Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

इस काम को अमेरिकी ऊर्जा विभाग और अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन के बीच एक अंतर-एजेंसी समझौते के माध्यम से ओक रिज इंस्टीट्यूट फॉर साइंस एंड एजुकेशन द्वारा प्रशासित सेंटर फॉर डिवाइसेस एंड रेडियोलॉजिकल हेल्थ में अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम में नियुक्ति द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक रिचर्ड ग्रे, ट्रेंट रॉबर्टसन और अन्ना अविला को उनके सुझावों और तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। अध्ययन को अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन, विज्ञान और इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं के कार्यालय के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।

यह लेख लेखकों के विचारों को दर्शाता है और इसे अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन के विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं माना जाना चाहिए। यहां दी गई सामग्री के संबंध में वाणिज्यिक उत्पादों, उनके स्रोतों या उनके उपयोग के उल्लेख को स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा ऐसे उत्पादों के वास्तविक या निहित समर्थन के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। लेखक इस काम के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं करते हैं।

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल वाणिज्यिक अभिकर्मकों7,17 के साथ एक लचीले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर मजबूत रूप से अनुबंधित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है। लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर बीजित एचआईपीएससी-सीएम व्यवहार्य रहते हैं और इनमें सिकुड़ा हुआ गुण बढ़जाता है। यह तकनीक मानक प्रयोगशाला उपकरण और क्षमताओं पर निर्भर करतीहै। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के साथ काम करने के संबंध में शामिल है, जिसके लिए विस्तार से सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। एक संभावित मुद्दा माध्यम में सीरम की उपस्थिति है। इसके परिणामस्वरूप एचआईपीएससी-सीएम एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर शीट के बजाय नेटवर्क (जैसे, एंडोथेलियल / संवहनी नेटवर्क) बना सकते हैं; इसलिए, लचीले हाइड्रोगेल एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर (यानी, दिन 0 से दिन 4) की स्थापना के दौरान एक सीरम-मुक्त माध्यम की सिफारिश की जाती है। इसी तरह, एक समय में बहुत सारे हाइड्रोगेल सब्सट्रेट तैयार करने से ऑपरेटर थकान के कारण खराब या असमान सब्सट्रेट हो सकते हैं। हालांकि जल्दी से काम करना महत्वपूर्ण है, प्रत्येक हाइड्रोगेल सब्सट्रेट की अखंडता महत्वपूर्ण है। इसी तरह, किसी को सावधानीपूर्वक एचआईपीएससी-सीएम को जोड़ना चाहिए और माध्यम बदलना चाहिए; यह बलपूर्वक नहीं किया जाना चाहिए। माध्यम को बदलते समय, इसे कुएं के ऊपरी किनारे से धीरे से जोड़ा जाना चाहिए ताकि हाइड्रोगेल सब्सट्रेट या कोशिकाओं को बाधित न किया जा सके। मानक 2 डी एचआईपीएस-सीएम संस्कृतियों (यानी, पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या ग्लास) के साथ, कम घनत्व पर चढ़ाना अपूर्ण मोनोलेयर गठन का परिणाम होगा। यह पुष्टि करने के लिए कि वे हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर हैं और सटीक समय सुनिश्चित करने के लिए टाइमर का उपयोग करने के लिए एचआईपीएससी-सीएम का नेत्रहीन निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 14 दिनों से अधिक समय तक 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर की खेती करने से ईसीएम गुणों और सब्सट्रेट के निर्माता के निर्देशों के आधार पर मोनोलेयर व्यवधान हो सकता है।
वर्तमान विधि की कई सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं एक वाणिज्यिक HIPSC-CM प्रदाता से थीं, और वे कोशिकाएं विद्युत रूप से युग्मित कोशिकाओं का एक सिंकिटियम बनाती हैं। सिंसाइटियम में सभी तीन कार्डियक उपप्रकारों (यानी, वेंट्रिकुलर, एट्रियल और नोडल) से एचआईपीएससी-सीएम का मिश्रण होता है। अध्ययन एक उपप्रकार-अनन्य HIPSC-CM आबादी (यानी, 100% वेंट्रिकुलर या 100% एट्रियल) से लाभान्वित हो सकते हैं। दूसरा, इस विधि ने केवल एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग किया, जबकि कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स सहित गैर-मायोसाइट्स, एचआईपीएससी-सीएम कार्यक्षमता22,36 को बढ़ा सकते हैं। तीसरा, 2 डी एचआईपीएससी-सीएम अपेक्षाकृत अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स की कई विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जिसमें सहज धड़कन, अमॉर्फिक आकृति विज्ञान और एक इनोट्रोपिक प्रतिक्रिया 8,37 की कमी शामिल है। चौथा, जबकि यह प्रोटोकॉल 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को मजबूत रूप से अनुबंधित करता है, यह संभावना है कि कार्यात्मक रूप से बढ़ाए गए 3 डी एचआईपीएससी-सीएम मॉडल जैसे कि इंजीनियर कार्डियक ऊतक (ईसीटी) के परिणामस्वरूप शारीरिक कैल्शियम सांद्रता8,38 के तहत एक बढ़ी हुई सीसीएम-प्रेरित सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया होगी। अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल 48-वेल प्रारूप के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, अनुकूलन और स्वचालन के समावेश के साथ, इसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप (जैसे, 96-वेल या 384-वेल प्लेट्स) तक बढ़ाया जा सकता है।
HIPSC-CM अध्ययन के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक पारंपरिक कठोर 2 D संस्कृति स्थितियां (यानी, ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या ग्लास) है। जबकि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी3 और कैल्शियम हैंडलिंग39 अध्ययनों के लिए उपयोगी है, पारंपरिक पद्धति के परिणामस्वरूप न्यूनतम सिकुड़ा हुआ गुण 5,6,7 है। नतीजतन, पारंपरिक कठोर 2 डी संस्कृति की स्थिति सीसीएम सिकुड़ा हुआ प्रभाव8 के आकलन के लिए उत्तरदायी नहीं है। कार्यात्मक रूप से उन्नत 3 डी एचआईपीएससी-सीएम ईसीटी विधियां38 तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, समय लेने वाली हैं, और परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता होती है जो हर प्रयोगशाला में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम 3 डी ईसीटी विधियों या दीर्घकालिक, पारंपरिक 2 डी विधियों 7,40,41 की तुलना में कम समय सीमा में मजबूत रूप से अनुबंधित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक सरल पद्धति का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, यहां उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जिसमें हाइड्रोगेल सब्सट्रेट और एचआईपीएस-सीएम शामिल हैं, और दोनों में काफी बहुत अधिक स्थिरता है। जबकि हमने हटाने योग्य प्लैटिनम तार इलेक्ट्रोड (इंटरइलेक्ट्रोड दूरी: 2.0 मिमी, चौड़ाई: 1.0 मिमी) का उपयोग किया, विभिन्न इलेक्ट्रोड सामग्री और विन्यास विट्रो 8,15,17,18,22 में सीसीएम सिकुड़ा हुआ आकलन के लिए उत्तरदायी हैं। इसी तरह, कई स्वचालित सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं जो संकुचन वीडियो 7,31,32 के विश्लेषण को सक्षम करते हैं।
कार्डियक चिकित्सा उपकरण संकुचन का मूल्यांकन करने के लिए अधिकांश गैर-नैदानिक तरीके विवो पशु मॉडल (जैसे, कुत्ते या सूअर) और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पैपिलरी मांसपेशी स्ट्रिप्स (जैसे, खरगोश) 18 में महंगे पर निर्भर करते हैं। इस पेपर ने अनुबंध पर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चिकित्सा उपकरण संकेतों के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक मानव इन विट्रो मॉडल का वर्णन किया। यह उपकरण पशु अध्ययन पर निर्भरता को कम कर सकता है और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के सिकुड़ा हुआ गुणों के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता है।

जैसे-जैसे संयुक्त राज्य अमेरिका की आबादी की उम्र बढ़ती है, दिल की विफलता के रोगियों की संख्या में वृद्धि जारी है, साथ ही प्रत्यक्ष चिकित्सा लागत 1,2 है। दिल की विफलता के इलाज के लिए नए उपचार विकसित करने और इस तरह के उपचारों का परीक्षण करने के लिए अभिनव गैर-नैदानिक पद्धतियों को विकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) को चिकित्सीय विकास प्रक्रिया में सहायता के लिए एक इन विट्रो उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है और इसका उपयोग नियामक प्रस्तुतियों 3,4 में किया गया है। हालांकि, मानक कठोर 2 डी संस्कृति स्थितियों (यानी, पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या ग्लास) 5,6,7,8 में चढ़ाए जाने पर मजबूत सिकुड़ा हुआ गुणों की कमी के कारण अनुबंध अध्ययन के लिए उनका व्यापक उपयोग सीमित रहा है। हमने पहले मजबूत दृश्यमान सिकुड़ा हुआ गुण उत्पन्न करने के लिए एक लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर पृथक एकल एचआईपीएससी-सीएम चढ़ाना की उपयोगिता का प्रदर्शनकिया था। हमने दिखाया कि पृथक HIPSC-CM में ताजा पृथक वयस्क खरगोश वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलनीय सिकुड़ा हुआ गुण होता है। इसके अलावा, हमने फार्माकोलॉजिकल एजेंटों के लिए सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस विधि की उपयोगिता का प्रदर्शनकिया। इसके अलावा, अन्य अध्ययनों ने इस तकनीक को बुनियादी विज्ञान और रोग मॉडलिंग10,11,12 के लिए यंत्रवत आकलन के लिए लागू किया है। यहां, इस पद्धति को 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर तक बढ़ाया गया है, और शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन (सीसीएम) चिकित्सा उपकरण विद्युत संकेतों के मूल्यांकन में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन किया गया है।
सीसीएम एक इंट्राकार्डियक हार्ट फेल्योर थेरेपी है जिसमें हृदय चक्र13,14 की पूर्ण दुर्दम्य अवधि के दौरान मायोकार्डियम को गैर-उत्तेजक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल दिए जाते हैं। मानव कार्डियक सेल मॉडल में सीसीएम का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों की कमी है। पिछले काम ने सीसीएम सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न कार्डियक सेल मॉडल को नियोजित किया है। हमने विट्रो में प्रदर्शित किया कि ताजा पृथक खरगोश वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स कैल्शियम और संकुचन आयाम 15 में क्षणिक वृद्धि द्वारा सीसीएम उत्तेजना का जवाबदेते हैं। पृथक कैनाइन वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स में एक अन्य अध्ययन ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिक आयाम16 के सीसीएम-प्रेरित वृद्धि का प्रदर्शन किया। हालांकि, अधिकांश सीसीएम अध्ययनों ने एक्स विवो और विवो पशु तैयारी में उपयोग किया है। इन अध्ययनों को एक दूसरे के साथ सहसंबंधित करना मुश्किल है क्योंकि वे विभिन्न प्रकार के सीसीएम पल्स पैरामीटर और प्रजातियों17 को लागू करते हैं। एक पृथक खरगोश पेपिलरी मॉडल में एक अध्ययन ने सीसीएम-प्रेरित संकुचन8,18 में वृद्धि का खुलासा किया, और पूरे दिल के अध्ययनों की एक सरणी ने सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन 19,20,21 के सीसीएम-प्रेरित वृद्धि का प्रदर्शन किया है। इन अध्ययनों ने महत्वपूर्ण यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, सीसीएम सहित इन विट्रो कार्डियक ईपी सिकुड़ा हुआ अध्ययन के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानव मॉडल की कमी है। उस अंत की ओर, हमने कई 2 डी और 3 डी एचआईपीएस मॉडल विकसित किए हैं और पैरामीटर-निर्भर तरीके से सिकुड़ा हुआ गुणों की सीसीएम-प्रेरित वृद्धि का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, सीसीएम-प्रेरित इनोट्रोपिक प्रभाव न्यूरोनल इनपुट और β-एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग 8,17,22 द्वारा मध्यस्थ पाए गए हैं। फिर भी, सीसीएम थेरेपी के तंत्र के बारे में अधिक जानने की आवश्यकता है, और मानव कार्डियोमायोसाइट्स के अनुबंध का उपयोग करने से इस परिणाम को प्राप्त करने में सहायता मिल सकती है। इस प्रकार, नए सीसीएम उपकरणों और संकेतों का मूल्यांकन करने, नियामक प्रक्रिया को तेज करने, पशु मॉडल पर बोझ को कम करने और डिवाइस डेवलपर निर्णय लेने में सहायता करने के लिए मानव गैर-नैदानिक उपकरणविकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। आसान, डू-इट-योरसेल्फ प्रोटोकॉल विकसित करना महत्वपूर्ण है जिसे किसी भी प्रयोगशाला में स्थानांतरित किया जा सकता है और जो लागत को कम करने के लिए मानक उपकरण और कम सेल आवश्यकताओं का उपयोग करते हैं। यह विधि मानव कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन पर सीसीएम उत्तेजना के प्रभावों को स्पष्ट करती है और सीसीएम सुरक्षा या प्रभावशीलता पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करतीहै। यहां, हम स्वास्थ्य और बीमारी में तीव्र कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चिकित्सा उपकरण (यानी, सीसीएम) सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए एक मानकीकृत गैर-नैदानिक उपकरण का उत्पादन करने के लिए एक लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने की विधि का वर्णन करते हैं।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) वर्तमान में कई इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए खोजे जा रहे हैं और नियामक प्रस्तुतियों में उपयोग किए गए हैं। यहां, हम कार्डियक मेडिकल डिवाइस सुरक्षा या प्रदर्शन आकलन के लिए उनके उपयोग का विस्तार करते हैं। हमने एक लचीले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाए गए 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को मजबूत रूप से अनुबंधित करने में कार्डियक मेडिकल डिवाइस सिकुड़ा हुआ गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक नई विधि विकसित की। यह उपकरण मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ मानव हृदय समारोह (जैसे, सिकुड़ा हुआ गुण) पर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डिवाइस सिग्नल के प्रभावों का परिमाणीकरण करने में सक्षम बनाता है। 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को 48-वेल प्रारूप में लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 2-4 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था।
एचआईपीएससी-सीएम को मानक कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन (सीसीएम) चिकित्सा उपकरण विद्युत संकेतों से अवगत कराया गया था और नियंत्रण (यानी, केवल पेसिंग) एचआईपीएस-सीएम की तुलना में किया गया था। 2 डी एचआईपीएससी-सीएम के बेसलाइन सिकुड़ा हुआ गुण पिक्सेल विस्थापन के आधार पर वीडियो-आधारित पहचान विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाए गए सीसीएम-उत्तेजित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम ने बेसलाइन (यानी, सीसीएम उत्तेजना से पहले) के सापेक्ष काफी बढ़े हुए सिकुड़ा हुआ गुण प्रदर्शित किया, जिसमें एक बढ़ा हुआ चरम संकुचन आयाम और त्वरित संकुचन और विश्राम कैनेटीक्स शामिल हैं। इसके अलावा, लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त एचआईपीएस-सीएम में वीडियो-आधारित कार्डियक-उत्तेजना संकुचन युग्मन रीडआउट (यानी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम हैंडलिंग और संकुचन) के मल्टीप्लेक्सिंग को सक्षम बनाता है। मानव हृदय संकुचन पर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों के प्रभावों का सटीक पता लगाना और परिमाणीकरण कार्डियक चिकित्सा उपकरण के विकास, अनुकूलन और डी-रिस्किंग के लिए महत्वपूर्ण है। यह विधि कार्डियक सिंकेटियम के सिकुड़ा हुआ गुणों के मजबूत विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण को सक्षम करती है, जो गैर-नैदानिक कार्डियक चिकित्सा उपकरण सुरक्षा या प्रभावशीलता परीक्षण के लिए मूल्यवान होना चाहिए। यह पेपर विस्तार से, 2 डी एचआईपीएससी-सीएम हाइड्रोगेल सब्सट्रेट मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है।

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Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

यहां, हम 2 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट (एचआईपीएससी-सीएम) मोनोलेयर का उपयोग करके एक गैर-इनवेसिव कार्डियक मेडिकल डिवाइस कॉन्ट्रैक्टिलिटी मूल्यांकन विधि का प्रदर्शन करते हैं, जिसे एक लचीले सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है, वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित किया जाता है। यह उपकरण कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के सिकुड़ा हुआ गुणों के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए उपयोगी होगा।

2 डी मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन थेरेपी का मूल्यांकन

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

एफडीए में विज्ञान और इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं का कार्यालय चिकित्सा उपकरण डेवलपर्स और एफडीए समीक्षकों की सहायता के लिए नियामक विज्ञान उपकरण विकसित कर रहा है। हमारा अंतिम लक्ष्य सर्वोत्तम उपलब्ध विज्ञान के माध्यम से अभिनव, सुरक्षित और प्रभावी चिकित्सा उपकरणों तक रोगी की पहुंच में तेजी लाना है। इस प्रोटोकॉल में, हम चिकित्सा उपकरणों के मूल्यांकन के लिए अत्याधुनिक प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल तकनीक लागू करते हैं जिनका उपयोग जीवन-धमकी देने वाली हृदय स्थितियों के इलाज के लिए किया जाता है।यह सरल उपकरण मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके डिश में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। इसका उपयोग विभिन्न हृदय रोगों वाले दाताओं से प्राप्त रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ भी किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर कार्डियोमायोसाइट्स को सीड करने से कम से कम दो दिन पहले 0.1% जिलेटिन लेपित बाँझ छह-वेल प्लेटों पर पिघले हुए मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स को प्लेट करें।मानव आईपीएससी ने 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो से चार दिनों के लिए मानक कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम में कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त किए ताकि उन्हें क्रायो-संरक्षण से उबरने की अनुमति मिल सके। हर 48 घंटे में 100% कार्डियोमायोसाइट माध्यम के साथ खर्च किए गए माध्यम को ताज़ा करें। कोशिकाओं के स्वास्थ्य का मूल्यांकन करके, व्यवहार्यता और स्थिर धड़कन सुनिश्चित करके पृथक्करण से पहले मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की स्थिति की जांच करें।कैल्शियम क्लोराइड या मैग्नीशियम क्लोराइड के बिना डीपीबीएस के चार मिलीलीटर प्रति कुएं के साथ कार्डियोमायोसाइट्स को धोएं। प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर कमरे का तापमान पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम जोड़ें।कार्डियोमायोसाइट्स को 1,000 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ छह-वेल प्लेटों से अलग करें और शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन जोड़ें। किसी भी अवशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स को इकट्ठा करने और उन्हें शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ने के लिए ताजा कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ कुओं को कुल्ला करें। फिर शंक्वाकार ट्यूब के अंतिम आयतन को माध्यम के साथ 15 मिलीलीटर तक लाएं।ट्यूब को पांच मिनट के लिए 200 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और एक मिलीलीटर के निशान तक सतह पर तैरने वाले को हटा दें। कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम में कोशिकाओं को पांच मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में पुन: निलंबित करें और कार्डियोमायोसाइट्स को मैन्युअल या स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनते हैं। इसके बाद, कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन को कमरे के तापमान पर लगभग 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जबकि लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट तैयार किए जाते हैं।एक माइक्रोलीटर पर 20 माइक्रोलीटर पिपेट सेट, पिपेट टिप्स, एक बाँझ 48-वेल ग्लास बॉटम प्लेट और टिशू कल्चर हुड में एक स्टॉपवॉच टाइमर तैयार करें। ट्यूब को धीरे से टैप करके और तुरंत बर्फ पर वापस रखकर बाह्य मैट्रिक्स या ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट मिलाएं। पहले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट को चढ़ाने से तुरंत पहले स्टॉपवॉच टाइमर शुरू करें और इसे समय शून्य के रूप में चिह्नित करें।पिपेट टिप को ठंडा करने के लिए हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के एक माइक्रोलीटर को लगभग तीन बार ऊपर और नीचे करें। फिर 48-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं के तल पर क्षैतिज रूप से अप्रकाशित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के लगभग एक माइक्रोलीटर को लागू करें, पिपेट को 45 डिग्री कोण पर पकड़ें। 40 एक्स आवर्धन पर प्रयोगों को करते समय सब्सट्रेट की पहचान करने में मदद करने के लिए प्रत्येक कुएं में एक ही अभिविन्यास में सभी हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स को प्लेट करें।ढक्कन को 48-वेल प्लेट पर रखें और हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स को कोशिकाओं को जोड़ने से पहले टिशू कल्चर हुड में कमरे के तापमान पर आठ से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स को तुरंत कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम के लगभग 200 माइक्रोलीटर की कम मध्यम मात्रा में लगभग 30,000 व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स प्रति कुएं के साथ हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स पर सीधे बीज दें। ढक्कन बंद करने के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स को हुड में कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए निर्विवाद रूप से इनक्यूबेट करने की अनुमति दें ताकि कोशिकाएं हाइड्रोगेल सब्सट्रेट का पालन कर सकें।धीरे से प्रत्येक कुएं में ताजा कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। ढक्कन बंद प्लेट को इनक्यूबेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो से चार दिनों के लिए रखें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के बराबर होने के लिए माइक्रोस्कोप और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष चालू करें।कार्डियोमायोसाइट माध्यम को 48-वेल प्लेट से निकालें और धीरे-धीरे कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन या सीसीएम परख माध्यम के 600 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार कुल्ला करें। फिर प्रति अच्छी तरह से सीसीएम परख माध्यम के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष में माइक्रोस्कोप पर 48-वेल प्लेट रखें। इलेक्ट्रोड डालें और कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए बराबर करें।वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संकुचन वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए, वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें और प्रति सेकंड 100 फ्रेम की फ्रेम दर सेट करें। फिर HIPSC-CM मोनोलेयर के केंद्र के पास रुचि या ROI के क्षेत्र का चयन करें। फिर क्षेत्र 2 डी कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर को विद्युत रूप से गति देने के लिए एक वाणिज्यिक पल्स जनरेटर के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करता है।कार्डियोमायोसाइट्स को बेसलाइन पल्स पैरामीटर के साथ एक हर्ट्ज पर 1.5 गुना दहलीज पर रखें। उदाहरण के लिए, मोनोफैसिक स्क्वायर वेव पेसिंग पल्स पांच वोल्ट की दो मिलीसेकंड उत्तेजना पल्स अवधि के साथ। सीसीएम से पहले बेसलाइन पेसिंग केवल संकुचन वीडियो को कम से कम पांच बीट्स के लिए रिकॉर्ड करें।फिर कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर को 30 मिलीसेकंड की देरी के प्रयोगात्मक विद्युत संकेत के साथ उत्तेजित करें, 5.14 मिलीसेकंड चरण अवधि के दो सममित बाइफैसिक पल्स, 20.56 मिलीसेकंड कुल अवधि, 10 वोल्ट चरण आयाम और शून्य इंटरफेज अंतराल के साथ। सीसीएम-प्रेरित संकुचन वीडियो को कम से कम पांच बीट्स के लिए रिकॉर्ड करें। सीसीएम सिग्नल को बंद करें, बेसलाइन पेसिंग पल्स के साथ उत्तेजित करें और सीसीएम के बाद रिकवरी अवधि का संकुचन वीडियो कम से कम पांच बीट के लिए रिकॉर्ड करें।संकुचन वीडियो का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने के लिए एक मानक संकुचन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और संकुचन आयाम, संकुचन ढलान, विश्राम ढलान, समय से शिखर, बेसलाइन 90% और संकुचन अवधि 50% जैसे प्रमुख सिकुड़ा हुआ गुणों को निर्धारित करें। मानक सीसीएम उत्तेजना मापदंडों के आवेदन के परिणामस्वरूप विट्रो में सिकुड़ा हुआ गुण बढ़ गया। सीसीएम उत्तेजना के साथ और बिना मानव सिकुड़ा हुआ गुणों पर बाह्य कैल्शियम सांद्रता मॉड्यूलेशन के प्रभावों का मूल्यांकन किया गया था।संकुचन की अपेक्षित आधारभूत कैल्शियम निर्भरता देखी गई, साथ ही कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर के स्तर पर कैल्शियम संवेदनशीलता में सीसीएम-प्रेरित वृद्धि हुई। इसके अलावा, बीटा एंड्रोजेनिक सिग्नलिंग मार्ग की औषधीय पूछताछ से पता चला कि सीसीएम-प्रेरित इनोट्रोपिक प्रभाव बीटा एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थ थे। इसके अलावा, इस उपकरण को रोगी-विशिष्ट रोग कार्डियोमायोसाइट्स तक विस्तारित किया जा सकता है, जिसमें रोग राज्यों के संदर्भ में सीसीएम के प्रभाव को समझने के लिए पतला कार्डियोमायोपैथी शामिल है।यहां, हम मुख्य रूप से मानव सिकुड़ा हुआ गुणों का मूल्यांकन करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, इस उपकरण का उपयोग करके, कोई अन्य कार्डियक उत्तेजना संकुचन युग्मन रीडआउट का भी मूल्यांकन कर सकता है जिसमें एक्शन पोटेंशिअल और कैल्शियम हैंडलिंग शामिल हैं। यह हृदय उपकरणों के मूल्यांकन के साथ प्रौद्योगिकी द्वारा प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल को संयोजित करने वाला पहला नियामक विज्ञान उपकरण है।यह वैकल्पिक विधि एक डिश में चिकित्सा उपकरणों का मूल्यांकन करने का मार्ग प्रशस्त करती है और इसमें पशु और मानव विषय परीक्षण की आवश्यकता को कम करने की क्षमता है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Cardiomyocytes की कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक आतंच Hydrogel में इनकैप्सुलेशन

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

इसके विपरीत गणना छिड़काव तय नमूने के टोमोग्राफी का उपयोग करते हुए मानव कार्डिएक शिरापरक प्रणाली के संरचनात्मक पुनर्निर्माण

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

संस्कृति सेल शॉक वेव आवेदन

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

निर्धारित मानव इंजीनियर कार्डिएक ऊतकों के निर्माण हृदय सेल थेरेपी के तंत्र का अध्ययन करने के लिए

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

वयस्क अस्थि मज्जा में MicroRNA हस्तांतरण के लिए प्रोटोकॉल-व्युत्पंन टेम स्टेम कोशिकाओं सेल इंजीनियरिंग चुंबकीय लक्ष्यीकरण के साथ संयुक्त सक्षम करने के लिए

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

वीवो मायोकार्डियल रिपेयर में मानव आईपीएस कोशिकाओं से प्राप्त मेष के आकार के इंजीनियर कार्डियक ऊतकों की तैयारी

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

मानव iPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके 3 डी कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों का निर्माण

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

इन विट्रो अग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम सेल का प्रेरण

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...