Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана назначением в Программу участия в исследованиях в Центре устройств и радиологического здоровья, управляемую Институтом науки и образования Ок-Ридж в рамках межведомственного соглашения между Министерством энергетики США и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Авторы благодарят Ричарда Грея, Трента Робертсона и Анну Авилу за их предложения и техническую помощь. Исследование финансировалось Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, Управлением научных и инженерных лабораторий.

1. Подготовка плит и сред
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная аликвота гидрогеля на основе внеклеточного матрикса (ECM) составляет ~ 200 мкл в стерильной пробирке объемом 1,5 мл, хранящейся при -20 ° C.
<ol><li>В стерильном вытяжном шкафу для культивирования тканей подготовьте стерильную 6-луночную пластину, переложив в каждую лунку 2 мл 0,1% желатина (таблица материалов). Накройте крышкой 6-луночную пластину и дайте пластине с покрытием инкубироваться при 37 °C в течение как минимум 1 часа.</li>
	<li>За день до посева hiPSC-CM на гибкую гидрогелевую подложку разморозьте аликвоту гидрогеля (Таблица материалов) в холодильнике на льду.</li>
	<li>Подготовьте кардиомиоцитарную среду (Таблица материалов), смешав 500 мл RPMI 1640, 10 мл добавки 50x B-27 и 5 мл пенициллина-стрептомицина9.</li>
</ol>2. Посев криоконсервированных hiPSC-CM
<ol><li>За два дня до посева hiPSC-CM на гибкую гидрогелевую подложку предварительно наложите hiPSC-CM на 0,1% стерильные 6-луночные планшеты, покрытые желатином. Размораживайте hiPSC-CM, используя стандартный протокол размораживания 9,25.</li>
	<li>Затем нанесите 1 500 000 hiPSC-CM (Таблица материалов) на скважину в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1A)26.</li>
	<li>Культивируют hiPSC-CM в стандартной среде кардиомиоцитов в течение 2-4 дней, чтобы позволить hiPSC-CM восстановиться после криоконсервации при 37 ° C и 5% CO2. Обновляйте отработанную среду 100% кардиомиоцитарной средой каждые 48 ч.</li>
</ol>3. Диссоциация и подсчет предварительно нанесенных hiPSC-CM
<ol><li>Проверьте состояние hiPSC-CM перед диссоциацией. Оцените здоровье hiPSC-CM, обеспечив жизнеспособность и стабильное биение. ПРИМЕЧАНИЕ: Важна чистота популяции hiPSC-CM (например, >90% сердечного тропонина T)7. Метод отбора кардиомиоцитов (например, метаболический отбор или сортировка) рекомендуется для уменьшения разрушения гидрогелевого субстрата клетками, не относящимися к кардиомиоцитам25,26.</li>
	<li>Промойте hiPSC-CM 2x 4 мл на лунку D-PBS без CaCl 2 или MgCl2 (таблица материалов). Аспирируйте D-PBS, добавьте 1 мл реагента для диссоциации при комнатной температуре в каждую лунку, а затем инкубируйте в течение 15 мин при 37 ° C.</li>
	<li>Добавьте 10 мл среды кардиомиоцитов в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.</li>
	<li>Диссоциируйте hiPSC-CM от 6-луночной пластины с помощью пипетки объемом 1,000 мкл (рис. 1B). Добавьте клеточную суспензию в коническую пробирку26 объемом 15 мл.</li>
	<li>Промойте лунку 1 мл свежей среды кардиомиоцитов, чтобы собрать остатки hiPSC-CM, и добавьте их в коническую пробирку объемом 15 мл. Доведите конечный объем конической трубки до 15 мл.</li>
	<li>Центрифуга в течение 5 мин (200 × г). Удалите надосадочную жидкость до отметки 1 мл. Ресуспендируют клетки в среде кардиомиоцитов до конечного объема 5 мл.</li>
	<li>Подсчитайте hiPSC-CM с помощью ручного или автоматического счетчика ячеек.</li>
	<li>Инкубируйте суспензию hiPSC-CM при комнатной температуре, пока готовятся гибкие гидрогелевые субстраты (максимум 30 минут).</li>
</ol>4. Подготовка гибких гидрогелевых субстратов
<ol><li>Подготовьте пипетку объемом 20 мкл на 1 мкл, наконечники для пипеток объемом 20 мкл (например, 20 мкл) и стерильную стеклянную нижнюю пластину с 48 лунками. Убедитесь, что секундомер / таймер готов, прежде чем делать гидрогелевые подложки.</li>
	<li>В стерильном колпаке для культивирования тканей смешайте гидрогелевый субстрат на основе ECM, осторожно постукивая по пробирке, и немедленно поместите ее обратно на лед.</li>
	<li>Затем запустите секундомер / таймер непосредственно перед тем, как будет нанесена первая гидрогелевая подложка - это нулевое время.</li>
	<li>Пипетка 1 мкл гидрогелевой подложки вверх и вниз ~ 3x, чтобы охладить наконечник пипетки. Нанесите ~ 1 мкл неразбавленной гидрогелевой подложки горизонтально на дно каждой лунки 48-луночной пластины (рис. 1C, рис. 2A и рис. 3A), удерживая пипетку под углом 45°. Поместите все гидрогелевые субстраты в одинаковую ориентацию в каждой лунке (рис. 2 и рис. 3), чтобы помочь идентифицировать подложку при выполнении экспериментов при 40-кратном увеличении 7,9,17,27. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая линия ~ 1 мкл представляет собой один гидрогелевый субстрат (рис. 3). Как правило, на подготовку 48 лунок уходит ~5 минут. Использование горизонтально наклоненной подставки для микропланшетов (например, 30°) может обеспечить лучший обзор дна скважины и гидрогелевой подложки. Обязательно пройдите по всей длине колодца (т.е. слева направо). Короткие гидрогелевые субстраты могут быть слишком толстыми, что снижает стабильность подложки. Не допускайте высыхания гидрогелевого субстрата в наконечнике пипетки. Если это произошло, быстро переключитесь на новый совет и сразу же продолжите. В качестве альтернативы можно использовать охлажденные наконечники для пипеток. Гидрогелевая подложка на основе ECM может быстро полимеризоваться, когда она не находится на льду. Предлагается подготовка нескольких скважин одновременно (например, 10). Кроме того, рекомендуется практиковаться в макете 48-луночной пластины.</li>
	<li>Закройте крышку на 48-луночную пластину и дайте гидрогелевым субстратам инкубироваться в течение 8-10 минут при комнатной температуре в стерильном колпаке для культивирования тканей перед добавлением клеток (рис. 2B). ПРИМЕЧАНИЕ: Важно придерживаться рекомендуемого времени инкубации. Время инкубации более 10 минут приведет к образованию жестких гидрогелевых субстратов и отсутствию видимых сокращений. Время инкубации менее 8 минут может привести к разрушению субстратов.</li>
	<li>Немедленно посейте hiPSC-CM по каплям непосредственно на гидрогелевые субстраты, с ~ 30 000 жизнеспособных hiPSC-CM на лунку в низком среднем объеме ~ 200 мкл среды кардиомиоцитов, используя пипетку объемом 1000 мкл (рис. 2B и рис. 3B). ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс останавливает полимеризацию гидрогелевого субстрата и обеспечивает нахождение hiPSC-CM на подложке 7,9,17,27.</li>
	<li>Поместите крышку на тарелку и дайте hiPSC-CM инкубироваться в течение 10-15 минут при комнатной температуре (рис. 2C) в стерильном колпаке для культивирования тканей, чтобы hiPSC-CM могли прилипать к гидрогелевому субстрату.</li>
	<li>Аккуратно добавьте ~ 100 мкл свежей среды кардиомиоцитов в каждую лунку (конечный объем: ~ 300 мкл на лунку). Накройте тарелку крышкой и переложите в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 на 2-4 дня. Обновляйте 100% среду каждые 24 часа перед проведением экспериментов по сокращению. ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите hiPSC-CM на предмет правильной морфологии; сразу после нанесения покрытия hiPSC-CM должны казаться круглыми (рис. 3B). Ко 2-му дню после посева будет наблюдаться сливающийся 2D монослойный синцитий hiPSC-CM (рис. 3C) (дополнительное видео S1) с сильным видимым сокращением (дополнительное видео S2).</li>
</ol>5. Регистрация и анализ сокращений
<ol><li>Приготовьте среду для анализа МНЛЗ, которая представляет собой раствор Тирода, содержащий следующие вещества (в ммоль/л): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, глюкозу 10 и HEPES 10, при этом рН доводят до 7,4 с NaOH и уравновешивают до 37 °C на водяной бане. ПРИМЕЧАНИЕ: Субмаксимальный внеклеточный кальций (0,5 мМ) используется для расширения окна анализа CCM.</li>
	<li>Включите микроскоп и камеру контроля окружающей среды, чтобы уравновесить температуру до 37 °C и 5% CO2.</li>
	<li>Удалите кардиомиоцитарную среду из 48-луночной пластины и осторожно промойте каждую лунку дважды 600 мкл среды для анализа CCM.</li>
	<li>Добавьте 300 мкл проанализирующей среды МНЛЗ на лунку и поместите 48-луночную пластину на микроскоп в камеру контроля окружающей среды. Вставьте электроды и уравновесьте ячейки в течение 5 мин.</li>
	<li>Используйте видеомикроскопию для записи видео сокращения. Откройте программное обеспечение для записи видео и установите частоту кадров 100 кадров в секунду. Выберите интересующую область (ROI) вблизи центра монослоя hiPSC-CM. ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбирайте ROI вблизи края монослоев hiPSC-CM, так как это может быть нестабильно для сократительных записей.</li>
	<li>Затем поле стимулирует клетки с помощью коммерческого генератора импульсов (таблица материалов) для электрического темпа 2D монослоев hiPSC-CM. Темп hiPSC-CM при 1,5-кратном пороге при 1 Гц с базовыми параметрами импульса (например, монофазные импульсы прямоугольной волны с длительностью импульса стимула 2 мс ~ 14 В/см)17.</li>
	<li>Запишите видео сокращения на базовом уровне, только в темпе (т.е. перед CCM) (рис. 1D) в течение как минимум пяти ударов17,28.</li>
	<li>Затем стимулируйте монослой hiPSC-CM экспериментальным электрическим сигналом (рис. 1D). Для выполнения этого протокола используются стандартные параметры стимуляции СКК: два симметричных двухфазных импульса длительностью фазы 5,14 мс (общая длительность 20,56 мс), ~28 В/см (амплитуда фазы), нулевой межфазный интервал и задержка 30 мс (т.е. время от окончания импульса стимуляции до начала импульса МКМ) (рис. 1D)29,30 и запишите видео сокращения, вызванного CCM, как минимум на пять ударов.</li>
	<li>Выключите сигнал CCM, стимулируйте импульс базовой стимуляции и запишите видео сокращения периода восстановления (т. е. после CCM) в течение как минимум пяти ударов.</li>
	<li>Используйте стандартное программное обеспечение для автоматического анализа видео сокращения и количественной оценки ключевых сократительных свойств (например, амплитуды сокращения, наклона сокращения, наклона релаксации, времени до пика, времени до исходного уровня 90% и продолжительности сокращения 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Используйте 2D hiPSC-CM на гибкой гидрогелевой подложке для сократительных экспериментов со 2 по 14 день после нанесения покрытия на подложку.</li>
</ol>

Эта статья отражает точку зрения авторов и не должна толковаться как отражающая взгляды или политику Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Упоминание коммерческих продуктов, их источников или их использования в связи с материалами, представленными в настоящем документе, не должно толковаться как фактическое или подразумеваемое одобрение таких продуктов Министерством здравоохранения и социальных служб. Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в этой работе.

Протокол, описанный в настоящем документе, описывает способ получения надежно сжимающихся монослоев 2D hiPSC-CM на гибком гидрогелевом субстрате на основе внеклеточного матрикса (ECM) с коммерческими реагентами 7,17. HiPSC-CM, посеянные на гибком гидрогелевом субстрате, остаются жизнеспособными и обладают повышенными сократительными свойствами7. Этот метод опирается на стандартное лабораторное оборудование и возможности7. В протоколе есть несколько важных шагов, в том числе в отношении работы с гидрогелевым субстратом на основе ECM, которые требуют пристального внимания к деталям. Одной из потенциальных проблем является наличие сыворотки в среде. Это может привести к тому, что hiPSC-CM образуют сети (например, эндотелиальные/сосудистые сети) вместо сливающегося монослойного листа; следовательно, среда без сыворотки рекомендуется во время создания гибких монослоев гидрогеля hiPSC-CM (т.е. с 0 по 4 день). Аналогичным образом, одновременная подготовка слишком большого количества гидрогелевых субстратов может привести к плохим или неровным подложкам из-за усталости оператора. Несмотря на то, что важно работать быстро, целостность каждого гидрогелевого субстрата имеет решающее значение. Точно так же следует осторожно засеять hiPSC-CM и сменить среду; Это не должно делаться насильно. При смене среды его следует добавлять аккуратно от верхнего края лунки, чтобы не нарушить гидрогелевый субстрат или клетки. Как и в случае со стандартными 2D-культурами hiPSC-CM (т.е. обычными тканевыми культурами, пластиком или стеклом), покрытие с низкой плотностью приведет к неполному образованию монослоя. Важно визуально осмотреть hiPSC-CM, чтобы убедиться, что они находятся на гидрогелевой подложке, и использовать таймер для обеспечения точного времени. Кроме того, культивирование монослоев 2D hiPSC-CM в течение более 14 дней на гидрогелевой подложке может привести к разрушению монослоя, основываясь на свойствах ECM и инструкциях производителя подложки.
Существует несколько ограничений текущего метода, которые необходимо учитывать. Во-первых, клетки, используемые в этом протоколе, были от коммерческого поставщика hiPSC-CM, и эти клетки образуют синцитий электрически связанных клеток. Синцитий содержит смесь hiPSC-CM из всех трех подтипов сердца (т.е. желудочкового, предсердного и узлового)17. Исследования могут извлечь выгоду из популяции hiPSC-CM без подтипа (т.е. 100% желудочков или 100% предсердий). Во-вторых, в этом методе использовались только hiPSC-CM, в то время как немиоциты, включая сердечные фибробласты, эндотелиальные клетки и нейроны, могут улучшать функциональность hiPSC-CM22,36. В-третьих, 2D hiPSC-CM демонстрируют несколько особенностей относительно незрелых кардиомиоцитов, включая спонтанное биение, аморфную морфологию и отсутствие инотропного ответа 8,37. В-четвертых, несмотря на то, что этот протокол производит надежно сокращающиеся 2D-монослои hiPSC-CM, вполне вероятно, что функционально улучшенные 3D-модели hiPSC-CM, такие как сконструированные сердечные ткани (ЭСТ), приведут к усиленному сократительному ответу, индуцированному CCM, при физиологических концентрациях кальция 8,38. Наконец, описанный здесь протокол рассчитан на 48-луночный формат. Однако с оптимизацией и включением автоматизации это может быть масштабировано до формата с высокой пропускной способностью (например, 96-луночные или 384-луночные планшеты).
В настоящее время золотым стандартом для исследований hiPSC-CM являются обычные жесткие 2D-условия культивирования (т.е. культура тканей, пластик или стекло). Несмотря на то, что традиционная методология полезна для электрофизиологии3 иобработки кальция в 39 исследованиях, она приводит к минимальным сократительным свойствам 5,6,7. В результате обычные жесткие условия 2D-культивирования не поддаются оценке сократительных эффектов СКК8. Функционально усовершенствованные методы 3D HIPSC-CM ECT38 являются технически сложными, трудоемкими и требуют сложного оборудования, которое доступно не в каждой лаборатории. В этом протоколе мы описываем простую методологию для создания надежно сжимающихся 2D-монослоев hiPSC-CM за более короткий промежуток времени, чем методы 3D ECT или долгосрочные традиционные 2D-методы 7,40,41. Кроме того, используемые здесь реагенты коммерчески доступны, включая гидрогелевый субстрат и hiPSC-CM, и оба имеют значительную консистенцию от партии к партии. В то время как мы использовали съемные электроды из платиновой проволоки (межэлектродное расстояние: 2,0 мм, ширина: 1,0 мм), различные материалы и конфигурации электродов поддаются сократительной оценке CCM in vitro 8,15,17,18,22. Кроме того, существует несколько автоматизированных программ, которые позволяют анализировать видео сокращений 7,31,32.
Большинство доклинических методов оценки сократимости кардиологических медицинских устройств в значительной степени основаны на дорогостоящих моделях животных in vivo (например, собак или свиней) и технически сложных полосках сосочковых мышц (например, кроликов)18. В этой статье описана модель человека in vitro для оценки влияния сигналов медицинских устройств электрофизиологии сердца на сократимость. Этот инструмент может снизить зависимость от исследований на животных и быть полезным для оценки сократительных свойств электрофизиологических устройств сердца in vitro .

По мере старения населения Соединенных Штатов число пациентов с сердечной недостаточностью продолжает расти, наряду с прямыми медицинскими расходами 1,2. Существует острая необходимость в разработке новых методов лечения сердечной недостаточности и инновационных доклинических методологий для тестирования таких методов лечения. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), были предложены в качестве инструмента in vitro для помощи в процессе разработки терапевтических препаратов и использовались в нормативных документах 3,4. Однако их широкое использование было ограничено для исследований сократительной способности из-за отсутствия надежных сократительных свойств при нанесении на покрытие в стандартных жестких условиях 2D-культивирования (т.е. в обычном пластике или стекле для культивирования тканей)5,6,7,8. Ранее мы продемонстрировали полезность нанесения изолированных одиночных hiPSC-CM на гибкую гидрогелевую подложку для получения надежных видимых сократительных свойств9. Мы показали, что изолированные hiPSC-CM обладают сравнимыми сократительными свойствами с таковыми у свежевыделенных кардиомиоцитов желудочков взрослых кроликов. Кроме того, мы продемонстрировали полезность этого метода для оценки сократительных реакций на фармакологические средства7. Кроме того, в других исследованиях эта технология применялась к механистическим оценкам для фундаментальной науки и моделирования заболеваний10,11,12. Здесь эта методология была распространена на монослои 2D hiPSC-CM, и продемонстрирована ее полезность для оценки физиологически значимых электрических сигналов медицинского устройства модуляции сократимости сердца (CCM) in vitro.
СКК представляет собой терапию внутрисердечной сердечной недостаточности, при которой невозбуждающие электрофизиологические сигналы доставляются в миокард в течение абсолютного рефрактерного периода сердечного цикла13,14. Воспроизводимые методы оценки СКК на моделях сердечных клеток человека отсутствуют. В предыдущей работе использовались различные модели сердечных клеток для оценки сократительного ответа CCM. Мы продемонстрировали in vitro, что свежевыделенные кардиомиоциты желудочков кроликов реагируют на стимуляцию CCM временным увеличением кальция и амплитудойсокращения 15. Другое исследование на изолированных кардиомиоцитах желудочков собак продемонстрировало индуцированное CCM усиление внутриклеточной переходной амплитудыкальция 16. Тем не менее, в большинстве исследований СКК использовались препараты для животных ex vivo и in vivo. Эти исследования трудно соотнести друг с другом, поскольку в них применяются различные параметры импульса СКК ивиды17. Одно исследование на изолированной папиллярной модели кролика показало повышенную сократимость, индуцированную CCM,8,18, а ряд исследований всего сердца продемонстрировал индуцированное CCM усиление сократительной функции19,20,21. Эти исследования дали важное механистическое понимание. Тем не менее, отсутствуют воспроизводимые человеческие модели для исследований сократительной ЭП сердца in vitro, включая CCM. С этой целью мы разработали несколько 2D и 3D моделей hiPSC и продемонстрировали индуцированное CCM усиление сократительных свойств в зависимости от параметра. Более того, было обнаружено, что индуцированные CCM инотропные эффекты частично опосредованы нейронным входом и β-адренергической сигнализацией 8,17,22. Тем не менее, необходимо больше знать о механизмах терапии CCM, и использование кардиомиоцитов человека может помочь в достижении этого результата. Таким образом, существует значительная потребность в разработке доклинических инструментов на людях для оценки новых устройств и сигналов CCM, ускорения процесса регулирования, снижения нагрузки на модели на животных и помощи разработчикам устройств в принятии решений 8,17,23,24. Важно разработать простые, самостоятельные протоколы, которые могут быть перенесены в любую лабораторию и в которых используется стандартное оборудование и низкие требования к клеткам для снижения затрат. Этот метод выясняет влияние стимуляции СКК на функцию кардиомиоцитов человека и дает важную информацию о безопасности или эффективности СКК17. Здесь мы описываем метод создания 2D-монослоев hiPSC-CM на гибкой гидрогелевой подложке для создания стандартизированного доклинического инструмента для количественной оценки сократительных реакций острого электрофизиологического медицинского устройства сердца (т.е. CCM) в здоровье и болезнях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), в настоящее время исследуются для многократного применения in vitro и используются в нормативных документах. Здесь мы расширяем их использование для оценки безопасности или производительности кардиологических устройств. Мы разработали новый метод оценки сократительных свойств кардиологических медицинских устройств в надежно сокращающихся монослоях 2D hiPSC-CM, нанесенных на гибкую гидрогелевую подложку на основе внеклеточного матрикса (ECM). Этот инструмент позволяет количественно оценить влияние сигналов устройства электрофизиологии сердца на сердечную функцию человека (например, сократительные свойства) с помощью стандартного лабораторного оборудования. Монослои 2D hiPSC-CM культивировали в течение 2-4 дней на гибкой гидрогелевой подложке в 48-луночном формате.
hiPSC-CM подвергались воздействию стандартных электрических сигналов медицинских устройств модуляции сократимости сердца (CCM) и сравнивались с контрольными (т.е. только кардиостимуляцией) hiPSC-CM. Базовые сократительные свойства 2D hiPSC-CM были количественно определены с помощью анализа обнаружения на основе видео, основанного на смещении пикселей. Стимулированные CCM 2D hiPSC-CM, нанесенные на гибкую гидрогелевую подложку, продемонстрировали значительно улучшенные сократительные свойства по сравнению с исходным уровнем (т.е. до стимуляции CCM), включая увеличенную амплитуду пикового сокращения и ускоренную кинетику сокращения и релаксации. Кроме того, использование гибкого гидрогелевого субстрата позволяет мультиплексировать показания связи сокращения сердца на основе видео (т.е. электрофизиологии, обработки кальция и сокращения) у здоровых и больных hiPSC-CM. Точное обнаружение и количественная оценка влияния сердечных электрофизиологических сигналов на сокращение сердца человека имеет жизненно важное значение для разработки, оптимизации и снижения рисков кардиологических медицинских устройств. Этот метод обеспечивает надежную визуализацию и количественную оценку сократительных свойств сердечного синцития, что должно быть ценным для доклинических испытаний безопасности или эффективности кардиологических медицинских устройств. В этой статье подробно описана методология создания 2D монослоев гидрогелевых субстратов hiPSC-CM.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Здесь мы демонстрируем неинвазивный метод оценки сократительной способности кардиологического медицинского устройства с использованием 2D-монослоев индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC-CM), нанесенных на гибкую подложку, в сочетании с видеомикроскопией. Этот инструмент будет полезен для оценки in vitro сократительных свойств аппаратов электрофизиологии сердца.

Оценка терапии модуляции сократимости сердца в 2D кардиомиоцитах, полученных из стволовых клеток человека

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Управление научных и инженерных лабораторий FDA разрабатывает нормативные научные инструменты для помощи разработчикам медицинских устройств и рецензентам FDA. Наша конечная цель — ускорить доступ пациентов к инновационным, безопасным и эффективным медицинским устройствам с помощью наилучших доступных научных данных. В этом протоколе мы применяем передовую технологию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для оценки медицинских устройств, которые используются для лечения опасных для жизни сердечных заболеваний.Этот простой инструмент позволяет воспроизвести оценку устройств электрофизиологии сердца в чашке с использованием стандартного лабораторного оборудования. Он также может быть использован с специфическими для пациента клетками, полученными от доноров с различными сердечными заболеваниями. Для начала размороженные кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека, помещают на стерильные шестилуночные планшеты, покрытые 0,1%-ным желатином, по крайней мере, за два дня до посева кардиомиоцитов на гибкий гидрогелевый субстрат.Культивируйте кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека, в стандартной среде кардиомиоцитов в течение двух-четырех дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы они могли восстановиться после криоконсервации. Обновляйте отработанную среду 100%-ной кардиомиоцитарной средой каждые 48 часов. Проверьте состояние кардиомиоцитов, полученных из ИПСК человека, перед диссоциацией, оценив здоровье клеток, обеспечив жизнеспособность и стабильное биение.Промойте кардиомиоциты четырьмя миллилитрами DPBS на лунку без хлорида кальция или хлорида магния. Добавьте по одному миллилитру реагента для диссоциации при комнатной температуре в каждую лунку и выдерживайте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте 10 миллилитров кардиомиоцитарной среды в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров.Диссоциируйте кардиомиоциты из шестилуночных планшетов с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров и добавьте клеточную суспензию в коническую трубку. Промойте лунки одним миллилитром свежей кардиомиоцитарной среды, чтобы собрать остаточные кардиомиоциты и добавить их в коническую трубку. Затем доведите конечный объем конической трубки до 15 миллилитров со средой.Центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость до отметки в один миллилитр. Ресуспендируют клетки в среде кардиомиоцитов до конечного объема пять миллилитров и подсчитывают кардиомиоциты с помощью ручного или автоматического счетчика клеток. Затем инкубируют суспензию клеток кардиомиоцитов в течение примерно 30 минут при комнатной температуре, пока готовятся гибкие гидрогелевые субстраты.Приготовьте 20-литровую дозатор объемом 1 микролитр, наконечники пипеток, стерильную стеклянную нижнюю пластину с 48 лунками и таймер секундомера в вытяжке для культивирования тканей. Смешайте внеклеточный матрикс или гидрогелевый субстрат на основе ECM, осторожно постукивая по трубке и сразу же помещая ее обратно на лед. Запустите таймер секундомера непосредственно перед нанесением покрытия на первую гидрогелевую подложку и отметьте это как нулевое время.Пипеткой нанесите один микролитр гидрогелевой подложки вверх и вниз примерно три раза, чтобы охладить наконечник пипетки. Затем нанесите примерно по одному микролитру неразбавленной гидрогелевой субстраты горизонтально на дно каждой лунки в 48-луночной пластине, удерживая пипетку под углом 45 градусов. Нанесите все гидрогелевые субстраты в одинаковой ориентации в каждой лунке, чтобы помочь идентифицировать подложку при выполнении экспериментов с 40-кратным увеличением.Накройте крышкой 48-луночную пластину и дайте гидрогелевым субстратам инкубироваться в течение восьми-10 минут при комнатной температуре в колпаке для культивирования тканей, прежде чем добавлять клетки. После инкубации немедленно высевают кардиомиоциты по каплям непосредственно на гидрогелевые субстраты с примерно 30 000 жизнеспособных кардиомиоцитов на лунку в низком среднем объеме около 200 микролитров кардиомиоцитарной среды. После закрытия крышки дайте кардиомиоцитам спокойно инкубироваться в течение 10-15 минут при комнатной температуре в вытяжке, чтобы клетки могли прилипнуть к гидрогелевому субстрату.Аккуратно добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежей кардиомиоцитарной среды. Поместите закрытую крышкой тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на два-четыре дня. Включите микроскоп и камеру контроля окружающей среды, чтобы уравновесить температуру до 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа.Извлеките кардиомиоцитарную среду из 48-луночной пластины и осторожно промойте каждую лунку дважды 600 микролитрами модуляции сократимости сердца или средой для анализа CCM. Затем добавьте 300 микролитров проанализирующей среды СКК на лунку и поместите 48-луночную пластину на микроскоп в камеру контроля окружающей среды. Вставьте электроды и уравновесьте клетки в течение пяти минут.Чтобы записать видео сокращения с помощью видеомикроскопии, откройте программное обеспечение для записи видео и установите частоту кадров 100 кадров в секунду. Затем выберите интересующую область или окупаемость инвестиций вблизи центра монослоя hiPSC-CM. Затем поле стимулирует клетки с помощью коммерческого генератора импульсов для электрического темпа монослоев 2D-кардиомиоцитов.Поместите кардиомиоцит на 1,5-кратный порог при одном герце с исходными параметрами пульса. Например, монофазные импульсы прямоугольной волны с длительностью стимульного импульса в две миллисекунды пять вольт. Запишите видео о сокращении только базового темпа перед CCM в течение как минимум пяти ударов.Затем стимулируют монослой кардиомиоцитов экспериментальным электрическим сигналом с задержкой 30 миллисекунд, двумя симметричными двухфазными импульсами фазовой длительностью 5,14 миллисекунды, общей длительностью 20,56 миллисекунды, амплитудой фазы 10 вольт и нулевым межфазным интервалом. Запишите видео сокращения, вызванного CCM, как минимум на пять ударов. Выключите сигнал СКК, стимулируйте импульс базовой стимуляции и запишите видео сокращения периода восстановления после СКК в течение как минимум пяти ударов.Используйте стандартное программное обеспечение для автоматического анализа видео сокращения и количественной оценки ключевых сократительных свойств, таких как амплитуда сокращения, наклон сокращения, наклон релаксации, время до пика, время до исходного уровня 90% и продолжительность сокращения 50%Были охарактеризованы контрактные свойства монослоя кардиомиоцитов, полученных из 2D человеческого ИПСК, и количественно определены ключевые параметры сократимости кардиомиоцитов. Применение стандартных параметров стимуляции СКК привело к усилению сократительных свойств in vitro. Оценено влияние модуляции внеклеточных концентраций кальция на сократительные свойства человека при стимуляции СКК и без нее.Наблюдалась ожидаемая исходная кальциевая зависимость сокращения, а также индуцированное СКК повышение чувствительности к кальцию на уровне монослоя кардиомиоцитов. Кроме того, фармакологический опрос бета-андрогенного сигнального пути показал, что индуцированные СКК инотропные эффекты были частично опосредованы бета-адренергической передачей сигналов. Кроме того, этот инструмент может быть расширен до кардиомиоцитов конкретного заболевания, в том числе кардиомиопатии дилатационной кардиомиопатии, чтобы понять влияние СКК в контексте болезненных состояний.Здесь мы фокусируемся в первую очередь на оценке сократительных свойств человека. Однако, используя этот инструмент, можно также оценить другие показания связи с сокращением сердечного возбуждения, включая потенциалы действия и обработку кальция. Это первый регуляторный научный инструмент, сочетающий индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с помощью технологии с оценкой сердечных устройств.Этот альтернативный метод прокладывает путь для оценки медицинских устройств в чашке и может снизить потребность в тестировании на животных и людях.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Инкапсуляция кардиомиоцитов в Фибрин Гидрогель для сердечной тканевой инженерии

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Анатомические реконструкций сердца человека венозной системы использованием контраста Компьютерная томография перфузии фиксированных экземпляров

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Ударно-волновой Применение к клеточных культур

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Изготовление 3D-матриц микротизвестков сердца с использованием кардиомиоцитов человека, фибробластов сердца и эндотелиальных клеток

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Индукция стволовых клеток пульпы зубов человека к линиям поджелудочной железы

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...