Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte por uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa no Centro de Dispositivos e Saúde Radiológica administrado pelo Oak Ridge Institute for Science and Education através de um acordo interagências entre o Departamento de Energia dos EUA e a Food and Drug Administration dos EUA. Os autores agradecem a Richard Gray, Trent Robertson e Anna Avila por suas sugestões e assistência técnica. O estudo foi financiado pela Food and Drug Administration dos EUA, Escritório de Laboratórios de Ciência e Engenharia.

1. Preparação das placas e meios
NOTA: Uma alíquota típica de hidrogel à base de matriz extracelular (ECM) é ~200 μL em um tubo estéril de 1,5 mL armazenado a -20 °C.
<ol><li>Em um exaustor de cultura de tecidos estéreis, prepare uma placa estéril de 6 poços transferindo 2 mL de gelatina a 0,1% (Tabela de Materiais) para cada poço. Coloque a tampa na placa de 6 poços e deixe a placa revestida incubar a 37 °C por um período mínimo de 1 h.</li>
	<li>Um dia antes de semear os hiPSC-CMs no substrato de hidrogel flexível, descongele uma alíquota de hidrogel (Tabela de Materiais) na geladeira sobre gelo.</li>
	<li>Preparar o meio cardiomiócito (Tabela de Materiais) misturando 500 mL de RPMI 1640, 10 mL de 50x B-27 Suplemento e 5 mL de penicilina-estreptomicina9.</li>
</ol>2. Semeadura de hiPSC-CMs criopreservados
<ol><li>Dois dias antes de semear os CMs hiPSC no substrato de hidrogel flexível, pré-prato os CMs hiPSC-CMs em placas estéreis de 6 poços revestidas com gelatina a 0,1%. Descongelar os CM-hiPSC utilizando um protocolo de descongelamento padrão 9,25.</li>
	<li>Em seguida, placa 1.500.000 hiPSC-CMs totais (Tabela de Materiais) por poço de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1A)26.</li>
	<li>Cultura dos CM-hiPSC em meio cardiomiócito padrão por 2-4 dias para permitir que os CM-hiPSC se recuperem da criopreservação a 37 °C e 5% de CO2. Refrescar o meio gasto com meio 100% cardiomiócito a cada 48 h.</li>
</ol>3. Dissociação e contagem dos CM-HCP pré-chapeados
<ol><li>Verifique o status dos CMs hiPSC antes da dissociação. Avaliar a saúde dos hiPSC-CMs, garantindo viabilidade e batimento estável. NOTA: A pureza da população de CM-hiPSC é importante (por exemplo, >90% de troponina T cardíaca)7. Um método de seleção de cardiomiócitos (por exemplo, seleção ou classificação metabólica) é recomendado para reduzir a ruptura do substrato de hidrogel por células não cardiomiócitos25,26.</li>
	<li>Lavar os CMs hiPSC 2x com 4 mL por poço de D-PBS sem CaCl 2 ou MgCl2 (Tabela de Materiais). Aspirar o D-PBS, adicionar 1 mL de reagente de dissociação de temperatura ambiente a cada poço e, em seguida, incubar por 15 min a 37 °C.</li>
	<li>Adicione 10 mL de meio cardiomiócito a um tubo cônico estéril de 15 mL.</li>
	<li>Dissociar os CMhiPSC da placa de 6 poços com uma pipeta de 1.000 μL (Figura 1B). Adicionar a suspensão celular ao tubo cónico de 15 ml26.</li>
	<li>Enxaguar o poço com 1 mL de meio cardiomiócito fresco para coletar quaisquer CMs residuais de hiPSC e adicioná-los ao tubo cônico de 15 mL. Levar o volume final do tubo cônico para 15 mL.</li>
	<li>Centrífuga por 5 min (200 × g). Remova o sobrenadante até a marca de 1 mL. Ressuspender as células em meio cardiomiócito até um volume final de 5 mL.</li>
	<li>Conte os hiPSC-CMs com um contador de células manual ou automatizado.</li>
	<li>Incubar a suspensão hiPSC-CM à temperatura ambiente enquanto os substratos flexíveis de hidrogel estão a ser preparados (máximo de 30 minutos).</li>
</ol>4. Preparação dos substratos flexíveis de hidrogel
<ol><li>Prepare uma pipeta de 20 μL ajustada a 1 μL, pontas de pipeta de 20 μL (por exemplo, 20 μL) e uma placa de fundo de vidro estéril de 48 poços. Certifique-se de que um cronômetro/temporizador esteja pronto antes de fabricar os substratos de hidrogel.</li>
	<li>No exaustor de cultura de tecidos estéreis, misture o substrato de hidrogel à base de ECM batendo suavemente no tubo e coloque-o imediatamente de volta no gelo.</li>
	<li>Em seguida, inicie o cronômetro / temporizador imediatamente antes que o primeiro substrato de hidrogel seja chapeado - este é o tempo zero.</li>
	<li>Pipeta 1 μL do substrato de hidrogel para cima e para baixo ~3x para arrefecer a ponta da pipeta. Aplicar ~1 μL do substrato de hidrogel não diluído horizontalmente no fundo de cada poço da placa de 48 poços (Figura 1C, Figura 2A e Figura 3A), segurando a pipeta em um ângulo de 45°. Chapear todos os substratos de hidrogel na mesma orientação em cada poço (Figura 2 e Figura 3) para auxiliar na identificação do substrato ao realizar os experimentos com ampliação de 40x 7,9,17,27. NOTA: Cada linha ~1 μL é um substrato de hidrogel (Figura 3). Normalmente, leva ~ 5 minutos para preparar 48 poços. O uso de um suporte de microplaca inclinado horizontalmente (por exemplo, 30°) pode permitir uma melhor visão do fundo do poço e do substrato de hidrogel. Certifique-se de percorrer todo o comprimento do poço (ou seja, da esquerda para a direita). Substratos curtos de hidrogel podem ser muito espessos, reduzindo assim a estabilidade do substrato. Não deixe secar o substrato de hidrogel na ponta da pipeta. Se isso ocorrer, alterne rapidamente para uma nova dica e continue imediatamente. Alternativamente, pontas de pipeta refrigeradas podem ser usadas. O substrato de hidrogel à base de ECM pode polimerizar rapidamente quando não está no gelo. A preparação de vários poços ao mesmo tempo (por exemplo, 10) é sugerida. Além disso, recomenda-se praticar em uma placa simulada de 48 poços.</li>
	<li>Coloque a tampa na placa de 48 poços e deixe que os substratos de hidrogel incubem por 8-10 min à temperatura ambiente no exaustor de cultura de tecidos estéreis antes de adicionar as células (Figura 2B). NOTA: É importante aderir aos tempos de incubação sugeridos. Um tempo de incubação de mais de 10 min levará a substratos rígidos de hidrogel e sem contrações visíveis. Um tempo de incubação inferior a 8 min pode levar a substratos que colapsam.</li>
	<li>Semer imediatamente os hiPSC-CMs gota a gota diretamente sobre os substratos de hidrogel, com ~30.000 hiPSC-CMs viáveis por poço em um baixo volume médio de ~200 μL de meio cardiomiócito, utilizando uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2B e Figura 3B). NOTA: Este processo interrompe a polimerização do substrato de hidrogel e garante que os CM-hiPSC estejam no substrato 7,9,17,27.</li>
	<li>Coloque a tampa na placa e permita que os hiPSC-CMs incubem sem serem perturbados por 10-15 min à temperatura ambiente (Figura 2C) no exaustor de cultura de tecidos estéreis para permitir que os hiPSC-CMs adiram ao substrato de hidrogel.</li>
	<li>Adicione suavemente ~100 μL de meio de cardiomiócito fresco a cada poço (volume final: ~300 μL por poço). Coloque a tampa na placa e transfira para uma incubadora a 37 °C, 5% de CO 2 por2-4 dias. Atualize o meio 100% a cada 24 horas antes que os experimentos de contração sejam realizados. NOTA: Inspecione visualmente os hiPSC-CMs para a morfologia correta; imediatamente após o plaqueamento, os CM-hiPSC devem aparecer redondos (Figura 3B). No dia 2 após a semeadura, um sincício de monocamada 2D hiPSC-CM confluente será observado (Figura 3C) (Vídeo Suplementar S1) com contração visível robusta (Vídeo Suplementar S2).</li>
</ol>5. Registro e análise da contração
<ol><li>Preparar o meio de ensaio CCM, que é a solução de Tyrode, contendo os seguintes (em mmol/L): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glucose 10 e HEPES 10, com o pH ajustado para 7,4 com NaOH, e equilibrar a 37 °C em banho-maria. NOTA: O cálcio extracelular submáximo (0,5 mM) é usado para melhorar a janela de ensaio CCM.</li>
	<li>Ligue o microscópio e a câmara de controle ambiental para equilibrar a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Remova o meio cardiomiócito da placa de 48 poços e lave suavemente cada poço duas vezes com 600 μL de meio de ensaio CCM.</li>
	<li>Adicione 300 μL de meio de ensaio CCM por poço e coloque a placa de 48 poços no microscópio na câmara de controle ambiental. Insira os eletrodos e equilibre as células por 5 min.</li>
	<li>Use microscopia baseada em vídeo para gravar os vídeos de contração. Abra o software de gravação de vídeo e defina uma taxa de quadros de 100 quadros/s. Selecione uma região de interesse (ROI) perto do centro da monocamada hiPSC-CM. NOTA: Não selecione um ROI perto da borda das monocamadas hiPSC-CM, pois isso pode ser instável para gravações contráteis.</li>
	<li>Em seguida, o campo estimula as células com um gerador de pulso comercial (Tabela de Materiais) para acelerar eletricamente as monocamadas hiPSC-CM 2D. Acelere os CMs hiPSC no limiar de 1,5x a 1 Hz com parâmetros de pulso basais (por exemplo, pulsos monofásicos de estimulação de onda quadrada com uma duração de pulso de estímulo de 2 ms de ~14 V/cm)17.</li>
	<li>Grave o vídeo de contração da linha de base, com apenas o ritmo (ou seja, antes do CCM) (Figura 1D) para um mínimo de cinco batidas17,28.</li>
	<li>Em seguida, estimule a monocamada hiPSC-CM com um sinal elétrico experimental (Figura 1D). Para seguir esse protocolo, use os parâmetros padrão de estimulação CCM: dois pulsos bifásicos simétricos de 5,14 ms de duração de fase (duração total de 20,56 ms), ~28 V/cm (amplitude de fase), intervalo interfásico zero e um atraso de 30 ms (ou seja, tempo desde o final do pulso de estimulação até o início do pulso CCM) (Figura 1D)29,30 e grave o vídeo de contração induzida por CCM por um mínimo de cinco batidas.</li>
	<li>Desligue o sinal CCM, estimule com um pulso de estimulação basal e grave um vídeo de contração do período de recuperação (ou seja, após o CCM) por um mínimo de cinco batimentos.</li>
	<li>Use um software de contração padrão para analisar automaticamente os vídeos de contração e quantificar as principais propriedades contráteis (por exemplo, a amplitude de contração, a inclinação de contração, a inclinação de relaxamento, o tempo até o pico, o tempo até a linha de base de 90% e a duração da contração de 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Use os hiPSC-CMs 2D no substrato de hidrogel flexível para experimentos contráteis dos dias 2 a 14 após o revestimento no substrato.</li>
</ol>

Este artigo reflete os pontos de vista dos autores e não deve ser interpretado para representar os pontos de vista ou políticas da Food and Drug Administration dos EUA. A menção de produtos comerciais, suas fontes ou seu uso em conexão com o material aqui relatado não deve ser interpretada como um endosso real ou implícito de tais produtos pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos. Os autores declaram não haver interesses concorrentes para este trabalho.

O protocolo aqui descrito descreve um método para gerar monocamadas de hiPSC-CM 2D de contração robusta em um substrato de hidrogel flexível à base de matriz extracelular (ECM) com reagentes comerciais 7,17. Os CM-hiPSC semeados no substrato de hidrogel flexível permanecem viáveis e têm propriedades contráteis aumentadas7. Essa técnica baseia-se em equipamentos e capacidades laboratoriais padrão7. Existem várias etapas críticas no protocolo, inclusive em relação ao trabalho com o substrato de hidrogel à base de ECM, que exigem atenção cuidadosa aos detalhes. Um problema potencial é a presença de soro no meio. Isso pode resultar na formação de redes hiPSC-CMs (por exemplo, redes endoteliais/vasculares) em vez de uma folha monocamada confluente; portanto, um meio livre de soro é recomendado durante o estabelecimento das monocamadas flexíveis de hidrogel hiPSC-CM (ou seja, dia 0 a dia 4). Da mesma forma, a preparação de muitos substratos de hidrogel de uma só vez pode resultar em substratos pobres ou irregulares devido à fadiga do operador. Embora seja importante trabalhar rapidamente, a integridade de cada substrato de hidrogel é crítica. Da mesma forma, deve-se semear cuidadosamente os hiPSC-CMs e mudar o meio; isso não deve ser feito com força. Ao mudar o meio, ele deve ser adicionado suavemente a partir da borda superior do poço para não perturbar o substrato de hidrogel ou as células. Tal como acontece com as culturas hiPSC-CM 2D padrão (ou seja, plástico ou vidro de cultura de tecidos convencionais), o revestimento a uma baixa densidade resultará na formação incompleta de monocamadas. É importante inspecionar visualmente os hiPSC-CMs para confirmar que eles estão no substrato de hidrogel e usar um temporizador para garantir um tempo preciso. Além disso, a cultura das monocamadas 2D hiPSC-CM por mais de 14 dias no substrato de hidrogel pode resultar em ruptura da monocamada, com base nas propriedades da ECM e nas instruções do fabricante do substrato.
Existem várias limitações para o método atual que devem ser consideradas. Primeiro, as células usadas neste protocolo eram de um provedor comercial de hiPSC-CMs, e essas células formam um sincício de células eletricamente acopladas. O sincício contém uma mistura de CM-hiPSC de todos os três subtipos cardíacos (ou seja, ventricular, atrial e nodal)17. Os estudos podem se beneficiar de uma população de CM-HC exclusiva do subtipo (ou seja, 100% ventricular ou 100% atrial). Em segundo lugar, esse método utilizou apenas hiPSC-CMs, enquanto os não-miócitos, incluindo fibroblastos cardíacos, células endoteliais e neurônios, podem melhorar a funcionalidade do hiPSC-CM22,36. Em terceiro lugar, os CME-hiPSC 2D apresentam várias características de cardiomiócitos relativamente imaturos, incluindo batimento espontâneo, morfologia amorfa e falta de resposta inotrópica 8,37. Em quarto lugar, embora esse protocolo produza monocamadas 2D hiPSC-CM de contração robusta, é provável que modelos de hiPSC-CM 3D funcionalmente aprimorados, como tecidos cardíacos modificados (ECTs), resultem em uma resposta contrátil induzida por CCM aprimorada sob concentrações fisiológicas de cálcio 8,38. Finalmente, o protocolo descrito aqui é projetado para um formato de 48 poços. No entanto, com a otimização e a inclusão da automação, isso pode ser dimensionado para um formato de alto rendimento (por exemplo, placas de 96 poços ou 384 poços).
O padrão-ouro atual para estudos de hiPSC-CM são as condições convencionais de cultura 2D rígida (ou seja, plástico ou vidro de cultura de tecidos). Embora útil para estudos de eletrofisiologia3 e manuseio de cálcio39, a metodologia convencional resulta em propriedades contráteis mínimas 5,6,7. Como resultado, as condições convencionais de cultura 2D rígida não são passíveis de avaliação dos efeitos contráteis da MCC8. Osmétodos 38 3D hiPSC-CM ECT funcionalmente aprimorados são tecnicamente desafiadores, demorados e exigem equipamentos sofisticados que não estão prontamente disponíveis em todos os laboratórios. Neste protocolo, descrevemos uma metodologia simples para gerar monocamadas 2D hiPSC-CM de contração robusta em um período de tempo mais curto do que os métodos ECT 3D ou métodos 2D convencionais de longo prazo 7,40,41. Além disso, os reagentes aqui utilizados estão comercialmente disponíveis, incluindo o substrato de hidrogel e os CMs hiPSC, e ambos têm considerável consistência lot-a-lote. Enquanto utilizamos eletrodos de fio de platina removíveis (distância entre eletrodos: 2,0 mm, largura: 1,0 mm), vários materiais e configurações de eletrodos são passíveis de avaliações contráteis de CCM in vitro 8,15,17,18,22. Da mesma forma, existem vários softwares automatizados disponíveis que permitem a análise de vídeos de contração 7,31,32.
A maioria dos métodos não clínicos para avaliar a contratilidade de dispositivos médicos cardíacos depende em grande parte de modelos animais in vivo dispendiosos (por exemplo, cães ou porcos) e tiras musculares papilares tecnicamente desafiadoras (por exemplo, coelhos)18. Este trabalho descreveu um modelo in vitro humano para avaliar os efeitos dos sinais de dispositivos médicos de eletrofisiologia cardíaca sobre a contratilidade. Esta ferramenta poderia reduzir a dependência de estudos em animais e ser útil para a avaliação in vitro das propriedades contráteis de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.

À medida que a população dos Estados Unidos envelhece, o número de pacientes com insuficiência cardíaca continua a aumentar, juntamente com os custos médicos diretos 1,2. Há uma necessidade crítica de desenvolver novas terapias para tratar a insuficiência cardíaca e metodologias não clínicas inovadoras para testar tais terapias. Cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) têm sido propostos como uma ferramenta in vitro para auxiliar o processo de desenvolvimento terapêutico e têm sido utilizados em submissões regulatórias 3,4. No entanto, seu uso generalizado tem sido limitado para estudos de contratilidade devido à falta de propriedades contráteis robustas quando banhadas em condições de cultura 2D rígidas padrão (ou seja, plástico ou vidro convencional de cultura de tecidos)5,6,7,8. Demonstramos anteriormente a utilidade do revestimento isolado de hiPSC-CMs isolados em um substrato de hidrogel flexível para gerar propriedades contráteis visíveis robustas9. Mostramos que os CM-hiPSC isolados têm propriedades contráteis comparáveis às dos cardiomiócitos ventriculares adultos recém-isolados. Além disso, demonstramos a utilidade desse método para avaliar as respostas contráteis aos agentes farmacológicos7. Além disso, outros estudos têm aplicado essa tecnologia a avaliações mecanicistas para a ciência básica e modelagem de doenças10,11,12. Aqui, essa metodologia foi estendida para monocamadas 2D hiPSC-CM, e sua utilidade na avaliação de sinais elétricos de dispositivos médicos fisiologicamente relevantes para a modulação da contratilidade cardíaca (CCM) in vitro é demonstrada.
A MCC é uma terapia de insuficiência cardíaca intracardíaca na qual sinais eletrofisiológicos não excitatórios são entregues ao miocárdio durante o período refratário absoluto do ciclo cardíaco13,14. Faltam métodos reprodutíveis para avaliar a MCC em modelos de células cardíacas humanas. Trabalhos anteriores empregaram vários modelos de células cardíacas para avaliar a resposta contrátil da MCC. Demonstramos in vitro que cardiomiócitos ventriculares de coelho recém-isolados respondem à estimulação da MCC por um aumento transitório do cálcio e amplitude de contração15. Outro estudo em cardiomiócitos ventriculares caninos isolados demonstrou realce induzido por CCM da amplitude transitória intracelular do cálcio16. No entanto, a maioria dos estudos de CCM utilizou preparações animais ex vivo e in vivo. Esses estudos são difíceis de correlacionar entre si, pois aplicam uma variedade de parâmetros de pulso CCM e espécies17. Um estudo em um modelo papilar isolado de coelho revelou aumento da contratilidade induzida por CCM8,18, e uma série de estudos cardíacos inteiros demonstraram aumento da função contrátil induzida por CCM19,20,21. Esses estudos forneceram uma importante visão mecanicista. No entanto, há uma falta de modelos humanos reprodutíveis para estudos contráteis de EP cardíaca in vitro, incluindo CCM. Para esse fim, desenvolvemos vários modelos hiPSC 2D e 3D e demonstramos o aprimoramento induzido por CCM das propriedades contráteis de maneira dependente de parâmetros. Além disso, verificou-se que os efeitos inotrópicos induzidos pela MCC são, em parte, mediados pela entrada neuronal e pela sinalização β-adrenérgica 8,17,22. Ainda assim, mais precisa ser conhecido sobre os mecanismos da terapia CCM, e a utilização de cardiomiócitos humanos em contração pode ajudar a alcançar esse resultado. Como tal, há uma necessidade significativa de desenvolver ferramentas humanas não clínicas para avaliar novos dispositivos e sinais de CCM, acelerar o processo regulatório, reduzir a carga sobre os modelos animais e auxiliar a tomada de decisão do desenvolvedor de dispositivos 8,17,23,24. É importante desenvolver protocolos fáceis, do tipo "faça você mesmo", que possam ser transferidos para qualquer laboratório e que usem equipamentos padrão e baixos requisitos de células para reduzir os custos. Esse método elucida os efeitos da estimulação da MCC na função dos cardiomiócitos humanos e fornece informações importantes sobre a segurança ou a efetividade da MCC17. Aqui, descrevemos o método para gerar monocamadas 2D hiPSC-CM em um substrato de hidrogel flexível para produzir uma ferramenta não clínica padronizada para quantificar as respostas contráteis do dispositivo médico de eletrofisiologia cardíaca aguda (ou seja, CCM) em saúde e doença.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) estão atualmente sendo explorados para múltiplas aplicações in vitro e têm sido usados em submissões regulatórias. Aqui, estendemos seu uso para avaliações de segurança ou desempenho de dispositivos médicos cardíacos. Desenvolvemos um novo método para avaliar as propriedades contráteis de dispositivos médicos cardíacos em monocamadas de hiPSC-CMs 2D de contração robusta revestidas em um substrato de hidrogel à base de matriz extracelular flexível (ECM). Essa ferramenta permite a quantificação dos efeitos dos sinais de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca na função cardíaca humana (por exemplo, propriedades contráteis) com equipamento de laboratório padrão. As monocamadas 2D hiPSC-CM foram cultivadas por 2-4 dias em substrato de hidrogel flexível em formato de 48 poços.
Os hiPSC-CMs foram expostos a sinais elétricos padrão de dispositivos médicos de modulação da contratilidade cardíaca (CCM) e comparados aos hiPSC-CMs de controle (ou seja, apenas de ritmo). As propriedades contráteis basais dos hiPSC-CMs 2D foram quantificadas por análise de detecção baseada em vídeo com base no deslocamento de pixels. Os CMs 2D hiPSC-CMs estimulados por CCM banhados no substrato flexível de hidrogel apresentaram propriedades contráteis significativamente aumentadas em relação à linha de base (ou seja, antes da estimulação com CCM), incluindo um aumento da amplitude de contração de pico e cinética de contração e relaxamento acelerados. Além disso, a utilização do substrato de hidrogel flexível permite a multiplexação das leituras de acoplamento de contração de excitação cardíaca baseadas em vídeo (ou seja, eletrofisiologia, manuseio de cálcio e contração) em CMs-hiPSC saudáveis e doentes. A detecção e quantificação precisas dos efeitos dos sinais eletrofisiológicos cardíacos na contração cardíaca humana é vital para o desenvolvimento, otimização e redução do risco de dispositivos médicos cardíacos. Este método permite a visualização e quantificação robustas das propriedades contráteis do sincício cardíaco, que devem ser valiosas para testes de segurança ou eficácia de dispositivos médicos cardíacos não clínicos. Este artigo descreve, em detalhes, a metodologia para gerar monocamadas de substrato de hidrogel 2D hiPSC-CM.

Descrito neste protocolo é uma ferramenta simples e robusta para gerar monocamadas hiPSC-CM 2D visivelmente contraídas em um substrato de hidrogel flexível. A medição das propriedades contráteis é realizada com gravação baseada em vídeo, juntamente com software de análise de contratilidade. Isso permite a quantificação de parâmetros-chave da contratilidade dos cardiomiócitos, incluindo a amplitude de contração, a inclinação de contração, a inclinação de relaxamento, o tempo de pico, o tempo até a linha de base de 90% e a duração da contração de 50%. O modelo é usado para caracterizar as propriedades contráteis basais dos CM-hiPSC (Figura 4) de vários doadores "saudáveis" e pode ser estendido à avaliação de sinais de dispositivos médicos de eletrofisiologia cardíaca (ou seja, CCM). A aplicação dos parâmetros padrão de estimulação da MCC (Figura 1D)29,30 resultou em propriedades contráteis aumentadas in vitro (Figura 5 e Tabela 1)17.
Demonstramos ainda que esse método pode ser utilizado para avaliar os efeitos da modulação das concentrações extracelulares de cálcio sobre as propriedades contráteis humanas com e sem estimulação CCM (Figura 6)17. A dependência basal esperada de cálcio da contração foi observada 7,17, bem como um aumento da sensibilidade ao cálcio induzido por CCM ao nível da monocamada de cardiomiócitos. Além disso, o interrogatório farmacológico da via de sinalização β-adrenérgica (Figura 7) revelou que os efeitos inotrópicos induzidos por CCM foram, em parte, mediados pela sinalização β-adrenérgica17. Além disso, essa ferramenta pode ser expandida para cardiomiócitos de doença específica do paciente, incluindo os de cardiomiopatia dilatada (DCM)33,34,35 (Figura 8), para compreender o efeito da MCC no contexto dos estados de doença; de fato, amplitude contrátil aumentada e cinética acelerada de contração e relaxamento foram observadas na "dose" de CCM testada aqui (Figura 8). Embora tenhamos um dispositivo de imitação de CCM em nosso laboratório, a metodologia usada aqui não é específica para esse sistema e poderia ser aplicada a outros dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Figura 1: Resumo esquemático do modelo 2D hiPSC-CM in vitro CCM. (A) Os CMs hiPSC são pré-banhados em formato monocamada em placas de 6 poços revestidas com gelatina (0,1%). (B) Após 2 dias em cultura, os CM-hiPSC são dissociados e preparados para revestimento em substrato de hidrogel flexível. (C) Os CMs hiPSC-isolados são revestidos a uma alta densidade em substratos de hidrogel dispostos em um formato de 48 poços (à esquerda) e são ensaiados em solução extracelular de Tyrode de cálcio (0,5 mM) (à direita). (D) Um gerador de pulso comercial e parâmetros de pulso CCM clínicos padrão29,30 (à direita) são usados para estimular os CM-hiPSC; a função cardíaca é avaliada por videoanálise (esquerda). (E) Registros representativos de contração antes da MCC (linha de base: 5 V), durante a MCC (MCC: 10 V) e após a MCC (recuperação: 5 V). Essa figura foi reimpressa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; CCM = modulação da contratilidade cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Figura 2: Esquema do revestimento e semeadura do substrato de hidrogel flexível. (A) Substrato de hidrogel à base de ECM completamente descongelado e não diluído é aplicado a uma placa estéril de 48 poços (painel esquerdo), com 1 μL de substrato de hidrogel por poço (painel direito). (B) O substrato de hidrogel é deixado incubar à temperatura ambiente por 8-10 min (painel direito), seguido de chapeamento dos hiPSC-CMs de alta densidade em um baixo volume médio (~200 μL) (painel esquerdo). (C) Após 10-15 min de incubação, o meio é adicionado a cada poço (painel esquerdo), e as placas são movidas para uma incubadora de cultura de tecidos padrão (painel direito). Abreviaturas: ECM = matriz extracelular, hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Figura 3: Substrato de hidrogel à base de matriz extracelular. (A) Substrato de hidrogel representativo (sem células) em um poço de uma placa de fundo de vidro de 48 poços imediatamente após o substrato ser aplicado ao poço. (B) Tempo 0 após a semeadura dos CM-hiPSC. (C) Tempo 24 h após a semeadura dos CM-hiPSC. Este painel foi reimpresso de Feaster et al.17. As setas brancas indicam a borda do substrato de hidrogel, ampliação de 4x. Barra de escala = 1 mm. Abreviação: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Figura 4: Caracterização das propriedades contráteis da monocamada 2D hiPSC-CM. (A) Registro representativo da contração dos CMs hiPSC-CM 2D em ritmo de 1 Hz (5 V). (B) Traços de contração representativos representando um ciclo de contração. (C) Gráficos de barras de resumo. Os dados são médios ± EPM. n = 18. Abreviação: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Figura 5: Efeito agudo da MCC sobre as propriedades contráteis do CM-HC 2D. (A) Registro representativo da contração para antes da MCC (5 V), durante a MCC (10 V) e após a MCC (5 V). (B) Traços representativos de contração dos efeitos imediatos (ou seja, última batida antes da CCM, primeira batida da CCM e primeira batida pós-CCM, indicada por +). (C) Gráficos de barras de resumo dos efeitos imediatos. Variação percentual, os dados são médios ± MEV. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Essa figura foi reimpressa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; CCM = modulação da contratilidade cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Figura 6: Efeito da modulação extracelular do cálcio na resposta do MCC. (A) Traços representativos de contração dos efeitos imediatos para cada grupo antes do MCC (5 V), durante o MCC (10 V) e após o MCC (5 V); os CM-hiPSC foram expostos a concentrações crescentes de cálcio extracelular (Cao) de 0,25-2 mM. (B-D) Dados transformados (sigmoidais) para guiar o olho demonstrando o efeito da MCC na sensibilidade ao cálcio das propriedades contráteis (ou seja, a amplitude e cinética) (inclinação da colina = 1,0). n = 6-8 por grupo. Essa figura foi reimpressa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; CCM = modulação da contratilidade cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Figura 7: Desafio farmacológico. Traços de contração representativos para cada grupo antes da MCC (5 V), durante a MCC (10 V) e após a MCC (5V); os CM-hiPSC foram pré-tratados com veículo (A) ou (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Gráficos de barras de resumo para cada condição. Variação percentual, os dados são médios ± MEV. n = 10 por grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Essa figura foi reimpressa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; CCM = modulação da contratilidade cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Figura 8: Efeito agudo da CCM nas propriedades contráteis de CMCs hiPSC 2D doentes. (A) Traço de contração representativo para DCM L35P, linha de base de controle (antes, 6 V) e DCM L35P mais CCM (10 V). (B) Gráficos de barras de resumo. Variação percentual, os dados são médios ± MEV. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; CCM = modulação da contratilidade cardíaca; DCM = cardiomiopatia dilatada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo Suplementar S1: Timelapse dos hiPSC-CMs no hidrogel à base de matriz extracelular. HiPSC-CMs bidimensionais banhados sobre o substrato de hidrogel flexível; Tempo: 0-90 h; um poço de uma placa de fundo de vidro de 48 poços; Ampliação de 4x. Os hiPSC-CMs formam um sincício horizontal de monocamada (ou seja, da esquerda para a direita). Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar S2: hiPSC-CMs no hidrogel à base de matriz extracelular. HiPSC-CMs bidimensionais banhados sobre o substrato de hidrogel flexível; Tempo: ~24 h; um poço de uma placa de fundo de vidro de 48 poços; Ampliação de 4x. Os CMs hiPSC formam morfologia monocamada e apresentam contração robusta em ~24 h pós-plaqueamento. Barra de escala = 1 mm. Este vídeo é de Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parâmetro</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Depois</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tempo para o pico 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tempo para o pico 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tempo até a linha de base 50%</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Tempo até a linha de base 90%</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Duração da contração 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Duração da contração 50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Duração da contração 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Propriedades contráteis. Variação percentual em relação a antes do CCM (5 V); os dados são médios ± MEV para todos os batimentos em cada grupo durante a MCC (10 V) e após a MCC (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Esta tabela foi reimpressa de Feaster et al.17.

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Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Aqui, demonstramos um método de avaliação da contratilidade de dispositivos médicos cardíacos não invasivos usando monocamadas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D (hiPSC-CM), banhadas em um substrato flexível, juntamente com microscopia baseada em vídeo. Esta ferramenta será útil para a avaliação in vitro das propriedades contráteis de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.

Avaliação da Terapia de Modulação da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Humanas 2D

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

O Escritório de Laboratórios de Ciência e Engenharia da FDA está desenvolvendo ferramentas científicas regulatórias para ajudar os desenvolvedores de dispositivos médicos e revisores da FDA. Nosso objetivo final é acelerar o acesso do paciente a dispositivos médicos inovadores, seguros e eficazes por meio da melhor ciência disponível. Neste protocolo, aplicamos tecnologia de ponta de células-tronco pluripotentes induzidas na avaliação de dispositivos médicos que são usados para tratar condições cardíacas potencialmente fatais.Esta ferramenta simples permite a avaliação reprodutível de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca na placa usando equipamento padrão de laboratório. Ele também pode ser usado com células específicas do paciente derivadas de doadores com várias doenças cardíacas. Para começar, plaqueie os cardiomiócitos humanos derivados de iPSC descongelados em placas estéreis de seis poços revestidas com gelatina a 0,1% pelo menos dois dias antes da semeadura dos cardiomiócitos no substrato hidrogel flexível.Cultive os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos em meio cardiomiócito padrão por dois a quatro dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que eles se recuperassem da criopreservação. Refrescar o meio gasto com meio 100% cardiomiócito a cada 48 horas. Verifique o estado dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana antes da dissociação, avaliando a saúde das células, garantindo a viabilidade e o batimento estável.Lave os cardiomiócitos com quatro mililitros por poço de DPBS sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. Adicione um mililitro de reagente de dissociação da temperatura ambiente a cada poço e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio cardiomiócito a um tubo cônico estéril de 15 mililitros.Dissociar os cardiomiócitos das placas de seis poços com uma pipeta de 1.000 microlitros e adicionar a suspensão celular ao tubo cônico. Lave os poços com um mililitro de meio cardiomiócito fresco para coletar quaisquer cardiomiócitos residuais e adicione-os ao tubo cônico. Em seguida, traga o volume final do tubo cônico para 15 mililitros com o meio.Centrifugar o tubo a 200 G por cinco minutos e remover o sobrenadante até a marca de um mililitro. Ressuspender as células no meio cardiomiócito até um volume final de cinco mililitros e contar os cardiomiócitos com um contador celular manual ou automatizado. Em seguida, incubar a suspensão de células de cardiomiócitos por cerca de 30 minutos à temperatura ambiente enquanto os substratos flexíveis de hidrogel são preparados.Prepare uma pipeta de 20 microlitros ajustada em um microlitro, pontas de pipeta, uma placa de fundo de vidro estéril de 48 poços e um temporizador de cronômetro no capuz de cultura de tecidos. Misture a matriz extracelular ou o substrato de hidrogel à base de ECM, batendo suavemente no tubo e colocando-o imediatamente de volta no gelo. Inicie o cronômetro imediatamente antes de chapear o primeiro substrato de hidrogel e marque-o como tempo zero.Pipetar um microlitro do substrato de hidrogel para cima e para baixo aproximadamente três vezes para arrefecer a ponta da pipeta. Em seguida, aplique aproximadamente um microlitro do substrato de hidrogel não diluído horizontalmente no fundo de cada poço na placa de 48 poços, segurando a pipeta em um ângulo de 45 graus. Chapear todos os substratos de hidrogel na mesma orientação em cada poço para ajudar a identificar o substrato ao realizar os experimentos com ampliação de 40X.Coloque a tampa na placa de 48 poços e deixe os substratos de hidrogel incubarem por oito a 10 minutos à temperatura ambiente na capela de cultura de tecidos antes de adicionar as células. Após a incubação, semear imediatamente os cardiomiócitos diretamente nos substratos do hidrogel com aproximadamente 30.000 cardiomiócitos viáveis por poço em um volume médio baixo de aproximadamente 200 microlitros de meio cardiomiócito. Após o fechamento da pálpebra, deixe os cardiomiócitos incubarem sem serem perturbados por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente no capô para permitir que as células adiram ao substrato do hidrogel.Adicione suavemente 100 microlitros de meio cardiomiócito fresco a cada poço. Coloque a tampa fechada em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias. Ligue o microscópio e a câmara de controle ambiental para equilibrar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Remova o meio cardiomiócito da placa de 48 poços e lave suavemente cada poço duas vezes com 600 microlitros da modulação da contratilidade cardíaca ou meio de ensaio CCM. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio de ensaio CCM por poço e coloque a placa de 48 poços no microscópio na câmara de controle ambiental. Insira os eletrodos e equilibre as células por cinco minutos.Para gravar os vídeos de contração usando microscopia baseada em vídeo, abra o software de gravação de vídeo e defina uma taxa de quadros de 100 quadros por segundo. Em seguida, selecione uma região de interesse ou ROI perto do centro da monocamada hiPSC-CM. Em seguida, o campo estimula as células com um gerador de pulso comercial para acelerar eletricamente as monocamadas de cardiomiócitos 2D.Coloque o cardiomiócito no limiar de 1,5 vezes um hertz com os parâmetros basais de pulso. Por exemplo, pulsos monofásicos de onda quadrada com uma duração de pulso de estímulo de dois milissegundos de cinco volts. Grave o vídeo de contração apenas do ritmo de linha de base antes do CCM por um mínimo de cinco batidas.Em seguida, estimular a monocamada de cardiomiócitos com um sinal elétrico experimental de 30 milissegundos de atraso, dois pulsos bifásicos simétricos de 5,14 milissegundos de duração de fase, com duração total de 20,56 milissegundos, amplitude de fase de 10 volts e intervalo interfásico zero. Grave o vídeo de contração induzida por CCM por um mínimo de cinco batimentos. Desligue o sinal CCM, estimule com um pulso de estimulação basal e grave um vídeo de contração do período de recuperação após o CCM por um mínimo de cinco batimentos.Use um software de contração padrão para analisar os vídeos de contração automaticamente e quantificar as principais propriedades contráteis, como amplitude de contração, inclinação de contração, inclinação de relaxamento, tempo para pico, tempo para a linha de base 90% e duração da contração 50%As propriedades contratuais da monocamada de cardiomiócitos derivadas da iPSC humana 2D foram caracterizadas e os parâmetros-chave da contratilidade dos cardiomiócitos foram quantificados. A aplicação dos parâmetros padrão de estimulação da CCM resultou em propriedades contráteis melhoradas in vitro. Os efeitos da modulação das concentrações de cálcio extracelular sobre as propriedades contráteis humanas com e sem estimulação da CMC foram avaliados.A dependência basal esperada de cálcio da contração foi observada, bem como um aumento induzido por CCM na sensibilidade ao cálcio ao nível da monocamada de cardiomiócitos. Além disso, o interrogatório farmacológico da via de sinalização betaandrogênica revelou que os efeitos inotrópicos induzidos por CCM foram, em parte, mediados pela sinalização beta adrenérgica. Além disso, essa ferramenta pode ser expandida para cardiomiócitos de doenças específicas do paciente, incluindo aqueles de cardiomiopatia dilatada para entender o efeito da CCM no contexto de estados de doença.Aqui, nos concentramos principalmente na avaliação das propriedades contráteis humanas. No entanto, usando essa ferramenta, pode-se também avaliar outras leituras de acoplamento de contração de excitação cardíaca, incluindo potenciais de ação e manuseio de cálcio. Esta é a primeira ferramenta científica regulatória a combinar células-tronco pluripotentes induzidas por tecnologia com avaliação de dispositivos cardíacos.Este método alternativo abre caminho para que os dispositivos médicos sejam avaliados em um prato e tem o potencial de reduzir a necessidade de testes em animais e seres humanos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Bioengenharia

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Reconstruções anatômicas do sistema venoso cardíaco humano usando contraste Tomografia computadorizada de Amostras de perfusão-fixados

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Choque aplicação de ondas de culturas de células

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...