.4 עם NaOH, ושיווי משקל ל-37°C באמבט מים. הערה: סידן חוץ-תאי תת-מרבי (0.5 מילימול) משמש לשיפור חלון הבדיקה של CCM.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ ואת תא הבקרה הסביבתית כדי לאזן ל 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>הסר את מדיום קרדיומיוציטים מהצלחת של 48 בארות, ושטוף בעדינות כל באר פעמיים עם 600 μL של מדיום בדיקת CCM.</li>
	<li>הוסף 300 μL של מדיום בדיקת CCM לכל באר, והניחו את צלחת 48 הבארות על המיקרוסקופ בתא הבקרה הסביבתי. הכנס את האלקטרודות, ואזן את התאים למשך 5 דקות.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ מבוסס וידאו כדי להקליט את סרטוני ההתכווצות. פתח את תוכנת הקלטת הווידאו והגדר קצב פריימים של 100 פריימים לשנייה. בחר אזור עניין (ROI) ליד מרכז השכבה החד-שכבתית hiPSC-CM. הערה: אל תבחר החזר השקעה קרוב לקצה של חד-שכבות hiPSC-CM מכיוון שהדבר עלול להיות לא יציב עבור הקלטות כיווץ.</li>
	<li>לאחר מכן, השדה מגרה את התאים באמצעות מחולל פולסים מסחרי (Table of Materials) כדי לקצב חשמלי את החד-שכבות הדו-ממדיות hiPSC-CM. קצב את hiPSC-CMs בסף של 1.5x ב- 1 הרץ עם פרמטרי פולס בסיסיים (לדוגמה, פעימות קצב גל מרובע מונופאזי עם משך פעימת גירוי של 2 אלפיות השנייה של ~ 14 V / cm)17.</li>
	<li>הקלט את קו הבסיס, קצב רק (כלומר, לפני CCM) (איור 1D) וידאו כיווץ במשך לפחות חמש פעימות17,28.</li>
	<li>לאחר מכן, עוררו את השכבה החד-שכבתית hiPSC-CM באמצעות אות חשמלי ניסיוני (איור 1D). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים של גירוי CCM: שני פולסים דו-פאזיים סימטריים של משך פאזה של 5.14 מילישניות (משך כולל של 20.56 אלפיות השנייה), ~28 וולט/ס"מ (משרעת פאזה), מרווח בין פאזות אפס והשהיה של 30 מילישניות (כלומר, זמן מסוף פולס הקצב ועד תחילת פולס CCM) (איור 1D)29,30 ולהקליט את סרטון ההתכווצות המושרה על ידי CCM במשך חמש פעימות לפחות.,</li>
	<li>כבה את אות CCM, עורר עם דופק קצב בסיסי, והקלט סרטון התכווצות של תקופת ההתאוששות (כלומר, לאחר CCM) למשך חמש פעימות לפחות.</li>
	<li>השתמש בתוכנת כיווץ סטנדרטית כדי לנתח באופן אוטומטי את סרטוני ההתכווצות ולכמת את תכונות ההתכווצות העיקריות (לדוגמה, משרעת ההתכווצות, שיפוע ההתכווצות, שיפוע הרפיה, זמן לשיא, זמן לקו הבסיס 90% ומשך ההתכווצות 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>השתמש ב- hiPSC-CMs הדו-ממדיים על מצע ההידרוג'ל הגמיש לניסויי כיווץ מימים 2-14 לאחר ציפוי על המצע.</li>
</ol>

מאמר זה משקף את דעותיהם של המחברים ואין לפרש אותו כמייצג את השקפותיו או מדיניותו של מנהל המזון והתרופות האמריקאי. אין לפרש את האזכור של מוצרים מסחריים, מקורותיהם או השימוש בהם בקשר לחומר המדווח כאן כאישור ממשי או משתמע של מוצרים אלה על ידי מחלקת הבריאות ושירותי האנוש. המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים בעבודה זו.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה ליצירת מונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות המתכווצות בחוזקה על מצע הידרוג'ל גמיש מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM) עם ריאגנטים מסחריים 7,17. hiPSC-CMs שנזרעו על מצע ההידרוג'ל הגמיש נשארים בני קיימא ויש להם תכונות כיווץ משופרות7. טכניקה זו מסתמכת על ציוד מעבדה סטנדרטי ויכולות7. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל ביחס לעבודה עם מצע הידרוג'ל מבוסס ECM, הדורשים תשומת לב קפדנית לפרטים. בעיה פוטנציאלית אחת היא נוכחות של סרום בתווך. זה עלול לגרום לרשתות hiPSC-CMs ליצור רשתות (למשל, רשתות אנדותל/כלי דם) במקום יריעה חד-שכבתית מתמזגת; לפיכך, מדיום ללא סרום מומלץ במהלך הקמת מונושכבות הידרוג'ל hiPSC-CM גמישות (כלומר, יום 0 עד יום 4). כמו כן, הכנת יותר מדי מצעי הידרוג'ל בו זמנית עלולה לגרום למצעים גרועים או לא אחידים עקב עייפות המפעיל. בעוד שחשוב לעבוד במהירות, שלמותו של כל מצע הידרוג'ל היא קריטית. באופן דומה, יש לזרוע בזהירות את hiPSC-CMs ולשנות את המדיום; אין לעשות זאת בכוח. בעת שינוי המדיום, יש להוסיף אותו בעדינות מהקצה העליון של הבאר כדי לא להפריע למצע ההידרוג'ל או לתאים. בדומה לתרביות hiPSC-CM דו-ממדיות סטנדרטיות (כלומר, תרבית רקמה קונבנציונלית פלסטיק או זכוכית), ציפוי בצפיפות נמוכה יגרום להיווצרות חד-שכבתית לא שלמה. חשוב לבדוק ויזואלית את hiPSC-CMs כדי לוודא שהם נמצאים על מצע הידרוג'ל ולהשתמש בטיימר כדי להבטיח תזמון מדויק. יתר על כן, גידול החד-שכבות הדו-ממדיות hiPSC-CM במשך יותר מ-14 יום על מצע ההידרוג'ל עלול לגרום להפרעה חד-שכבתית, בהתבסס על תכונות ה-ECM והוראות יצרן המצע.
ישנן מספר מגבלות לשיטה הנוכחית שיש לקחת בחשבון. ראשית, התאים המשמשים בפרוטוקול זה היו מספקים מסחרי hiPSC-CMs, ותאים אלה יוצרים סינציטיום של תאים מצומדים חשמלית. הסינקיטיום מכיל תערובת של hiPSC-CMs מכל שלושת תת-הסוגים של הלב (כלומר, חדרי, פרוזדורי ונודלי)17. מחקרים עשויים להפיק תועלת מאוכלוסיית hiPSC-CM בלעדית לתת-סוג (כלומר, 100% חדרית או 100% פרוזדורית). שנית, שיטה זו השתמשה רק hiPSC-CMs, בעוד שאינם מיוציטים, כולל פיברובלסטים לבביים, תאי אנדותל ונוירונים, עשויים לשפר את פונקציונליות hiPSC-CM22,36. שלישית, hiPSC-CMs דו-ממדיים מציגים מספר תכונות של קרדיומיוציטים לא בשלים יחסית, כולל פעימות ספונטניות, מורפולוגיה אמורפית והיעדר תגובה אינוטרופית 8,37. רביעית, בעוד פרוטוקול זה מייצר חד-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות המתכווצות חזק, סביר להניח כי מודלים תלת-ממדיים משופרים של hiPSC-CM כגון רקמות לב מהונדסות, כגון ECTs, יביאו לתגובת כיווץ משופרת הנגרמת על ידי CCM תחת ריכוזי סידן פיזיולוגיים 8,38. לבסוף, הפרוטוקול המתואר כאן מיועד לפורמט של 48 בארות. עם זאת, עם אופטימיזציה והכללת אוטומציה, ניתן לשנות זאת לפורמט בעל תפוקה גבוהה (למשל, לוחות 96 באר או 384 בארות).
תקן הזהב הנוכחי למחקרי hiPSC-CM הוא תנאי תרבית דו-ממדיים קשיחים קונבנציונליים (כלומר, תרבית רקמות, פלסטיק או זכוכית). בעוד שהיא שימושית עבור אלקטרופיזיולוגיה3 וטיפול בסידן39 מחקרים, המתודולוגיה הקונבנציונלית מביאה לתכונות כיווץ מינימליות 5,6,7. כתוצאה מכך, תנאי תרבית דו-ממדית קשיחים קונבנציונליים אינם ניתנים להערכה של השפעות התכווצות CCM8. שיטות 38 HiPSC-CM ECTמשופרות מבחינה פונקציונלית הן מאתגרות מבחינה טכנית, גוזלות זמן רב ודורשות ציוד מתוחכם שאינו זמין בכל מעבדה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה ליצירת מונו-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בעלות כיווץ חזק במסגרת זמן קצרה יותר מאשר שיטות ECT תלת-ממדיות או שיטות דו-ממדיות קונבנציונליות לטווח ארוך 7,40,41. יתר על כן, הריאגנטים המשמשים כאן זמינים מסחרית, כולל מצע הידרוג'ל ו- hiPSC-CMs, ולשניהם יש עקביות רבה ללוט. בעוד שהשתמשנו באלקטרודות חוט פלטינה נשלפות (מרחק אינטראלקטרודה: 2.0 מ"מ, רוחב: 1.0 מ"מ), חומרים ותצורות אלקטרודות שונות ניתנים להערכות התכווצות CCM במבחנה 8,15,17,18,22. כמו כן, קיימות מספר תוכנות אוטומטיות המאפשרות ניתוח סרטוני התכווצות 7,31,32.
רוב השיטות הלא-קליניות להערכת התכווצות מכשור רפואי לבבי מסתמכות במידה רבה על מודלים יקרים של בעלי חיים in vivo (למשל, כלבים או חזירים) ועל רצועות שריר פפילריות מאתגרות מבחינה טכנית (למשל, ארנבות)18. מאמר זה תיאר מודל אנושי במבחנה כדי להעריך את ההשפעות של אותות אלקטרופיזיולוגיה של הלב של מכשירים רפואיים על התכווצות. כלי זה יכול להפחית את התלות במחקרים בבעלי חיים ולהיות שימושי להערכה חוץ גופית של תכונות ההתכווצות של מכשירי אלקטרופיזיולוגיה של הלב.

ככל שאוכלוסיית ארצות הברית מזדקנת, מספר חולי אי ספיקת הלב ממשיך לעלות, יחד עם העלויות הרפואיות הישירות 1,2. יש צורך קריטי לפתח טיפולים חדשניים לטיפול באי ספיקת לב ומתודולוגיות לא קליניות חדשניות לבדיקת טיפולים כאלה. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) הוצעו ככלי במבחנה כדי לסייע בתהליך הפיתוח הטיפולי ושימשו בהגשות רגולטוריות 3,4. עם זאת, השימוש הנרחב בהם הוגבל למחקרי התכווצות בשל היעדר תכונות כיווץ חזקות כאשר הם מצופים בתנאי תרבית דו-ממדית קשיחים סטנדרטיים (כלומר, תרבית רקמה קונבנציונלית פלסטיק או זכוכית)5,6,7,8. הדגמנו בעבר את התועלת של ציפוי hiPSC-CMs בודדים בודדים על מצע הידרוג'ל גמיש כדי ליצור תכונות כיווץ גלויות חזקות9. הראינו כי hiPSC-CMs מבודדים הם בעלי תכונות התכווצות דומות לאלה של קרדיומיוציטים חדריים של ארנב בוגר שבודד טרי. יתר על כן, הדגמנו את התועלת של שיטה זו להערכת תגובות התכווצות לסוכנים פרמקולוגיים7. יתר על כן, מחקרים אחרים יישמו טכנולוגיה זו להערכות מכניסטיות עבור מדע בסיסי ומודלים של מחלות10,11,12. כאן, מתודולוגיה זו הורחבה לחד-שכבות דו-ממדיות hiPSC-CM, והתועלת שלה בהערכת אותות חשמליים של מכשירים רפואיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (CCM) של מכשירים רפואיים במבחנה מודגמת.
CCM הוא טיפול באי ספיקת לב תוך לבבית שבו אותות אלקטרופיזיולוגיים לא מעוררים מועברים לשריר הלב במהלך תקופת העקשנות המוחלטת של מחזור הלב13,14. שיטות ניתנות לשחזור להערכת CCM במודלים של תאי לב אנושיים חסרות. עבודות קודמות השתמשו במודלים שונים של תאי לב כדי להעריך את תגובת ההתכווצות של CCM. הדגמנו במבחנה כי קרדיומיוציטים חדריים של ארנבים שבודדו זה עתה מגיבים לגירוי CCM על ידי עלייה חולפת בסידן ומשרעת התכווצות15. מחקר נוסף בקרדיומיוציטים חדריים של כלבים מבודדים הדגים שיפור כתוצאה מ-CCM של משרעת הסידן החולפת התוך-תאית16. עם זאת, רוב מחקרי CCM השתמשו בתכשירים של בעלי חיים מסוג ex vivo ו-in vivo. קשה לקשר בין מחקרים אלה מכיוון שהם מיישמים מגוון פרמטרים של דופק CCM ומינים17. מחקר אחד במודל פפילרי ארנב מבודד גילה התכווצות מוגברת הנגרמת על ידי CCM 8,18, ומערך של מחקרי לב שלם הדגימו שיפור המושרה על ידי CCM של תפקוד התכווצות19,20,21. מחקרים אלה סיפקו תובנה מכניסטית חשובה. עם זאת, קיים מחסור במודלים אנושיים הניתנים לשחזור עבור מחקרי EP התכווצות לב חוץ גופית, כולל CCM. לשם כך, פיתחנו מספר מודלים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של hiPSC והדגמנו שיפור הנגרם על ידי CCM של תכונות כיווץ באופן תלוי פרמטרים. יתר על כן, ההשפעות האינוטרופיות המושרות על ידי CCM נמצאו מתווכות בחלקן על ידי קלט עצבי ואיתות β-אדרנרגי 8,17,22. עם זאת, יש לדעת יותר על המנגנונים של טיפול CCM, ושימוש בקרדיומיוציטים אנושיים מתכווצים יכול לסייע בהשגת תוצאה זו. לפיכך, יש צורך משמעותי לפתח כלים אנושיים לא קליניים להערכת התקנים ואותות CCM חדשניים, להאיץ את תהליך הרגולציה, להפחית את הנטל על מודלים של בעלי חיים ולסייע למפתחי מכשירים לקבל החלטות 8,17,23,24. חשוב לפתח פרוטוקולים קלים של עשה זאת בעצמך שניתן להעביר לכל מעבדה והמשתמשים בציוד סטנדרטי ובדרישות תאים נמוכות כדי להפחית את העלויות. שיטה זו מבהירה את ההשפעות של גירוי CCM על תפקוד קרדיומיוציטים אנושיים ומספקת תובנות חשובות על בטיחות או יעילות CCM17. כאן, אנו מתארים את השיטה ליצירת חד-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות על מצע הידרוג'ל גמיש כדי לייצר כלי לא קליני סטנדרטי לכימות תגובות התכווצות של אלקטרופיזיולוגיה חריפה של הלב (כלומר, CCM) בבריאות ובחולי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) נחקרים כעת עבור יישומי מבחנה מרובים ושימשו בהגשות רגולטוריות. כאן, אנו מרחיבים את השימוש בהם להערכות בטיחות או ביצועים של מכשירים רפואיים לבביים. פיתחנו שיטה חדשנית להערכת תכונות התכווצות של מכשור רפואי לבבי בחד-שכבות hiPSC-CMs דו-ממדיות המתכווצות על מצע הידרוג'ל גמיש מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM). כלי זה מאפשר לכמת את ההשפעות של אותות מכשיר אלקטרופיזיולוגיה לבבית על תפקוד הלב האנושי (למשל, תכונות התכווצות) באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. החד-שכבות הדו-ממדיות hiPSC-CM גודלו בתרבית במשך 2-4 ימים על מצע הידרוג'ל גמיש בפורמט של 48 בארות.
ה-hiPSC-CMs נחשפו לאותות חשמליים סטנדרטיים של אפנון התכווצות הלב (CCM) של מכשירים רפואיים והושוו לבקרה (כלומר, קצב בלבד) hiPSC-CMs. תכונות ההתכווצות הבסיסיות של hiPSC-CMs הדו-ממדיים כומתו על ידי ניתוח זיהוי מבוסס וידאו המבוסס על תזוזת פיקסלים. hiPSC-CMs דו-ממדיים מגורה CCM המצופים על מצע ההידרוג'ל הגמיש הציגו תכונות כיווץ משופרות באופן משמעותי ביחס לקו הבסיס (כלומר, לפני גירוי CCM), כולל משרעת התכווצות שיא מוגברת וקינטיקה מואצת של כיווץ והרפיה. יתר על כן, השימוש במצע ההידרוג'ל הגמיש מאפשר ריבוב של קריאות צימוד התכווצות בעירור לב מבוססות וידאו (כלומר, אלקטרופיזיולוגיה, טיפול בסידן והתכווצות) ב- hiPSC-CMs בריאים וחולים. הזיהוי והכימות המדויקים של ההשפעות של אותות אלקטרופיזיולוגיים לבביים על התכווצות הלב האנושית חיוניים לפיתוח, אופטימיזציה והפחתת סיכונים של מכשור רפואי לבבי. שיטה זו מאפשרת הדמיה חזקה וכימות של תכונות ההתכווצות של סינציציום הלב, אשר אמור להיות בעל ערך עבור בדיקות בטיחות או יעילות של מכשור רפואי לב לא קליני. מאמר זה מתאר, בפירוט, את המתודולוגיה ליצירת 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

המתואר בפרוטוקול זה הוא כלי פשוט וחזק ליצירת מונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות המתכווצות באופן גלוי על מצע הידרוג'ל גמיש. מדידת תכונות ההתכווצות מתבצעת באמצעות הקלטה מבוססת וידאו בשילוב עם תוכנה לניתוח התכווצות. זה מאפשר לכמת פרמטרים מרכזיים של התכווצות קרדיומיוציטים, כולל משרעת התכווצות, שיפוע התכווצות, שיפוע הרפיה, זמן לשיא, זמן לקו הבסיס 90%, ומשך התכווצות 50%. המודל משמש לאפיון תכונות ההתכווצות הבסיסיות של hiPSC-CMs (איור 4) מתורמים "בריאים" שונים, וניתן להרחיב אותו להערכת אותות של אלקטרופיזיולוגיה של הלב של מכשירים רפואיים (כלומר, CCM). היישום של פרמטרי גירוי CCM סטנדרטיים (איור 1D)29,30 הביא לתכונות כיווץ משופרות במבחנה (איור 5 וטבלה 1)17.
עוד הדגמנו שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את ההשפעות של אפנון ריכוזי סידן חוץ-תאיים על תכונות ההתכווצות האנושיות עם וללא גירוי CCM (איור 6)17. התלות הבסיסית הצפויה בסידן של התכווצות נצפתה 7,17, כמו גם עלייה הנגרמת על ידי CCM ברגישות לסידן ברמה של חד-שכבה קרדיומיוציטים. נוסף על כך, החקירה הפרמקולוגית של מסלול האיתות ה-β-אדרנרגי (איור 7) גילתה שההשפעות האינוטרופיות המושרות על-ידי CCM מתווכות בחלקן על-ידי איתות β-אדרנרגי17. יתר על כן, ניתן להרחיב כלי זה לקרדיומיוציטים ספציפיים למחלה ספציפית לחולה, כולל אלה של קרדיומיופתיה מורחבת (DCM)33,34,35 (איור 8), כדי להבין את ההשפעה של CCM בהקשר של מצבי מחלה; ואכן, משרעת התכווצות משופרת וקינטיקה מואצת של כיווץ והרפייה נצפו ב"מינון" CCM שנבדק כאן (איור 8). בעוד שיש לנו מכשיר מחקה CCM במעבדה שלנו, המתודולוגיה המשמשת כאן אינה ספציפית למערכת זו וניתן ליישם אותה על מכשירי אלקטרופיזיולוגיה אחרים של הלב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> איור 1: סיכום סכמטי של מודל hiPSC-CM במבחנה דו-ממדי CCM. (A) hiPSC-CMs מצופים מראש בפורמט חד-שכבתי על לוחות 6 בארות מצופי ג'לטין (0.1%). (B) לאחר יומיים בתרבית, hiPSC-CMs מנותקים ומוכנים לציפוי על מצע הידרוג'ל גמיש. (C) ה-hiPSC-CMs המבודדים מצופים בצפיפות גבוהה על מצעי הידרוג'ל המסודרים בפורמט של 48 בארות (משמאל) ונבדקים בתמיסת סידן טירוד חוץ-תאית (0.5 מילימטר) (מימין). (D) מחולל דופק מסחרי ופרמטרים סטנדרטיים של דופק CCM קליני29,30 (מימין) משמשים לגירוי hiPSC-CMs; תפקוד הלב מוערך על ידי ניתוח מבוסס וידאו (משמאל). (E) רישומי התכווצות מייצגים לפני CCM (קו בסיס: 5 V), במהלך CCM (CCM: 10 V), ואחרי CCM (התאוששות: 5 V). איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> איור 2: סכמה של ציפוי וזריעה של מצע הידרוג'ל גמיש. (A) מצע הידרוג'ל מופשר לחלוטין, לא מדולל מבוסס ECM מוחל על צלחת סטרילית של 48 בארות (פאנל שמאלי), עם 1 מיקרוליטר של מצע הידרוג'ל לכל באר (פאנל ימני). (B) מצע ההידרוג'ל מורשה לדגור בטמפרטורת החדר למשך 8-10 דקות (פאנל ימני), ולאחר מכן ציפוי hiPSC-CMs בצפיפות גבוהה בנפח בינוני נמוך (~200 μL) (פאנל שמאלי). (C) לאחר 10-15 דקות של דגירה, מתווסף מדיום לכל באר (פאנל שמאלי), והלוחות מועברים לאינקובטור תרבית רקמה סטנדרטי (פאנל ימני). קיצורים: ECM = מטריצה חוץ-תאית, hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם; RT = טמפרטורת החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> איור 3: מצע הידרוג'ל חוץ-תאי מבוסס מטריצה. (A) מצע הידרוג'ל מייצג (ללא תאים) בבאר אחת של פלטת זכוכית תחתונה בת 48 בארות מיד לאחר החלת המצע על הבאר. (B) זמן 0 לאחר זרע hiPSC-CMs. (C) זמן 24 שעות לאחר זריעת hiPSC-CMs. לוח זה הודפס מחדש מתוך Feaster et al.17. החיצים הלבנים מציינים את קצה מצע ההידרוג'ל, הגדלה פי 4. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. קיצור: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> איור 4: אפיון תכונות ההתכווצות החד-שכבתיות הדו-ממדיות hiPSC-CM. (A) רישום התכווצות מייצג של hiPSC-CMs דו-ממדיים בקצב של 1 הרץ (5 V). (B) עקבות התכווצות מייצגים המתארים מחזור התכווצות אחד. (C) תרשימי עמודות סיכום. הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 18. קיצור: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> איור 5: השפעה חריפה של CCM על תכונות ההתכווצות הדו-ממדיות hiPSC-CM. (A) רישום התכווצות מייצג לפני CCM (5 V), במהלך CCM (10 V) ואחרי CCM (5 V). (B) עקבות התכווצות מייצגות של ההשפעות המיידיות (כלומר, פעימת CCM אחרונה לפני פעימת CCM, פעימת CCM ראשונה ופעימת CCM ראשונה, מסומנת על ידי +). (C) גרפים מסכמים של ההשפעות המיידיות. אחוז שינוי, הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> איור 6: ההשפעה של אפנון סידן חוץ-תאי על תגובת CCM. (A) עקבות התכווצות מייצגות של ההשפעות המיידיות עבור כל קבוצה לפני CCM (5 V), במהלך CCM (10 V) ואחרי CCM (5 V); hiPSC-CMs נחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של סידן חוץ-תאי (Cao) של 0.25-2 מילימול. (ב-ד) נתונים שהשתנו (סיגמואידלים) כדי להנחות את העין המדגימים את ההשפעה של CCM על רגישות הסידן של תכונות ההתכווצות (כלומר, המשרעת והקינטיקה ) (שיפוע גבעה = 1.0). n = 6-8 לקבוצה. איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> תרשים 7: אתגר פרמקולוגי. עקבות התכווצות מייצגות עבור כל קבוצה לפני CCM (5 V), במהלך CCM (10 V) ואחרי CCM (5V); hiPSC-CMs טופלו מראש עם (A) רכב או (B) metoprolol (2 מיקרומטר). (ג,ד) תרשימי עמודות סיכום עבור כל תנאי. אחוז שינוי, הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 10 לכל קבוצה. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> איור 8: השפעה חריפה של CCM על תכונות ההתכווצות של hiPSC-CMs דו-ממדיים חולים. (A) מעקב התכווצות מייצג עבור DCM L35P, קו בסיס בקרה (לפני, 6 V), ו-DCM L35P בתוספת CCM (10 V). (B) תרשימי עמודות סיכום. אחוז שינוי, הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב; DCM = קרדיומיופתיה מורחבת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו משלים S1: Timelapse של hiPSC-CMs על הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית. hiPSC-CMs דו-ממדיים מצופים על מצע ההידרוג'ל הגמיש; זמן: 0-90 שעות; באר אחת של צלחת תחתונה מזכוכית 48 בארות; הגדלה פי 4. hiPSC-CMs יוצרים סינקיטיום חד-שכבתי אופקי (כלומר, משמאל לימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>
וידאו משלים S2: hiPSC-CMs על הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית. hiPSC-CMs דו-ממדיים מצופים על מצע ההידרוג'ל הגמיש; זמן: ~ 24 שעות; באר אחת של צלחת תחתונה מזכוכית 48 בארות; הגדלה פי 4. hiPSC-CMs יוצרים מורפולוגיה חד-שכבתית ומראים התכווצות חזקה ב~24 שעות לאחר הציפוי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. סרטון זה לקוח מתוך התוכנית Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>CCM</td>
			<td>אחרי</td>
		</tr><tr><td>משרעת</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>הגיע הזמן להגיע לשיא של 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>הגיע הזמן להגיע לשיא של 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>זמן לבסיס 50%</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>זמן בסיסי 90%</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>משך התכווצות 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>משך התכווצות 50%</td>
			<td>-6 ± 5%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>משך התכווצות 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: תכונות התכווצות. אחוז שינוי ביחס לפני CCM (5 V); הנתונים ממוצעים ± SEM עבור כל הפעימות בכל קבוצה במהלך CCM (10 V) ולאחר CCM (5 V). n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. טבלה זו הודפסה מחדש מ-Feaster et al.17.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

כאן, אנו מדגימים שיטה לא פולשנית להערכת התכווצות מכשור רפואי לבבי באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CM), מצופות על מצע גמיש, יחד עם מיקרוסקופ מבוסס וידאו. כלי זה יהיה שימושי להערכה חוץ גופית של תכונות התכווצות של מכשירי אלקטרופיזיולוגיה לבבית.

הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

מעבדות משרד המדע וההנדסה ב-FDA מפתחות כלים מדעיים רגולטוריים כדי לסייע למפתחי מכשור רפואי ולסוקרי FDA. המטרה הסופית שלנו היא להאיץ את גישת המטופלים למכשירים רפואיים חדשניים, בטוחים ויעילים באמצעות המדע הטוב ביותר הזמין. בפרוטוקול זה, אנו מיישמים טכנולוגיה חדשנית של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים להערכת מכשירים רפואיים המשמשים לטיפול במצבים לבביים מסכני חיים.כלי פשוט זה מאפשר הערכה ניתנת לשחזור של מכשירים אלקטרופיזיולוגיים של הלב בצלחת באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. ניתן להשתמש בו גם עם תאים ספציפיים למטופל שמקורם בתורמים עם מחלות לב שונות. כדי להתחיל, צלחת את iPSC אנושי מופשר cardiomyocytes על 0.1% ג 'לטין מצופה שש צלחות סטריליות שש באר לפחות יומיים לפני זריעת cardiomyocytes על מצע הידרוג'ל גמיש.תרבית את ה- iPSC האנושי הפיק קרדיומיוציטים בתווך קרדיומיוציטים סטנדרטי במשך יומיים עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר להם להתאושש מהשימור בהקפאה. רענן את המדיום בילה עם 100% cardiomyocyte בינוני כל 48 שעות. בדוק את המצב של קרדיומיוציטים הנגזרים מ- iPSC האנושי לפני הדיסוציאציה על ידי הערכת בריאות התאים, הבטחת כדאיות ופעימות יציבות.לשטוף את cardiomyocytes עם ארבעה מיליליטר לכל באר של DPBS ללא סידן כלורי או מגנזיום כלורי. מוסיפים מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה בטמפרטורת החדר לכל באר ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום cardiomyocyte כדי סטרילי 15 מיליליטר צינור חרוט.לנתק את cardiomyocytes מן צלחות שש באר עם פיפטה 1, 000 מיקרוליטר ולהוסיף את השעיית התא צינור חרוט. לשטוף את הבארות עם מיליליטר אחד של מדיום cardiomyocyte טרי כדי לאסוף כל שאריות cardiomyocytes ולהוסיף אותם צינור חרוט. לאחר מכן להביא את הנפח הסופי של צינור חרוטי ל 15 מיליליטר עם המדיום.צנטריפוגו את הצינור ב-200 גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנאטנט עד למיליליטר אחד. להשעות מחדש את התאים בתווך cardiomyocyte לנפח סופי של חמישה מיליליטר ולספור את cardiomyocytes עם מונה תאים ידני או אוטומטי. לאחר מכן, לדגור על תרחיף התא cardiomyocyte במשך כ 30 דקות בטמפרטורת החדר בעוד מצעי הידרוג'ל גמישים מוכנים.מכינים פיפטה של 20 מיקרוליטר במיקרוליטר אחד, קצוות פיפטה, פלטה תחתונה סטרילית מזכוכית 48 בארות וטיימר סטופר במכסה המנוע של תרבית הרקמות. ערבבו את המטריצה החוץ תאית או מצע הידרוג'ל מבוסס ECM על ידי הקשה עדינה על הצינור ומיד הנחתו בחזרה על קרח. הפעל את שעון העצר מיד לפני ציפוי מצע ההידרוג'ל הראשון וסמן זאת כזמן אפס.פיפטה מיקרוליטר אחד של מצע ההידרוג'ל מעלה ומטה בערך שלוש פעמים כדי לקרר את קצה הפיפטה. לאחר מכן להחיל כ מיקרוליטר אחד של מצע הידרוג'ל מדולל אופקית על החלק התחתון של כל באר בצלחת 48 באר, מחזיק פיפטה בזווית 45 מעלות. לוחים את כל מצעי ההידרוג'ל באותו כיוון בכל באר כדי לסייע בזיהוי המצע בעת ביצוע הניסויים בהגדלה של פי 40.מניחים את המכסה על צלחת 48 בארות ומאפשרים למצעי ההידרוג'ל לדגור במשך שמונה עד 10 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית הרקמה לפני הוספת התאים. לאחר הדגירה, מיד זרע cardiomyocytes dropwise ישירות על מצעי הידרוג'ל עם כ 30, 000 cardiomyocytes קיימא לכל באר בנפח בינוני נמוך של כ 200 מיקרוליטר של מדיום cardiomyocyte. לאחר סגירת המכסה, אפשרו לקרדיומיוציטים לדגור ללא הפרעה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע כדי לאפשר לתאים להיצמד למצע ההידרוג'ל.מוסיפים בעדינות 100 מיקרוליטר של מדיום קרדיומיוציטים טריים לכל באר. הניחו את המכסה סגור על אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך יומיים עד ארבעה ימים. הפעל את המיקרוסקופ ואת תא הבקרה הסביבתית כדי לאזן ל -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.הסר את מדיום cardiomyocyte מן צלחת 48 באר ולשטוף בעדינות כל טוב פעמיים עם 600 מיקרוליטר של אפנון התכווצות הלב או מדיום בדיקת CCM. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של מדיום בדיקת CCM לכל באר ולהניח את צלחת 48 באר על המיקרוסקופ בתא הבקרה הסביבתית. הכנס את האלקטרודות ואזן את התאים למשך חמש דקות.כדי להקליט את סרטוני ההתכווצות באמצעות מיקרוסקופ מבוסס וידאו, פתח את תוכנת הקלטת הווידאו והגדר קצב פריימים של 100 פריימים לשנייה. לאחר מכן בחר אזור עניין או החזר השקעה ליד מרכז השכבה החד-שכבתית hiPSC-CM. לאחר מכן שדה לעורר את התאים עם מחולל דופק מסחרי כדי קצב חשמלי את monolayers cardiomyocytes 2D.מקם את cardiomyocyte על סף פי 1.5 בהרץ אחד עם פרמטרים הדופק הבסיסי. לדוגמה, קצב גל מרובע מונופאזי פולסים עם משך פעימת גירוי של שתי אלפיות השנייה של חמישה וולט. הקלט את סרטון הקצב הבסיסי בלבד לפני CCM למשך חמש פעימות לפחות.לאחר מכן לעורר את monolayer cardiomyocytes עם אות חשמלי ניסיוני של עיכוב 30 אלפיות השנייה, שני פולסים biphasic סימטרי של 5.14 אלפיות השנייה משך פאזה, עם משך כולל 20.56 אלפיות השנייה, 10 וולט משרעת פאזה, ומרווח interphase אפס. הקלט את סרטון ההתכווצות הנגרמת על ידי CCM במשך חמש פעימות לפחות. כבה את אות CCM, עורר עם דופק קצב בסיסי והקלט סרטון התכווצות של תקופת ההתאוששות לאחר CCM למשך חמש פעימות לפחות.השתמש בתוכנת כיווץ סטנדרטית כדי לנתח את סרטוני ההתכווצות באופן אוטומטי ולכמת את תכונות ההתכווצות העיקריות כמו משרעת התכווצות, שיפוע התכווצות, שיפוע הרפיה, זמן לשיא, זמן לקו הבסיס 90% ומשך התכווצות 50% ה- iPSC האנושי הדו-ממדי שמקורו בתכונות חוזיות חד-שכבתיות אופיינו והפרמטרים העיקריים של התכווצות קרדיומיוציטים כומתו. היישום של פרמטרי גירוי CCM סטנדרטיים הביא לתכונות כיווץ משופרות במבחנה. ההשפעות של אפנון ריכוזי סידן חוץ-תאיים על תכונות ההתכווצות האנושית עם וללא גירוי CCM הוערכו.נצפתה תלות בסיסית צפויה בסידן של התכווצות, כמו גם עלייה הנגרמת על ידי CCM ברגישות לסידן ברמה של חד-שכבה קרדיומיוציטים. בנוסף, החקירה הפרמקולוגית של מסלול איתות בטא אנדרוגני גילתה כי ההשפעות האינוטרופיות המושרות על ידי CCM מתווכות בחלקן על ידי איתות בטא אדרנרגי. יתר על כן, כלי זה ניתן להרחיב cardiomyocytes מחלה ספציפית למטופל, כולל אלה של קרדיומיופתיה מורחבת כדי להבין את ההשפעה של CCM בהקשר של מצבי מחלה.כאן, אנו מתמקדים בעיקר בהערכת תכונות התכווצות אנושית. עם זאת, באמצעות כלי זה, ניתן גם להעריך קריאות צימוד אחרות של התכווצות עירור הלב, כולל פוטנציאלי פעולה וטיפול בסידן. זהו הכלי המדעי הרגולטורי הראשון המשלב תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי טכנולוגיה עם הערכה של מכשירי לב.שיטה חלופית זו סוללת את הדרך להערכת מכשירים רפואיים בצלוחית ויש לה פוטנציאל להפחית את הצורך בניסויים בבעלי חיים ובבני אדם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

שחזורים אנטומיים של מערכת ורידי לב האנושית באמצעות ניגודיות, טומוגרפיה ממוחשבת של דגימות זלוף-קבועות

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave אפליקציות לסלולריים תרבויות

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...