Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av ett möte till forskningsdeltagandeprogrammet vid Center for Devices and Radiological Health som administreras av Oak Ridge Institute for Science and Education genom ett interagenturavtal mellan US Department of Energy och US Food and Drug Administration. Författarna tackar Richard Gray, Trent Robertson och Anna Avila för deras förslag och tekniska hjälp. Studien finansierades genom US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.

1. Beredning av plattor och media
OBS: En typisk extracellulär matris (ECM)-baserad hydrogelalikvot är ~ 200 μL i ett sterilt 1,5 ml rör lagrat vid −20 ° C.
<ol><li>I en steril vävnadsodlingshuva, förbered en steril 6-brunnsplatta genom att överföra 2 ml 0,1% gelatin (materialtabell) till varje brunn. Placera locket på plattan med 6 brunnar och låt den belagda plattan inkubera vid 37 °C i minst 1 timme.</li>
	<li>En dag innan du sådd hiPSC-CMs på det flexibla hydrogelsubstratet, tina en hydrogel (Table of Materials) alikvot i kylskåpet på is.</li>
	<li>Förbered kardiomyocytmediet (materialtabell) genom att blanda 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x B-27-tillskott och 5 ml penicillin-streptomycin9.</li>
</ol>2. Sådd av kryokonserverade hiPSC-CM
<ol><li>Två dagar före sådd av hiPSC-CMs på det flexibla hydrogelsubstratet, förplatta hiPSC-CMs på 0,1% gelatinbelagda sterila 6-brunnsplattor. Tina hiPSC-CM med ett standardupptiningsprotokoll 9,25.</li>
	<li>Platta sedan 1 500 000 hiPSC-CM totalt (materialförteckning) per brunn enligt tillverkarens instruktioner (figur 1A)26.</li>
	<li>Odla hiPSC-CMs i standard kardiomyocytmedium i 2-4 dagar så att hiPSC-CMs kan återhämta sig från kryokonservering vid 37 ° C och 5% CO2. Uppdatera det förbrukade mediet med 100% kardiomyocytmedium var 48: e timme.</li>
</ol>3. Dissociation och räkning av de förpläterade hiPSC-CM
<ol><li>Kontrollera status för hiPSC-CM före dissociation. Utvärdera hälsan hos hiPSC-CM, vilket säkerställer livskraft och stabil slagning. Renheten hos hiPSC-CM-populationen är viktig (t.ex. >90% hjärttroponin T)7. En kardiomyocytvalsmetod (t.ex. metabolisk selektion eller sortering) rekommenderas för att minska störningen av hydrogelsubstratet av icke-kardiomyocytceller25,26.</li>
	<li>Tvätta hiPSC-CMs 2x med 4 ml per brunn D-PBS utan CaCl 2 eller MgCl2 (materialtabell). Aspirera D-PBS, tillsätt 1 ml dissociationsreagens vid rumstemperatur till varje brunn och inkubera sedan i 15 minuter vid 37 °C.</li>
	<li>Tillsätt 10 ml kardiomyocytmedium till ett sterilt 15 ml koniskt rör.</li>
	<li>Separera hiPSC-CM från 6-brunnsplattan med en 1 000 μL pipett (figur 1B). Tillsätt cellsuspensionen till det 15 ml koniska röret26.</li>
	<li>Skölj brunnen med 1 ml färskt kardiomyocytmedium för att samla upp eventuella kvarvarande hiPSC-CM och tillsätt dem till det 15 ml koniska röret. Ta den slutliga volymen av det koniska röret till 15 ml.</li>
	<li>Centrifugera i 5 min (200 × g). Ta bort supernatanten upp till 1 ml-märket. Resuspendera cellerna i kardiomyocytmedium till en slutlig volym på 5 ml.</li>
	<li>Räkna hiPSC-CM med en manuell eller automatiserad cellräknare.</li>
	<li>Inkubera hiPSC-CM-suspensionen vid rumstemperatur medan de flexibla hydrogelsubstraten bereds (högst 30 min).</li>
</ol>4. Beredning av de flexibla hydrogelsubstraten
<ol><li>Bered en 20 μL pipettuppsättning vid 1 μL, 20 μL pipettspetsar (t.ex. 20 μL) och en steril bottenplatta av glas med 48 brunnar. Se till att ett stoppur / timer är klart innan hydrogelsubstraten tillverkas.</li>
	<li>Blanda det ECM-baserade hydrogelsubstratet i den sterila vävnadsodlingshuven genom att försiktigt knacka på röret och placera det omedelbart tillbaka på is.</li>
	<li>Starta sedan stoppuret / timern omedelbart innan det första hydrogelsubstratet pläteras - det här är tid noll.</li>
	<li>Pipettera 1 μL av hydrogelsubstratet upp och ner ~3x för att kyla pipettspetsen. Applicera ~1 μL av det outspädda hydrogelsubstratet horisontellt på botten av varje brunn på 48-brunnsplattan (figur 1C, figur 2A och figur 3A) och håll pipetten i 45° vinkel. Platta alla hydrogelsubstrat i samma orientering i varje brunn (figur 2 och figur 3) för att identifiera substratet när experimenten utförs vid 40x förstoring 7,9,17,27. OBS: Varje ~ 1 μL linje är ett hydrogelsubstrat (figur 3). Vanligtvis tar det ~ 5 minuter att förbereda 48 brunnar. Användningen av ett horisontellt lutande mikroplattstativ (t.ex. 30 °) kan möjliggöra en bättre bild av brunnens botten och hydrogelsubstratet. Var noga med att gå hela längden på brunnen (dvs från vänster till höger). Korta hydrogelsubstrat kan vara för tjocka, vilket minskar substratstabiliteten. Låt inte hydrogelsubstratet torka i pipettspetsen. Om detta inträffar, byt snabbt till ett nytt tips och fortsätt omedelbart. Alternativt kan kylda pipettspetsar användas. Det ECM-baserade hydrogelsubstratet kan snabbt polymerisera när det inte ligger på is. Beredning av flera brunnar åt gången (t.ex. 10) föreslås. Dessutom rekommenderas att öva i en mock 48-brunnsplatta.</li>
	<li>Placera locket på plattan med 48 brunnar och låt hydrogelsubstraten inkubera i 8-10 minuter vid rumstemperatur i den sterila vävnadsodlingshuven innan cellerna tillsätts (figur 2B). OBS: Det är viktigt att följa de föreslagna inkubationstiderna. En inkubationstid på mer än 10 min leder till styva hydrogelsubstrat och inga synliga sammandragningar. En inkubationstid på mindre än 8 min kan leda till substrat som kollapsar.</li>
	<li>Frö omedelbart hiPSC-CMs droppvis direkt på hydrogelsubstraten, med ~ 30 000 livskraftiga hiPSC-CMs per brunn i en låg medelvolym på ~ 200 μL kardiomyocytmedium, med en 1,000 μL pipett (figur 2B och figur 3B). OBS: Denna process stoppar hydrogelsubstratpolymerisationen och säkerställer att hiPSC-CM finns på substratet 7,9,17,27.</li>
	<li>Placera locket på plattan och låt hiPSC-CMs inkubera ostört i 10-15 minuter vid rumstemperatur (figur 2C) i den sterila vävnadsodlingshuven så att hiPSC-CM kan fästa vid hydrogelsubstratet.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt ~ 100 μL färskt kardiomyocytmedium till varje brunn (slutlig volym: ~ 300 μL per brunn). Lägg locket på plattan och överför till en inkubator vid 37 °C, 5%CO2 i 2-4 dagar. Uppdatera 100% mediet var 24: e timme innan sammandragningsexperimenten utförs. OBS: Inspektera hiPSC-CM visuellt för korrekt morfologi; omedelbart efter pläteringen ska hiPSC-CM vara runda (figur 3B). Vid dag 2 efter sådd observeras ett konfluent 2D hiPSC-CM monolagersyncytium (figur 3C) (kompletterande video S1) med robust synlig sammandragning (kompletterande video S2).</li>
</ol>5. Kontraktionsregistrering och analys
<ol><li>Bered CCM-analysmediet, som är Tyrodes lösning innehållande följande (i mmol / L): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glukos 10 och HEPES 10, med pH justerat till 7,4 med NaOH och jämvikt till 37 ° C i ett vattenbad. OBS: Submaximalt extracellulärt kalcium (0,5 mM) används för att förbättra CCM-analysfönstret.</li>
	<li>Slå på mikroskopet och miljökontrollkammaren för att balansera till 37 ° C och 5% CO2.</li>
	<li>Ta bort kardiomyocytmediet från 48-brunnsplattan och skölj försiktigt varje brunn två gånger med 600 μL CCM-analysmedium.</li>
	<li>Tillsätt 300 μL CCM-analysmedium per brunn och placera 48-brunnsplattan på mikroskopet i miljökontrollkammaren. Sätt in elektroderna och balansera cellerna i 5 minuter.</li>
	<li>Använd videobaserad mikroskopi för att spela in kontraktionsvideor. Öppna videoinspelningsprogrammet och ställ in en bildhastighet på 100 bilder / s. Välj en region av intresse (ROI) nära mitten av hiPSC-CM-monolagret. Välj inte en ROI nära kanten av hiPSC-CM-monolagren eftersom detta kan vara instabilt för kontraktila inspelningar.</li>
	<li>Därefter stimulerar fältet cellerna med en kommersiell pulsgenerator (Table of Materials) för att elektriskt takta 2D hiPSC-CM-monolagren. Takta hiPSC-CMs vid 1,5x tröskel vid 1 Hz med baslinjepulsparametrar (t.ex. monofasiska fyrkantvågspulser med en 2 ms stimulanspulsvaraktighet på ~ 14 V / cm)17.</li>
	<li>Spela in baslinjen, endast tempo (dvs. före CCM) (figur 1D) sammandragningsvideo i minst fem slag17,28.</li>
	<li>Stimulera sedan hiPSC-CM-monolagret med en experimentell elektrisk signal (figur 1D). För att följa detta protokoll, använd standard CCM-stimuleringsparametrar: två symmetriska bifasiska pulser med 5,14 ms fasvaraktighet (20,56 ms total varaktighet), ~ 28 V / cm (fasamplitud), noll interfasintervall och en 30 ms fördröjning (dvs. tid från slutet av pacingpulsen till början av CCM-pulsen) (figur 1D)29,30 och spela in den CCM-inducerade kontraktionsvideon i minst fem taktslag.</li>
	<li>Stäng av CCM-signalen, stimulera med en baslinjepuls och spela in en sammandragningsvideo av återhämtningsperioden (dvs. efter CCM) i minst fem slag.</li>
	<li>Använd standardkontraktionsprogramvara för att automatiskt analysera kontraktionsvideorna och kvantifiera de viktigaste kontraktila egenskaperna (t.ex. kontraktionsamplitud, kontraktionslutning, avkopplingslutning, tid till topp, tid till baslinje 90% och kontraktionstid 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Använd 2D hiPSC-CMs på det flexibla hydrogelsubstratet för kontraktila experiment från dag 2-14 efter plätering på substratet.</li>
</ol>

Denna artikel återspeglar författarnas åsikter och bör inte tolkas för att representera US Food and Drug Administration åsikter eller politik. Omnämnandet av kommersiella produkter, deras källor eller deras användning i samband med det material som rapporteras här ska inte tolkas som varken ett faktiskt eller underförstått godkännande av sådana produkter av Department of Health and Human Services. Författarna förklarar inga konkurrerande intressen för detta arbete.

Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för att generera robust kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt extracellulärt matris (ECM)-baserat hydrogelsubstrat med kommersiella reagens 7,17. HiPSC-CMs sådda på det flexibla hydrogelsubstratet förblir livskraftiga och har förbättrade kontraktila egenskaper7. Denna teknik bygger på standardlaboratorieutrustning och kapacitet7. Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive i förhållande till arbetet med det ECM-baserade hydrogelsubstratet, som kräver noggrann uppmärksamhet på detaljer. Ett potentiellt problem är närvaron av serum i mediet. Detta kan leda till att hiPSC-CM bildar nätverk (t.ex. endoteliala/vaskulära nätverk) istället för ett konfluent monolagerark; därför rekommenderas ett serumfritt medium vid upprättandet av de flexibla hydrogelmonolagren hiPSC-CM (dvs. dag 0 till dag 4). På samma sätt kan beredning av för många hydrogelsubstrat samtidigt resultera i dåliga eller ojämna substrat på grund av operatörströtthet. Även om det är viktigt att arbeta snabbt är integriteten hos varje hydrogelsubstrat kritisk. På samma sätt bör man noggrant fröa hiPSC-CM och byta medium; Detta bör inte göras kraftfullt. Vid byte av medium bör det tillsättas försiktigt från brunnens övre kant för att inte störa hydrogelsubstratet eller cellerna. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konventionell vävnadsodlingsplast eller glas) kommer plätering med låg densitet att resultera i ofullständig enskiktsbildning. Det är viktigt att visuellt inspektera hiPSC-CM för att bekräfta att de finns på hydrogelsubstratet och att använda en timer för att säkerställa korrekt timing. Dessutom kan odling av 2D hiPSC-CM-monolager i mer än 14 dagar på hydrogelsubstratet resultera i enskiktsstörningar, baserat på ECM-egenskaperna och instruktionerna från tillverkaren av substratet.
Det finns flera begränsningar för den nuvarande metoden som måste beaktas. För det första var cellerna som användes i detta protokoll från en kommersiell hiPSC-CMs-leverantör, och dessa celler bildar ett syncytium av elektriskt kopplade celler. Synkytiet innehåller en blandning av hiPSC-CM från alla tre hjärtsubtyperna (dvs. ventrikulär, förmak och nodal)17. Studier kan dra nytta av en subtyp-exklusiv hiPSC-CM-population (dvs. 100% ventrikulär eller 100% förmak). För det andra använde denna metod endast hiPSC-CM, medan icke-myocyter, inklusive hjärtfibroblaster, endotelceller och neuroner, kan förbättra hiPSC-CM-funktionaliteten22,36. För det tredje visar 2D hiPSC-CMs flera egenskaper hos relativt omogna kardiomyocyter, inklusive spontan slagning, amorf morfologi och brist på inotropt svar 8,37. För det fjärde, medan detta protokoll producerar robust kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager, är det troligt att funktionellt förbättrade 3D hiPSC-CM-modeller såsom konstruerade hjärtvävnader (ECT) kommer att resultera i ett förbättrat CCM-inducerat kontraktilt svar under fysiologiska kalciumkoncentrationer 8,38. Slutligen är protokollet som beskrivs här utformat för ett 48-brunnsformat. Men med optimering och inkludering av automatisering kan detta skalas till ett format med hög genomströmning (t.ex. plattor med 96 brunnar eller 384 brunnar).
Den nuvarande guldstandarden för hiPSC-CM-studier är konventionella styva 2D-odlingsförhållanden (dvs. vävnadsodlingsplast eller glas). Även om den konventionella metoden är användbar för elektrofysiologi3 och kalciumhantering39 studier, resulterar den i minimala kontraktila egenskaper 5,6,7. Som ett resultat är konventionella styva 2D-odlingsförhållanden inte mottagliga för bedömning av CCM-kontraktila effekter8. Funktionellt förbättrade 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 är tekniskt utmanande, tidskrävande och kräver sofistikerad utrustning som inte är lätt tillgänglig i alla laboratorier. I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att generera robust kontrakterande 2D hiPSC-CM-monolager inom en kortare tidsram än 3D ECT-metoder eller långsiktiga, konventionella 2D-metoder 7,40,41. Dessutom är de reagens som används här kommersiellt tillgängliga, inklusive hydrogelsubstratet och hiPSC-CM, och båda har betydande parti-till-parti-konsistens. Medan vi använde avtagbara platinatrådelektroder (interelektrodavstånd: 2,0 mm, bredd: 1,0 mm), är olika elektrodmaterial och konfigurationer mottagliga för CCM-kontraktila bedömningar in vitro 8,15,17,18,22. På samma sätt finns det flera automatiserade program tillgängliga som möjliggör analys av sammandragningsvideor 7,31,32.
Majoriteten av icke-kliniska metoder för att utvärdera kontraktilitet för hjärtmedicinsk utrustning bygger till stor del på kostsamma in vivo-djurmodeller (t.ex. hundar eller grisar) och tekniskt utmanande papillära muskelremsor (t.ex. kaniner)18. Denna artikel beskrev en human in vitro-modell för att utvärdera effekterna av hjärtelektrofysiologiska medicintekniska signaler på kontraktilitet. Detta verktyg skulle kunna minska beroendet av djurstudier och vara användbart för in vitro-utvärdering av kontraktila egenskaper hos hjärtelektrofysiologiska enheter.

När USA: s befolkning åldras fortsätter antalet hjärtsviktpatienter att öka, tillsammans med de direkta medicinska kostnaderna 1,2. Det finns ett kritiskt behov av att utveckla nya terapier för att behandla hjärtsvikt och innovativa icke-kliniska metoder för att testa sådana terapier. Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har föreslagits som ett in vitro-verktyg för att underlätta den terapeutiska utvecklingsprocessen och har använts i regulatoriska inlämningar 3,4. Deras utbredda användning har dock begränsats för kontraktilitetsstudier på grund av bristen på robusta kontraktila egenskaper när de pläteras under standardstyva 2D-odlingsförhållanden (dvs. konventionell vävnadsodlingsplast eller glas)5,6,7,8. Vi har tidigare demonstrerat nyttan av att plätera isolerade enskilda hiPSC-CMs på ett flexibelt hydrogelsubstrat för att generera robusta synliga kontraktila egenskaper9. Vi visade att isolerade hiPSC-CMs har jämförbara kontraktila egenskaper med de hos nyligen isolerade vuxna kaninventrikulära kardiomyocyter. Dessutom demonstrerade vi användbarheten av denna metod för att bedöma kontraktila svar på farmakologiska medel7. Dessutom har andra studier tillämpat denna teknik på mekanistiska bedömningar för grundvetenskap och sjukdomsmodellering10,11,12. Här har denna metod utvidgats till 2D hiPSC-CM-monolager, och dess användbarhet vid utvärdering av fysiologiskt relevanta elektriska signaler för hjärtkontraktilitet modulering (CCM) in vitro demonstreras.
CCM är en intrakardiell hjärtsviktsbehandling där icke-excitatoriska elektrofysiologiska signaler levereras till myokardiet under den absoluta eldfasta perioden av hjärtcykeln13,14. Reproducerbara metoder för att utvärdera CCM i humana hjärtcellsmodeller saknas. Tidigare arbete har använt olika hjärtcellsmodeller för att utvärdera CCM-kontraktilsvaret. Vi visade in vitro att nyisolerade kaninventrikulära kardiomyocyter svarar på CCM-stimulering genom en övergående ökning av kalcium och kontraktionsamplitud15. En annan studie på isolerade ventrikulära kardiomyocyter hos hundar visade CCM-inducerad förbättring av den intracellulära kalciumtransienta amplituden16. Majoriteten av CCM-studierna har dock använt ex vivo och in vivo djurpreparat. Dessa studier är svåra att korrelera med varandra eftersom de tillämpar en mängd olika CCM-pulsparametrar och arter17. En studie i en isolerad kaninpapillärmodell avslöjade ökad CCM-inducerad kontraktilitet8,18, och en rad helhjärtstudier har visat CCM-inducerad förbättring av kontraktil funktion19,20,21. Dessa studier har gett viktiga mekanistiska insikter. Det saknas dock reproducerbara humana modeller för in vitro hjärt-EP-kontraktila studier inklusive CCM. För detta ändamål har vi utvecklat flera 2D- och 3D-hiPSC-modeller och demonstrerat CCM-inducerad förbättring av kontraktila egenskaper på ett parameterberoende sätt. Dessutom har de CCM-inducerade inotropa effekterna visat sig delvis medieras av neuronal inmatning och β-adrenerg signalering 8,17,22. Ändå behöver mer vara känt om mekanismerna för CCM-terapi, och användning av kontraherande humana kardiomyocyter kan hjälpa till att uppnå detta resultat. Som sådan finns det ett betydande behov av att utveckla mänskliga icke-kliniska verktyg för att utvärdera nya CCM-enheter och signaler, påskynda regleringsprocessen, minska belastningen på djurmodeller och hjälpa enhetsutvecklare att fatta beslut 8,17,23,24. Det är viktigt att utveckla enkla, gör-det-själv-protokoll som kan överföras till vilket laboratorium som helst och som använder standardutrustning och låga cellkrav för att minska kostnaderna. Denna metod belyser effekterna av CCM-stimulering på human kardiomyocytfunktion och ger viktiga insikter om CCM-säkerhet eller effektivitet17. Här beskriver vi metoden för att generera 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt hydrogelsubstrat för att producera ett standardiserat icke-kliniskt verktyg för att kvantifiera akut hjärtelektrofysiologisk medicinsk utrustning (dvs. CCM) kontraktila svar i hälsa och sjukdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) undersöks för närvarande för flera in vitro-applikationer och har använts i regulatoriska ansökningar. Här utvidgar vi deras användning till säkerhets- eller prestandabedömningar av hjärtmedicinsk utrustning. Vi utvecklade en ny metod för att utvärdera kontraktila egenskaper hos hjärtmedicinsk utrustning i robust kontraherande 2D hiPSC-CMs monolager pläterade på ett flexibelt extracellulärt matris (ECM) -baserat hydrogelsubstrat. Detta verktyg möjliggör kvantifiering av effekterna av hjärtelektrofysiologiska enhetssignaler på mänsklig hjärtfunktion (t.ex. kontraktila egenskaper) med standardlaboratorieutrustning. 2D hiPSC-CM-monolagren odlades i 2-4 dagar på ett flexibelt hydrogelsubstrat i ett 48-brunnsformat.
hiPSC-CMs utsattes för standard hjärtkontraktilitetsmodulering (CCM) elektriska signaler för medicinsk utrustning och jämfördes med kontroll (dvs. endast pacing) hiPSC-CM. Baslinjens kontraktila egenskaper hos 2D hiPSC-CMs kvantifierades genom videobaserad detektionsanalys baserad på pixelförskjutning. De CCM-stimulerade 2D hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet visade signifikant förbättrade kontraktila egenskaper i förhållande till baslinjen (dvs. före CCM-stimulering), inklusive en ökad toppkontraktionsamplitud och accelererad kontraktion och avslappningskinetik. Dessutom möjliggör användningen av det flexibla hydrogelsubstratet multiplexering av de videobaserade avläsningarna av hjärt-excitationskontraktionskoppling (dvs. elektrofysiologi, kalciumhantering och sammandragning) i friska och sjuka hiPSC-CM. Noggrann detektion och kvantifiering av effekterna av hjärtelektrofysiologiska signaler på mänsklig hjärtkontraktion är avgörande för utveckling, optimering och riskreducering av hjärtmedicinsk utrustning. Denna metod möjliggör robust visualisering och kvantifiering av hjärtsyncytiums kontraktila egenskaper, vilket bör vara värdefullt för icke-klinisk säkerhets- eller effektivitetstestning av hjärtmedicinsk utrustning. Detta dokument beskriver i detalj metoden för att generera 2D hiPSC-CM hydrogelsubstratmonolager.

I detta protokoll beskrivs ett enkelt, robust verktyg för att generera synligt kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt hydrogelsubstrat. Mätningen av kontraktila egenskaper utförs med videobaserad inspelning i kombination med kontraktilitetsanalysprogramvara. Detta möjliggör kvantifiering av nyckelparametrar för kardiomyocytkontraktilitet, inklusive kontraktionsamplitud, kontraktionslutning, avkopplingslutning, tid till topp, tid till baslinje 90% och kontraktionstid 50%. Modellen används för att karakterisera baslinjens kontraktila egenskaper hos hiPSC-CMs (figur 4) från olika "friska" donatorer och kan utvidgas till utvärdering av hjärtelektrofysiologiska medicintekniska signaler (dvs. CCM). Tillämpningen av standardstimuleringsparametrarna för CCM (figur 1D)29,30 resulterade i förbättrade kontraktila egenskaper in vitro (figur 5 och tabell 1)17.
Vi visade vidare att denna metod kan användas för att utvärdera effekterna av modulering av extracellulära kalciumkoncentrationer på humana kontraktila egenskaper med och utan CCM-stimulering (Figur 6)17. Det förväntade kalciumberoendet av kontraktion vid baslinjen observerades 7,17, liksom en CCM-inducerad ökning av kalciumkänsligheten vid nivån av kardiomyocytmonolagret. Dessutom avslöjade den farmakologiska undersökningen av den β-adrenerga signalvägen (figur 7) att de CCM-inducerade inotropa effekterna delvis medierades av β-adrenerg signalering17. Dessutom kan detta verktyg utvidgas till patientspecifika sjukdomskardiomyocyter, inklusive dilaterad kardiomyopati (DCM)33,34,35 (figur 8), för att förstå effekten av CCM i samband med sjukdomstillstånd; Faktum är att förbättrad kontraktil amplitud och accelererad kontraktions- och avslappningskinetik observerades vid CCM-"dosen" som testades här (figur 8). Medan vi har en CCM-efterliknande enhet i vårt laboratorium, är metoden som används här inte specifik för det systemet och kan tillämpas på andra hjärtelektrofysiologiska enheter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk sammanfattning av 2D hiPSC-CM in vitro CCM-modellen. (A) hiPSC-CMs är förpläterade i monolagerformat på gelatin (0,1%)-belagda 6-brunnsplattor. (B) Efter 2 dagar i odling dissocieras hiPSC-CM och förbereds för plätering på ett flexibelt hydrogelsubstrat. (C) De isolerade hiPSC-CMs pläteras med hög densitet på hydrogelsubstrat arrangerade i ett 48-brunnsformat (vänster) och analyseras i (0,5 mM) extracellulärt kalcium Tyrodes lösning (höger). (D) En kommersiell pulsgenerator och standard kliniska CCM-pulsparametrar29,30 (höger) används för att stimulera hiPSC-CM. Hjärtfunktionen bedöms genom videobaserad analys (vänster). E) Representativa kontraktionsregistreringar före CCM (baslinje: 5 V), under CCM (CCM: 10 V) och efter CCM (utbyte: 5 V). Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk bild av plätering och sådd av det flexibla hydrogelsubstratet. (A) Fullständigt tinat, outspätt ECM-baserat hydrogelsubstrat appliceras på en steril 48-brunnsplatta (vänster panel), med 1 μL hydrogelsubstrat per brunn (höger panel). (B) Hydrogelsubstratet får inkuberas vid rumstemperatur i 8-10 minuter (höger panel), följt av plätering av hiPSC-CM med hög densitet i en låg medelvolym (~ 200 μL) (vänster panel). (C) Efter 10-15 minuters inkubation tillsätts medium till varje brunn (vänster panel) och plattorna flyttas till en standardinkubator för vävnadsodling (höger panel). Förkortningar: ECM = extracellulär matris, hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; RT = rumstemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Figur 3: Extracellulärt matrisbaserat hydrogelsubstrat. (A) Representativt hydrogelsubstrat (inga celler) i en brunn i en bottenplatta av glas med 48 brunnar omedelbart efter det att substratet applicerats på brunnen. (B) Tid 0 efter att hiPSC-CM har seedats. (C) Tid 24 timmar efter det att hiPSC-CM har sådd. Denna panel trycktes om från Feaster et al.17. De vita pilarna indikerar kanten på hydrogelsubstratet, 4x förstoring. Skalstång = 1 mm. Förkortning: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Figur 4: Karakterisering av 2D hiPSC-CM monolayer kontraktila egenskaper. (A) Representativ kontraktionsregistrering av 2D hiPSC-CMs tempo vid 1 Hz (5 V). (B) Representativa kontraktionsspår som visar en kontraktionscykel. (C) Sammanfattande stapeldiagram. Data är medelvärde ± SEM. n = 18. Förkortning: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Figur 5: Akut effekt av CCM på 2D hiPSC-CM kontraktila egenskaper. (A) Representativ kontraktionsregistrering för före CCM (5 V), under CCM (10 V) och efter CCM (5 V). (B) Representativa kontraktionsspår av de omedelbara effekterna (dvs. sista före-CCM-slag, första CCM-slag och första efter-CCM-slag, indikerat med +). (C) Sammanfattande stapeldiagram över de omedelbara effekterna. Procentuell förändring, data är medelvärde ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Figur 6: Effekt av extracellulär kalciummodulering på CCM-svaret. a) Representativa kontraktionsspår av de omedelbara effekterna för varje grupp före kaustik kalcinerad magnesiumoxid (5 V), under kaustik magnesiumoxid (10 V) och efter kastik magnesiumoxid (5 V). hiPSC-CMs utsattes för ökande koncentrationer av extracellulärt kalcium (Cao) på 0,25-2 mM. (B-D) Transformerade data (sigmoidal) för att vägleda ögat som visar effekten av CCM på kalciumkänsligheten hos kontraktila egenskaper (dvs. amplituden och kinetiken) (sluttning = 1,0). n = 6-8 per grupp. Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Figur 7: Farmakologisk utmaning. Representativa kontraktionsspår för varje grupp före CCM (5 V), under CCM (10 V) och efter CCM (5V); hiPSC-CM förbehandlades med (A) vehikel eller (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Sammanfattande stapeldiagram för varje villkor. Procentuell förändring, data är medelvärde ± SEM. n = 10 per grupp. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Figur 8: Akut effekt av CCM på kontraktila egenskaper hos sjuka 2D hiPSC-CMs. (A) Representativt kontraktionsspår för DCM L35P, kontrollbaslinje (före, 6 V) och DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Sammanfattande stapeldiagram. Procentuell förändring, data är medelvärde ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering; DCM = dilaterad kardiomyopati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande video S1: Timelapse av hiPSC-CMs på den extracellulära matrisbaserade hydrogelen. Tvådimensionella hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet; Tid: 0-90 h; en brunn av en 48-brunns glasbottenplatta; 4x förstoring. HiPSC-CM bildar ett horisontellt monolagersynkytium (dvs vänster till höger). Skalstång = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande video S2: hiPSC-CMs på den extracellulära matrisbaserade hydrogelen. Tvådimensionella hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet; Tid: ~ 24 h; en brunn av en 48-brunns glasbottenplatta; 4x förstoring. HiPSC-CMs bildar monolagermorfologi och visar robust sammandragning vid ~ 24 h efter plätering. Skalstång = 1 mm. Denna video är från Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Efter</td>
		</tr><tr><td>Amplitud</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid till topp 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid till topp 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid till baslinje 50 %</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Tid till baslinjen 90 %</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Kontraktionstid 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Kontraktionstid 50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Kontraktionstid 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Kontraktila egenskaper. Procentuell förändring jämfört med före CCM (5 V); data är medelvärde ± SEM för alla slag i varje grupp under CCM (10 V) och efter CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denna tabell har återgivits från Feaster et al.17.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Här demonstrerar vi en icke-invasiv metod för utvärdering av kontraktilitet för hjärtmedicinsk utrustning med användning av 2D-humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) monolager, pläterade på ett flexibelt substrat, i kombination med videobaserad mikroskopi. Detta verktyg kommer att vara användbart för in vitro-utvärdering av kontraktila egenskaper hos hjärtelektrofysiologiska enheter.

Utvärdering av hjärtkontraktilitetsmoduleringsterapi i 2D-humana stamcellshärledda kardiomyocyter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Office of Science and Engineering Laboratories vid FDA utvecklar regulatoriska vetenskapliga verktyg för att hjälpa utvecklare av medicintekniska produkter och FDA-granskare. Vårt yttersta mål är att påskynda patienternas tillgång till innovativa, säkra och effektiva medicintekniska produkter genom bästa tillgängliga vetenskap. I detta protokoll tillämpar vi avancerad inducerad pluripotent stamcellsteknik för bedömning av medicintekniska produkter som används för att behandla livshotande hjärtsjukdomar.Detta enkla verktyg möjliggör reproducerbar utvärdering av hjärtelektrofysiologiska enheter i skålen med hjälp av standard laboratorieutrustning. Det kan också användas med patientspecifika celler som härrör från givare med olika hjärtsjukdomar. För att börja, platta de tinade humana iPSC-härledda kardiomyocyterna på 0,1% gelatinbelagda sterila sexbrunnsplattor minst två dagar före sådd av kardiomyocyterna på det flexibla hydrogelsubstratet.Odla de humana iPSC-härledda kardiomyocyterna i standardkardiomyocytmedium i två till fyra dagar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för att låta dem återhämta sig från kryokonserveringen. Uppdatera det förbrukade mediet med 100% kardiomyocytmedium var 48: e timme. Kontrollera statusen för humana iPSC-härledda kardiomyocyter före dissociation genom att utvärdera cellernas hälsa, säkerställa livskraft och stabil slagning.Tvätta kardiomyocyterna med fyra milliliter per brunn DPBS utan kalciumklorid eller magnesiumklorid. Tillsätt en milliliter dissociationsreagens vid rumstemperatur till varje brunn och inkubera i 15 minuter vid 37 grader Celsius. Tillsätt sedan 10 ml kardiomyocytmedium till ett sterilt 15 ml koniskt rör.Dissociera kardiomyocyterna från sexbrunnsplattorna med en 1 000 mikroliter pipett och tillsätt cellsuspensionen till det koniska röret. Skölj brunnarna med en milliliter färskt kardiomyocytmedium för att samla eventuella kvarvarande kardiomyocyter och tillsätt dem till det koniska röret. Ta sedan den slutliga volymen av det koniska röret till 15 ml med mediet.Centrifugera röret vid 200 G i fem minuter och ta bort supernatanten upp till en milliliter. Resuspendera cellerna i kardiomyocytmediet till en slutlig volym på fem milliliter och räkna kardiomyocyterna med en manuell eller automatiserad cellräknare. Därefter inkubera kardiomyocytcellsuspensionen i ca 30 minuter vid rumstemperatur medan de flexibla hydrogelsubstraten framställs.Förbered en 20 mikroliters pipettuppsättning på en mikroliter, pipettspetsar, en steril 48-brunns glasbottenplatta och en stoppurstimer i vävnadsodlingshuven. Blanda den extracellulära matrisen eller ECM-baserade hydrogelsubstratet genom att försiktigt knacka på röret och omedelbart placera det tillbaka på is. Starta stoppurstimern omedelbart innan du pläterar det första hydrogelsubstratet och markera detta som tid noll.Pipettera en mikroliter av hydrogelsubstratet upp och ner ungefär tre gånger för att kyla pipettspetsen. Applicera sedan ungefär en mikroliter av det outspädda hydrogelsubstratet horisontellt på botten av varje brunn i 48-brunnsplattan och håll pipetten i 45 graders vinkel. Platta alla hydrogelsubstrat i samma orientering i varje brunn för att identifiera substratet när experimenten utförs vid 40X förstoring.Placera locket på 48-brunnsplattan och låt hydrogelsubstraten inkubera i åtta till 10 minuter vid rumstemperatur i vävnadsodlingshuven innan cellerna tillsätts. Efter inkubationen frö omedelbart kardiomyocyterna droppvis direkt på hydrogelsubstraten med cirka 30 000 livskraftiga kardiomyocyter per brunn i en låg medelvolym av cirka 200 mikroliter kardiomyocytmedium. Efter stängning av locket, låt kardiomyocyterna inkubera ostört i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur i huven så att cellerna kan fästa vid hydrogelsubstratet.Tillsätt försiktigt 100 mikroliter färskt kardiomyocytmedium till varje brunn. Placera locket på en inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i två till fyra dagar. Slå på mikroskopet och miljökontrollkammaren för att balansera till 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Ta bort kardiomyocytmediet från 48-brunnsplattan och skölj försiktigt varje brunn två gånger med 600 mikroliter hjärtkontraktilitetsmodulering eller CCM-analysmedium. Tillsätt sedan 300 mikroliter CCM-analysmedium per brunn och placera 48-brunnsplattan på mikroskopet i miljökontrollkammaren. Sätt in elektroderna och balansera cellerna i fem minuter.För att spela in sammandragningsvideor med videobaserad mikroskopi, öppna videoinspelningsprogrammet och ställ in en bildhastighet på 100 bilder per sekund. Välj sedan en region av intresse eller ROI nära mitten av hiPSC-CM-monolagret. Sedan fält stimulera cellerna med en kommersiell pulsgenerator för att elektriskt takta 2D-kardiomyocyterna monolager.Placera kardiomyocyten vid 1,5 gånger tröskeln vid en hertz med baslinjepulsparametrar. Till exempel monofasiska fyrkantvågspulser med en två millisekunders stimulanspulsvaraktighet på fem volt. Spela in videon om endast kontraktion av baslinjetempot före CCM i minst fem slag.Stimulera sedan kardiomyocyterna monolager med en experimentell elektrisk signal med 30 millisekunders fördröjning, två symmetriska bifasiska pulser med 5,14 millisekunders fasvaraktighet, med 20,56 millisekunder total varaktighet, 10 volt fasamplitud och noll interfasintervall. Spela in den CCM-inducerade kontraktionsvideon i minst fem slag. Stäng av CCM-signalen, stimulera med en baslinjepuls och spela in en sammandragningsvideo av återhämtningsperioden efter CCM i minst fem slag.Använd en standardkontraktionsprogramvara för att analysera kontraktionsvideorna automatiskt och kvantifiera de viktigaste kontraktila egenskaperna som kontraktionsamplitud, kontraktionslutning, avkopplingslutning, tid till topp, tid till baslinje 90% och kontraktionstid 50%2D-humana iPSC-härledda kardiomyocyter monolageravtalsegenskaper karakteriserades och nyckelparametrarna för kardiomyocytkontraktilitet kvantifierades. Tillämpningen av standard CCM-stimuleringsparametrar resulterade i förbättrade kontraktila egenskaper in vitro. Effekterna av extracellulär kalciumkoncentrationsmodulering på humana kontraktila egenskaper med och utan CCM-stimulering utvärderades.Det förväntade baslinjekalciumberoendet av kontraktion observerades, liksom en CCM-inducerad ökning av kalciumkänsligheten vid nivån av kardiomyocytmonolagret. Dessutom avslöjade den farmakologiska undersökningen av betaandrogen signalväg att de CCM-inducerade inotropa effekterna delvis medierades av beta-adrenerg signalering. Dessutom kan detta verktyg utvidgas till patientspecifika sjukdomskardiomyocyter, inklusive de av dilaterad kardiomyopati för att förstå effekten av CCM i samband med sjukdomstillstånd.Här fokuserar vi främst på att utvärdera mänskliga kontraktila egenskaper. Men med hjälp av detta verktyg kan man också utvärdera andra hjärtexcitationskontraktionskopplingsavläsningar inklusive åtgärdspotentialer och kalciumhantering. Detta är det första regulatoriska vetenskapliga verktyget som kombinerar inducerad pluripotent stamcell med teknik med bedömning av hjärtenheter.Denna alternativa metod banar väg för att medicintekniska produkter ska bedömas i en maträtt och har potential att minska behovet av djur- och djurförsök.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapsling av Cardiomyocytes i en Fibrin Hydrogel för hjärtvävnad Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiska Rekonstruktioner av Human Cardiac vensystemet med Contrast-datortomografi av Perfusion-fasta prover

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Beredning av Mesh-formade Engineered Hjärt vävnader som härrör från mänskliga iPS-celler för In Vivo hjärtinfarkt Reparation

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Tillverkning av 3D Cardiac Microtissue Arrays med mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter, hjärtfibblaster och endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induktion av humantandkött stamceller mot bukspottskörtelstammar

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...