Name: evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Bu çalışma kısmen, Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından yönetilen Cihazlar ve Radyolojik Sağlık Merkezi'ndeki Araştırma Katılım Programı'na, ABD Enerji Bakanlığı ile ABD Gıda ve İlaç İdaresi arasındaki kurumlar arası bir anlaşma ile atanmasıyla desteklenmiştir. Yazarlar Richard Gray, Trent Robertson ve Anna Avila'ya önerileri ve teknik yardımları için teşekkür eder. Çalışma, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, Bilim ve Mühendislik Laboratuvarları Ofisi tarafından finanse edildi.

1. Plakaların ve ortamların hazırlanması
NOT: Tipik bir hücre dışı matris (ECM) bazlı hidrojel alikot, -20 ° C'de depolanan steril bir 1.5 mL tüp içinde ~ 200 μL'dir.
<ol><li>Steril bir doku kültürü davlumbazında, her bir oyuğa 2 mL% 0.1 jelatin (Malzeme Tablosu) aktararak steril bir 6 delikli plaka hazırlayın. Kapağı 6 delikli plakaya yerleştirin ve kaplanmış plakanın en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe olmasına izin verin.</li>
	<li>HiPSC-CM'leri esnek hidrojel substrat üzerine tohumlamadan bir gün önce, buzdolabında buz üzerinde bir hidrojel (Malzeme Tablosu) aliquot çözülür.</li>
	<li>500 mL RPMI 1640, 10 mL 50x B-27 Takviyesi ve 5 mL penisilin-streptomisin9'u karıştırarak kardiyomiyosit ortamını (Malzeme Tablosu) hazırlayın.</li>
</ol>2. Kriyokorunmuş hiPSC-CM'lerin tohumlanması
<ol><li>HiPSC-CM'leri esnek hidrojel substrat üzerine tohumlamadan iki gün önce, hiPSC-CM'leri %0,1 jelatin kaplı steril 6 delikli plakalar üzerine önceden plakalayın. Standart bir çözme protokolü 9,25 kullanarak hiPSC-CM'leri çözün.</li>
	<li>Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre kuyu başına toplam 1.500.000 hiPSC-CM (Malzeme Tablosu) plakası (Şekil 1A)26.</li>
	<li>HiPSC-CM'lerin kriyoprezervasyondan 37 ° C ve% 5 CO 2'de iyileşmesini sağlamak için hiPSC-CM'leri standart kardiyomiyosit ortamında 2-4 gün boyuncakültürleyin. Harcanan ortamı her 48 saatte bir% 100 kardiyomiyosit ortamı ile yenileyin.</li>
</ol>3. Önceden kaplanmış hiPSC-CM'lerin ayrıştırılması ve sayılması
<ol><li>Ayrışmadan önce hiPSC-CM'lerin durumunu kontrol edin. HiPSC-CM'lerin sağlığını değerlendirin, canlılık ve istikrarlı dayak sağlayın. NOT: HiPSC-CM popülasyonunun saflığı önemlidir (örneğin, >%90 kardiyak troponin T)7. Hidrojel substratın kardiyomiyosit olmayan hücreler tarafından bozulmasını azaltmak için bir kardiyomiyosit seçim yöntemi (örneğin, metabolik seçim veya sıralama) önerilir25,26.</li>
	<li>HiPSC-CM'leri CaCl 2 veya MgCl2 (Malzeme Tablosu) olmadan D-PBS kuyusu başına 4 mL ile2 kat yıkayın. D-PBS'yi aspire edin, her bir oyuğa 1 mL oda sıcaklığı ayrışma reaktifi ekleyin ve ardından 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Steril 15 mL konik tüpe 10 mL kardiyomiyosit ortamı ekleyin.</li>
	<li>HiPSC-CM'leri 6 delikli plakadan 1.000 μL pipetle ayırın (Şekil 1B). Hücre süspansiyonunu 15 mL konik tüp26'ya ekleyin.</li>
	<li>Artık hiPSC-CM'leri toplamak için kuyuyu 1 mL taze kardiyomiyosit ortamı ile durulayın ve bunları 15 mL konik tüpe ekleyin. Konik tüpün son hacmini 15 mL'ye getirin.</li>
	<li>5 dakika (200 × g) santrifüj. Süpernatantı 1 mL işaretine kadar çıkarın. Kardiyomiyosit ortamındaki hücreleri 5 mL'lik son bir hacme kadar askıya alın.</li>
	<li>HiPSC-CM'leri manuel veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın.</li>
	<li>Esnek hidrojel substratlar hazırlanırken hiPSC-CM süspansiyonunu oda sıcaklığında inkübe edin (maksimum 30 dakika).</li>
</ol>4. Esnek hidrojel substratların hazırlanması
<ol><li>1 μL'de ayarlanmış 20 μL'lik bir pipet, 20 μL pipet uçları (ör. 20 μL) ve steril 48 delikli cam alt plaka hazırlayın. Hidrojel substratları yapmadan önce bir kronometre/zamanlayıcının hazır olduğundan emin olun.</li>
	<li>Steril doku kültürü davlumbazında, ECM bazlı hidrojel substratı tüpe hafifçe dokunarak karıştırın ve hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Ardından, ilk hidrojel substrat kaplanmadan hemen önce kronometreyi / zamanlayıcıyı başlatın - bu sıfır zamanıdır.</li>
	<li>Pipet ucunu soğutmak için hidrojel substratın 1 μL'si ~3x yukarı ve aşağı pikap eder. Seyreltilmemiş hidrojel substratın ~1 μL'sini, pipeti 45° açıyla tutarak 48 delikli plakanın her bir kuyucuğunun dibine yatay olarak uygulayın (Şekil 1C, Şekil 2A ve Şekil 3A). Deneyleri 40x büyütme 7,9,17,27'de gerçekleştirirken substratın tanımlanmasına yardımcı olmak için tüm hidrojel substratlarını her bir kuyucukta aynı yönde (Şekil 2 ve Şekil 3) plakalayın. NOT: Her ~1 μL hattı bir hidrojel substrattır (Şekil 3). Tipik olarak, 48 kuyu hazırlamak ~ 5 dakika sürer. Yatay olarak eğilmiş bir mikro plaka standının (örneğin, 30 °) kullanılması, kuyunun tabanının ve hidrojel substratın daha iyi görülmesini sağlayabilir. Kuyunun tüm uzunluğuna (yani soldan sağa) gittiğinizden emin olun. Kısa hidrojel substratlar çok kalın olabilir, böylece substrat stabilitesini azaltır. Hidrojel substratın pipet ucunda kurumasına izin vermeyin. Bu durumda, hızlı bir şekilde yeni bir uca geçin ve hemen devam edin. Alternatif olarak, soğutulmuş pipet uçları kullanılabilir. ECM bazlı hidrojel substrat, buz üzerinde olmadığında hızla polimerize olabilir. Bir seferde birkaç kuyunun hazırlanması (örneğin, 10) önerilmektedir. Ek olarak, sahte bir 48 kuyucuklu plakada pratik yapmanız önerilir.</li>
	<li>Kapağı 48 delikli plakaya yerleştirin ve hücreleri eklemeden önce hidrojel substratların steril doku kültürü davlumbazındaki oda sıcaklığında 8-10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin (Şekil 2B). NOT: Önerilen kuluçka sürelerine uymak önemlidir. 10 dakikadan fazla bir kuluçka süresi, sert hidrojel substratlara ve görünür kasılmalara yol açmayacaktır. 8 dakikadan daha kısa bir kuluçka süresi, çöken substratlara yol açabilir.</li>
	<li>1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, hiPSC-CM'leri derhal doğrudan hidrojel substratların üzerine damla damla tohumlayın, kuyu başına ~30.000 canlı hiPSC-CM, ~200 μL kardiyomiyosit ortamının düşük orta hacminde (Şekil 2B ve Şekil 3B). NOT: Bu işlem, hidrojel substrat polimerizasyonunu durdurur ve hiPSC-CM'lerin7,9,17,27 substratında olmasını sağlar.</li>
	<li>Kapağı plakaya yerleştirin ve hiPSC-CM'lerin hidrojel substrata yapışmasını sağlamak için hiPSC-CM'lerin steril doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca bozulmadan inkübe etmesine izin verin (Şekil 2C).</li>
	<li>Her bir oyuğa yavaşça ~ 100 μL taze kardiyomiyosit ortamı ekleyin (son hacim: kuyucuk başına ~ 300 μL). Kapağı plakaya yerleştirin ve 2-4 gün boyunca% 5 CO2 olan 37 ° C'de bir inkübatöre aktarın. Kasılma deneyleri yapılmadan önce her 24 saatte bir% 100 ortamı yenileyin. NOT: Doğru morfoloji için hiPSC-CM'leri görsel olarak inceleyin; Kaplamadan hemen sonra, hiPSC-CM'ler yuvarlak görünmelidir (Şekil 3B). Tohumlamadan sonraki 2. günde, sağlam görünür kasılma (Ek Video S2) ile akıcı bir 2D hiPSC-CM tek katmanlı sinsityum gözlenecektir (Şekil 3C) (Ek Video S1).</li>
</ol>5. Kasılma kaydı ve analizi
<ol><li>Aşağıdakileri içeren Tyrode çözeltisi olan CCM test ortamını hazırlayın (mmol / L cinsinden): CaCl 2 0.5, NaCl 134, KCl 5.4, MgCl2 1, glikoz 10 ve HEPES 10, pH NaOH ile 7.4'e ayarlanır ve bir su banyosunda 37 ° C'ye dengelenir. NOT: CCM tahlil penceresini geliştirmek için submaksimal hücre dışı kalsiyum (0,5 mM) kullanılır.</li>
	<li>37 °C ve %5 CO2'ye dengelemek için mikroskop ve çevresel kontrol odasını açın.</li>
	<li>Kardiyomiyosit ortamını 48 delikli plakadan çıkarın ve her bir oyuğa 600 μL CCM tahlil ortamı ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Kuyu başına 300 μL CCM tahlil ortamı ekleyin ve 48 kuyucuklu plakayı çevresel kontrol odasındaki mikroskop üzerine yerleştirin. Elektrotları yerleştirin ve hücreleri 5 dakika boyunca dengeleyin.</li>
	<li>Kasılma videolarını kaydetmek için video tabanlı mikroskopi kullanın. Video kayıt yazılımını açın ve 100 kare / sn kare hızını ayarlayın. hiPSC-CM tek katmanının merkezine yakın bir ilgi alanı (ROI) seçin. NOT: hiPSC-CM monokatmanlarının kenarına yakın bir yatırım getirisi seçmeyin, çünkü bu kasılma kayıtları için kararsız olabilir.</li>
	<li>Daha sonra, alan, 2D hiPSC-CM monolayer'larını elektriksel olarak hızlandırmak için hücreleri ticari bir darbe jeneratörü (Malzeme Tablosu) ile uyarır. Temel darbe parametreleriyle 1 Hz'de 1,5x eşiğinde hiPSC-CM'leri hızlandırın (örneğin, 2 ms uyaran darbe süresi ~14 V/cm olan monofazik kare dalga tempolu darbeler)17.</li>
	<li>En az beş vuruş 17,28 için yalnızca (yani, CCM'den önce) (Şekil 1D) daralma videosunu hızlandırarak taban çizgisini kaydedin.</li>
	<li>Ardından, hiPSC-CM tek katmanını deneysel bir elektrik sinyaliyle uyarın (Şekil 1D). Bu protokolü takip etmek için standart CCM stimülasyon parametrelerini kullanın: 5.14 ms faz süresine (20.56 ms toplam süre), ~28 V / cm (faz genliği), sıfır fazlar arası aralık ve 30 ms gecikme (yani, pacing darbesinin sonundan CCM darbesinin başlangıcına kadar geçen süre) iki simetrik bifazik darbesi (Şekil 1D) 29,30 tıklatın ve CCM kaynaklı kasılma videosunu en az beş vuruş için kaydedin.</li>
	<li>CCM sinyalini kapatın, temel bir tempo darbesiyle uyarın ve en az beş vuruş için iyileşme döneminin (yani CCM'den sonra) bir daralma videosunu kaydedin.</li>
	<li>Kasılma videolarını otomatik olarak analiz etmek ve temel kasılma özelliklerini (örneğin, kasılma genliği, büzülme eğimi, gevşeme eğimi, tepe noktasına kadar geçen süre, taban çizgisine kadar geçen süre% 90 ve büzülme süresi% 50) ölçmek için standart büzülme yazılımı kullanın 7,17,31,32.</li>
	<li>Substrat üzerine kaplandıktan sonra 2-14. günlerden itibaren kontraktil deneyler için esnek hidrojel substrat üzerindeki 2D hiPSC-CM'leri kullanın.</li>
</ol>

Bu makale yazarların görüşlerini yansıtmaktadır ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi'nin görüşlerini veya politikalarını temsil edecek şekilde yorumlanmamalıdır. Ticari ürünlerin, kaynaklarının veya burada bildirilen materyalle bağlantılı olarak kullanımlarının belirtilmesi, Sağlık ve İnsani Hizmetler Bakanlığı tarafından bu tür ürünlerin gerçek veya zımni bir onayı olarak yorumlanmamalıdır. Yazarlar bu çalışma için rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Burada özetlenen protokol, ticari reaktifler7,17 ile esnek bir hücre dışı matris (ECM) bazlı hidrojel substrat üzerinde sağlam bir şekilde büzülen 2D hiPSC-CM monokatmanları oluşturmak için bir yöntemi açıklamaktadır. Esnek hidrojel substrat üzerine tohumlanan hiPSC-CM'ler canlı kalır ve gelişmiş kontraktil özelliklere sahiptir7. Bu teknik, standart laboratuvar ekipmanlarına ve yeteneklerine dayanır7. Protokolde, ECM bazlı hidrojel substrat ile çalışma da dahil olmak üzere, detaylara dikkat edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Potansiyel bir sorun, ortamda serum varlığıdır. Bu, hiPSC-CM'lerin birleşik tek katmanlı bir tabaka yerine ağlar (örneğin, endotelyal / vasküler ağlar) oluşturmasına neden olabilir; Bu nedenle, esnek hidrojel hiPSC-CM monokatmanlarının kurulması sırasında serumsuz bir ortam önerilir (yani, gün 0 ila gün 4). Benzer şekilde, aynı anda çok fazla hidrojel substrat hazırlamak, operatör yorgunluğu nedeniyle zayıf veya düzensiz substratlara neden olabilir. Hızlı çalışmak önemli olsa da, her hidrojel substratın bütünlüğü kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, hiPSC-CM'leri dikkatlice tohumlamalı ve ortamı değiştirmelidir; bu zorla yapılmamalıdır. Ortamı değiştirirken, hidrojel substratını veya hücreleri bozmamak için kuyunun üst kenarından yavaşça eklenmelidir. Standart 2D hiPSC-CM kültürlerinde olduğu gibi (yani, geleneksel doku kültürü plastik veya cam), düşük yoğunlukta kaplama, eksik tek katmanlı oluşuma neden olacaktır. Hidrojel substrat üzerinde olduklarını doğrulamak için hiPSC-CM'leri görsel olarak incelemek ve doğru zamanlamayı sağlamak için bir zamanlayıcı kullanmak önemlidir. Ayrıca, 2D hiPSC-CM monokatmanlarının hidrojel substrat üzerinde 14 günden fazla kültürlenmesi, ECM özelliklerine ve substrat üreticisinin talimatlarına bağlı olarak tek katmanlı bozulmaya neden olabilir.
Mevcut yöntemde dikkate alınması gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, bu protokolde kullanılan hücreler ticari bir hiPSC-CMs sağlayıcısındandı ve bu hücreler elektriksel olarak bağlanmış hücrelerin bir sinsityumunu oluşturur. Sinsityum, üç kardiyak alt tipin hepsinden (yani ventriküler, atriyal ve nodal) hiPSC-CM'lerin bir karışımını içerir17. Çalışmalar, alt tipe özel bir hiPSC-CM popülasyonundan (yani,% 100 ventriküler veya% 100 atriyal) yararlanabilir. İkincisi, bu yöntem sadece hiPSC-CM'leri kullanırken, kardiyak fibroblastlar, endotel hücreleri ve nöronlar dahil olmak üzere miyosit olmayanlar hiPSC-CM işlevselliğini artırabilir22,36. Üçüncüsü, 2D hiPSC-CM'ler, spontan atma, amorfik morfoloji ve inotropik yanıt eksikliği de dahil olmak üzere nispeten olgunlaşmamış kardiyomiyositlerin çeşitli özelliklerini gösterir 8,37. Dördüncüsü, bu protokol sağlam bir şekilde büzülen 2D hiPSC-CM monokatmanları üretirken, mühendislik kalp dokuları (EKT'ler) gibi işlevsel olarak geliştirilmiş 3D hiPSC-CM modellerinin, fizyolojik kalsiyum konsantrasyonları8,38 altında gelişmiş bir CCM kaynaklı kontraktil yanıt ile sonuçlanması muhtemeldir. Son olarak, burada açıklanan protokol 48 kuyucuklu bir format için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, optimizasyon ve otomasyonun dahil edilmesiyle, bu yüksek verimli bir biçime (örneğin, 96 delikli veya 384 delikli plakalar) ölçeklendirilebilir.
HiPSC-CM çalışmaları için mevcut altın standart, geleneksel sert 2D kültür koşullarıdır (yani, doku kültürü plastik veya cam). Elektrofizyoloji3 ve kalsiyum işleme39 çalışmaları için yararlı olsa da, geleneksel metodoloji minimum kontraktil özellikler 5,6,7 ile sonuçlanır. Sonuç olarak, geleneksel katı 2D kültür koşulları, CCM kontraktil etkilerinin değerlendirilmesine uygun değildir8. İşlevsel olarak geliştirilmiş 3D hiPSC-CM ECT yöntemleri38 teknik olarak zorlayıcıdır, zaman alıcıdır ve her laboratuvarda kolayca bulunamayan sofistike ekipmanlar gerektirir. Bu protokolde, 3D ECT yöntemlerinden veya uzun vadeli, geleneksel 2D yöntemlerden 7,40,41'den daha kısa bir zaman diliminde sağlam bir şekilde daralan 2D hiPSC-CM monokatmanları oluşturmak için basit bir metodoloji açıklıyoruz. Ayrıca, burada kullanılan reaktifler, hidrojel substrat ve hiPSC-CM'ler de dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilir ve her ikisi de önemli ölçüde lottan partiye tutarlılığa sahiptir. Çıkarılabilir platin tel elektrotlar (elektrot arası mesafe: 2,0 mm, genişlik: 1,0 mm) kullanırken, çeşitli elektrot malzemeleri ve konfigürasyonları in vitro 8,15,17,18,22 CCM kontraktil değerlendirmelerine uygundur. Benzer şekilde, 7,31,32 kasılmavideolarının analizini sağlayan birden fazla otomatik yazılım mevcuttur.
Kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesini değerlendirmek için klinik olmayan yöntemlerin çoğunluğu büyük ölçüde pahalı in vivo hayvan modellerine (örneğin, köpekler veya domuzlar) ve teknik olarak zorlu papiller kas şeritlerine (örneğin, tavşanlar) dayanır18. Bu yazıda, kardiyak elektrofizyoloji tıbbi cihaz sinyallerinin kontraktilite üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir insan in vitro modeli tanımlanmıştır. Bu araç, hayvan çalışmalarına bağımlılığı azaltabilir ve kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kontraktil özelliklerinin in vitro değerlendirilmesi için yararlı olabilir.

Amerika Birleşik Devletleri nüfusu yaşlandıkça, kalp yetmezliği hastalarının sayısı artmaya devam ediyor ve doğrudan tıbbi maliyetler 1,2. Kalp yetmezliğini tedavi etmek için yeni tedaviler ve bu tür tedavileri test etmek için yenilikçi klinik olmayan metodolojiler geliştirmeye kritik bir ihtiyaç vardır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), terapötik gelişim sürecine yardımcı olmak için in vitro bir araç olarak önerilmiş ve düzenleyici sunumlarda kullanılmıştır 3,4. Bununla birlikte, standart sert 2D kültür koşullarında (yani, geleneksel doku kültürü plastik veya cam) kaplandığında sağlam kasılma özelliklerinin bulunmaması nedeniyle kontraktilite çalışmaları için yaygın kullanımları sınırlandırılmıştır5,6,7,8. Daha önce, sağlam görünür kasılma özellikleri 9 üretmek için izole edilmiş tek hiPSC-CM'lerin esnek bir hidrojel substrat üzerine kaplanmasının faydasınıgöstermiştik. İzole hiPSC-CM'lerin, yeni izole edilmiş yetişkin tavşan ventriküler kardiyomiyositlerininkilerle karşılaştırılabilir kontraktil özelliklere sahip olduğunu gösterdik. Ayrıca, bu yöntemin farmakolojik ajanlara kontraktil yanıtları değerlendirmedeki yararlılığını gösterdik7. Ayrıca, diğer çalışmalar bu teknolojiyi temel bilim ve hastalık modellemesi için mekanik değerlendirmelere uygulamıştır10,11,12. Burada, bu metodoloji 2D hiPSC-CM monokatmanlarına genişletilmiştir ve fizyolojik olarak ilgili kardiyak kontraktilite modülasyonu (CCM) tıbbi cihaz elektrik sinyallerinin in vitro olarak değerlendirilmesindeki faydası gösterilmiştir.
CCM, uyarıcı olmayan elektrofizyolojik sinyallerin kardiyak siklusun mutlak refrakter periyodu sırasında miyokarda iletildiği bir intrakardiyak kalp yetmezliği tedavisidir13,14. İnsan kalp hücresi modellerinde CCM'yi değerlendirmek için tekrarlanabilir yöntemler eksiktir. Önceki çalışmalar, CCM kasılma yanıtını değerlendirmek için çeşitli kardiyak hücre modelleri kullanmıştır. Taze izole edilmiş tavşan ventriküler kardiyomiyositlerinin CCM stimülasyonuna kalsiyum ve kasılma genliğinde geçici bir artış ile yanıt verdiğini in vitro olarak gösterdik15. İzole köpek ventriküler kardiyomiyositlerinde yapılan bir başka çalışmada, hücre içi kalsiyum geçici genliğinin CCM kaynaklı olarak arttığıgösterilmiştir 16. Bununla birlikte, CCM çalışmalarının çoğunluğu ex vivo ve in vivo hayvan preparatları kullanmıştır. Bu çalışmaların birbirleriyle ilişkilendirilmesi zordur, çünkü çeşitli CCM nabız parametreleri ve tür17 uygularlar. İzole edilmiş bir tavşan papiller modelindeki bir çalışma, CCM kaynaklı kontraktilitenin8,18 arttığını ve bir dizi tüm kalp çalışmasının CCM kaynaklı kontraktil fonksiyonunarttığını göstermiştir 19,20,21. Bu çalışmalar önemli mekanik içgörüler sağlamıştır. Bununla birlikte, CCM de dahil olmak üzere in vitro kardiyak EP kontraktil çalışmaları için tekrarlanabilir insan modellerinin eksikliği vardır. Bu amaçla, birkaç 2D ve 3D hiPSC modeli geliştirdik ve kasılma özelliklerinin CCM kaynaklı gelişimini parametreye bağlı bir şekilde gösterdik. Ayrıca, CCM kaynaklı inotropik etkilerin kısmen nöronal girdi ve β-adrenerjik sinyalleme 8,17,22 aracılık ettiği bulunmuştur. Yine de, CCM tedavisinin mekanizmaları hakkında daha fazla şey bilinmesi gerekir ve sözleşmeli insan kardiyomiyositlerinin kullanılması bu sonuca ulaşmada yardımcı olabilir. Bu nedenle, yeni CCM cihazlarını ve sinyallerini değerlendirmek, düzenleyici süreci hızlandırmak, hayvan modelleri üzerindeki yükü azaltmak ve cihaz geliştiricisinin karar vermesine yardımcı olmak için insan klinik olmayan araçlar geliştirmeye önemli bir ihtiyaç vardır 8,17,23,24. Herhangi bir laboratuvara aktarılabilen ve maliyetleri düşürmek için standart ekipman ve düşük hücre gereksinimleri kullanan kolay, kendin yap protokolleri geliştirmek önemlidir. Bu yöntem, CCM stimülasyonunun insan kardiyomiyosit fonksiyonu üzerindeki etkilerini aydınlatır ve CCM güvenliği veya etkinliği hakkında önemli bilgiler sağlar17. Burada, sağlık ve hastalıkta akut kardiyak elektrofizyoloji tıbbi cihaz (yani CCM) kontraktil yanıtlarını ölçmek için standartlaştırılmış klinik olmayan bir araç üretmek için esnek bir hidrojel substrat üzerinde 2D hiPSC-CM monokatmanları üretme yöntemini açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) şu anda çoklu in vitro uygulamalar için araştırılmakta ve düzenleyici sunumlarda kullanılmaktadır. Burada, kullanımlarını kardiyak tıbbi cihaz güvenliği veya performans değerlendirmelerine genişletiyoruz. Esnek hücre dışı matriks (ECM) bazlı hidrojel substrat üzerine kaplanmış sağlam bir şekilde büzülen 2D hiPSC-CM'lerin tek katmanlarında kardiyak tıbbi cihaz kontraktil özelliklerini değerlendirmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazı sinyallerinin insan kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerinin (örneğin, kasılma özellikleri) standart laboratuvar ekipmanı ile ölçülmesini sağlar. 2D hiPSC-CM monokatmanları, 48 kuyucuklu bir formatta esnek bir hidrojel substrat üzerinde 2-4 gün boyunca kültürlendi.
HiPSC-CM'ler standart kardiyak kontraktilite modülasyonu (CCM) tıbbi cihaz elektrik sinyallerine maruz bırakıldı ve kontrol (yani sadece pacing) hiPSC-CM'lerle karşılaştırıldı. 2D hiPSC-CM'lerin temel kasılma özellikleri, piksel yer değiştirmeye dayalı video tabanlı algılama analizi ile ölçülmüştür. Esnek hidrojel substrat üzerine kaplanmış CCM ile uyarılmış 2D hiPSC-CM'ler, artmış pik kasılma genliği ve hızlandırılmış kasılma ve gevşeme kinetik de dahil olmak üzere, taban çizgisine göre (yani CCM stimülasyonundan önce) önemli ölçüde gelişmiş kontraktil özellikler göstermiştir. Ayrıca, esnek hidrojel substratın kullanılması, sağlıklı ve hastalıklı hiPSC-CM'lerde video tabanlı kardiyak-uyarma kontraksiyon kaplin okumalarının (yani elektrofizyoloji, kalsiyum işleme ve kasılma) çoklanmasını sağlar. Kardiyak elektrofizyolojik sinyallerin insan kardiyak kontraksiyonu üzerindeki etkilerinin doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, kardiyak tıbbi cihaz geliştirme, optimizasyon ve riskten arındırma için hayati öneme sahiptir. Bu yöntem, klinik olmayan kardiyak tıbbi cihaz güvenliği veya etkinlik testi için değerli olması gereken kardiyak sinsityumun kasılma özelliklerinin sağlam bir şekilde görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar. Bu makalede, 2D hiPSC-CM hidrojel substrat monokatmanları üretme metodolojisi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Bu protokolde açıklanan, esnek bir hidrojel substrat üzerinde gözle görülür şekilde daralan 2D hiPSC-CM monokatmanları oluşturmak için basit ve sağlam bir araçtır. Kasılma özelliklerinin ölçümü, kontraktilite analiz yazılımı ile birlikte video tabanlı kayıt ile gerçekleştirilir. Bu, kasılma genliği, kasılma eğimi, gevşeme eğimi, zirveye kadar geçen süre, başlangıç çizgisine kadar geçen süre% 90 ve kasılma süresi% 50 dahil olmak üzere kardiyomiyosit kontraktilitesinin temel parametrelerinin nicelleştirilmesini sağlar. Model, çeşitli "sağlıklı" donörlerden gelen hiPSC-CM'lerin (Şekil 4) temel kontraktil özelliklerini karakterize etmek için kullanılır ve kardiyak elektrofizyoloji tıbbi cihaz sinyallerinin (yani, CCM) değerlendirilmesine genişletilebilir. Standart CCM stimülasyon parametrelerinin uygulanması (Şekil 1D)29,30, in vitro olarak gelişmiş kontraktil özellikler ile sonuçlanmıştır (Şekil 5 ve Tablo 1)17.
Ayrıca, bu yöntemin, hücre dışı kalsiyum konsantrasyonlarının modülasyonunun CCM stimülasyonu olan ve olmayan insan kontraktil özellikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabileceğini gösterdik (Şekil 6)17. Kasılmanın beklenen başlangıç kalsiyum bağımlılığı 7,17 ve kardiyomiyosit monokatmanı seviyesinde kalsiyum duyarlılığında CCM kaynaklı bir artış gözlenmiştir. Ek olarak, β-adrenerjik sinyal yolunun farmakolojik sorgulanması (Şekil 7), CCM kaynaklı inotropik etkilerin kısmen β-adrenerjik sinyal17 aracılık ettiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, bu araç, CCM'nin hastalık durumları bağlamındaki etkisini anlamak için dilate kardiyomiyopati (DCM) 33,34,35 (Şekil 8) dahil olmak üzere hastaya özgü hastalık kardiyomiyositlerine genişletilebilir; Gerçekten de, burada test edilen CCM "dozunda" artmış kontraktil genlik ve hızlandırılmış kontraksiyon ve gevşeme kinetiği gözlenmiştir (Şekil 8). Laboratuvarımızda CCM taklit cihazı bulunmakla birlikte, burada kullanılan metodoloji o sisteme özgü değildir ve diğer kardiyak elektrofizyoloji cihazlarına da uygulanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Resim 1: 2B hiPSC-CM in vitro CCM modelinin şematik özeti. (A) HiPSC-CM'ler, jelatin (%0,1) kaplı 6 delikli plakalar üzerine tek katmanlı formatta önceden kaplanmıştır. (B) Kültürde 2 gün sonra, hiPSC-CM'ler ayrışır ve esnek bir hidrojel substrat üzerine kaplanmak üzere hazırlanır. (C) İzole edilmiş hiPSC-CM'ler, 48 kuyucuklu bir formatta (solda) dizilmiş hidrojel substratlar üzerinde yüksek yoğunlukta kaplanır ve (0.5 mM) hücre dışı kalsiyum Tyrode çözeltisinde (sağda) test edilir. (D) HiPSC-CM'leri uyarmak için ticari bir darbe üreteci ve standart klinik CCM darbe parametreleri29,30 (sağda) kullanılır; kardiyak fonksiyon video tabanlı analiz ile değerlendirilir (solda). (E) CCM'den önce (temel: 5 V), CCM sırasında (CCM: 10 V) ve CCM'den sonra (kurtarma: 5 V) temsili büzülme kayıtları. Bu rakam Feaster ve ark.17'den yeniden basılmıştır. Kısaltmalar: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit; CCM = kardiyak kontraktilite modülasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Şekil 2: Esnek hidrojel substrat kaplama ve tohumlama şeması. (A) Tamamen çözülmüş, seyreltilmemiş ECM bazlı hidrojel substrat, kuyu başına 1 μL hidrojel substrat (sağ panel) ile steril 48 delikli bir plakaya (sol panel) uygulanır. (B) Hidrojel substratın oda sıcaklığında 8-10 dakika (sağ panel) inkübe edilmesine izin verilir, ardından yüksek yoğunluklu hiPSC-CM'ler düşük orta hacimde (~ 200 μL) (sol panel) kaplanır. (C) 10-15 dakikalık inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa (sol panel) ortam eklenir ve plakalar standart bir doku kültürü inkübatörüne (sağ panel) taşınır. Kısaltmalar: ECM = hücre dışı matris, hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit; RT = oda sıcaklığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Şekil 3: Hücre dışı matris bazlı hidrojel substrat. (A) Substrat kuyuya uygulandıktan hemen sonra 48 delikli cam alt plakanın bir kuyusundaki temsili hidrojel substrat (hücre yok). (B) HiPSC-CM'ler tohumlandıktan sonra zaman 0. (C) HiPSC-CM'ler tohumlandıktan 24 saat sonra zaman. Bu panel Feaster ve ark.17'den yeniden basılmıştır. Beyaz oklar, hidrojel substratın kenarını, 4x büyütmeyi gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Kısaltma: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Şekil 4: 2D hiPSC-CM tek katmanlı kontraktil özelliklerinin karakterizasyonu. (A) 1 Hz'de (5 V) tempolu 2D hiPSC-CM'lerin temsili büzülme kaydı. (B) Bir kasılma döngüsünü gösteren temsili kasılma izleri. (C) Özet çubuğu grafikleri. Veriler ortalama ± SEM. n = 18. Kısaltma: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Şekil 5: CCM'nin 2D hiPSC-CM kontraktil özellikleri üzerindeki akut etkisi. (A) CCM öncesi (5 V), CCM sırasında (10 V) ve CCM'den sonra (5 V) temsili kasılma kaydı. (B) Anlık etkilerin temsili kasılma izleri (yani, CCM vuruşundan önceki son, ilk CCM vuruşu ve CCM vuruşundan sonraki ilk vuruş, + ile gösterilir). (C) Anlık etkilerin özet çubuk grafikleri. Yüzde değişim, veriler ortalama SEM ±. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p 0,0001 <. Bu rakam Feaster ve ark.17'den yeniden basılmıştır. Kısaltmalar: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit; CCM = kardiyak kontraktilite modülasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Şekil 6: Hücre dışı kalsiyum modülasyonunun CCM yanıtı üzerindeki etkisi. (A) CCM'den önce (5 V), CCM sırasında (10 V) ve CCM'den sonra (5 V) her grup için ani etkilerin temsili kasılma izleri; hiPSC-CM'ler 0.25-2 mM'lik artan hücre dışı kalsiyum (Cao) konsantrasyonlarına maruz kaldı. (B-D) CCM'nin kasılma özelliklerinin (yani genlik ve kinetik) kalsiyum duyarlılığı üzerindeki etkisini gösteren gözü yönlendirmek için dönüştürülmüş veriler (sigmoidal) (tepe eğimi = 1.0). n = grup başına 6-8. Bu rakam Feaster ve ark.17'den yeniden basılmıştır. Kısaltmalar: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit; CCM = kardiyak kontraktilite modülasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Şekil 7: Farmakolojik zorluk. CCM'den önce (5 V), CCM sırasında (10 V) ve CCM'den sonra (5V) her grup için temsili büzülme izleri; hiPSC-CM'ler (A) araç veya (B) metoprolol (2 μM) ile ön işlemden geçirildi. (C,D) Her koşul için özet çubuğu grafikleri. Yüzde değişim, veriler ortalama SEM ±. n = grup başına 10. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p 0,0001 <. Bu rakam Feaster ve ark.17'den yeniden basılmıştır. Kısaltmalar: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit; CCM = kardiyak kontraktilite modülasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Şekil 8: CCM'nin hastalıklı 2D hiPSC-CM'lerin kontraktil özellikleri üzerindeki akut etkisi. (A) DCM L35P için temsili kasılma izi, kontrol tabanı (öncesi, 6 V) ve DCM L35P artı CCM (10 V). (B) Özet çubuğu grafikleri. Yüzde değişim, veriler SEM ± ortalamadır. n = 3. *p 0,05 <, **p 0,01 <. Kısaltmalar: hiPSC-CM = insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit; CCM = kardiyak kontraktilitenin modülasyonu; DCM = dilate kardiyomiyopati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video S1: Hücre dışı matris tabanlı hidrojel üzerindeki hiPSC-CM'lerin zaman aşımı. Esnek hidrojel substrat üzerine kaplanmış iki boyutlu hiPSC-CM'ler; Zaman: 0-90 saat; 48 delikli cam alt plakanın bir kuyusu; 4x büyütme. HiPSC-CM'ler yatay tek katmanlı bir sinsityum oluşturur (yani soldan sağa). Ölçek çubuğu = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video S2: hücre dışı matris bazlı hidrojel üzerindeki hiPSC-CM'ler. Esnek hidrojel substrat üzerine kaplanmış iki boyutlu hiPSC-CM'ler; Zaman: ~24 saat; 48 delikli cam alt plakanın bir kuyusu; 4x büyütme. HiPSC-CM'ler tek katmanlı morfoloji oluşturur ve ~ 24 saat sonraki kaplamada sağlam büzülme gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu video Feaster ve ark.17'den alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametre</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Sonra</td>
		</tr><tr><td>Bolluk</td>
			<td>16 ± %4**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Zirveye Ulaşma Süresi %50</td>
			<td>-20 ± %9*</td>
			<td>7 ± %5</td>
		</tr><tr><td>Zirveye Ulaşma Süresi 90%</td>
			<td>-22 ± %8*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Taban çizgisine kadar geçen süre %50</td>
			<td>-8 ± %5</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Taban çizgisine kadar geçen süre 90%</td>
			<td>-12 ± %6*</td>
			<td>5 ± %5</td>
		</tr><tr><td>Kasılma Süresi %10</td>
			<td>-13 ± %6</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Kasılma Süresi %50</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Kasılma Süresi %90</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Kasılma özellikleri. CCM öncesine göre yüzde değişim (5 V); veriler, CCM (10 V) sırasında ve CCM'den (5 V) sonra her gruptaki tüm vuruşlar için SEM'± ortalamadır. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p 0,0001 <. Bu tablo Feaster et al.17'den yeniden basılmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

FDA'daki Bilim ve Mühendislik Laboratuvarları Ofisi, tıbbi cihaz geliştiricilerine ve FDA incelemecilerine yardımcı olmak için düzenleyici bilim araçları geliştirmektedir. Nihai hedefimiz, mevcut en iyi bilim aracılığıyla hastaların yenilikçi, güvenli ve etkili tıbbi cihazlara erişimini hızlandırmaktır. Bu protokolde, hayatı tehdit eden kalp rahatsızlıklarını tedavi etmek için kullanılan tıbbi cihazların değerlendirilmesine en son indüklenmiş pluripotent kök hücre teknolojisini uyguluyoruz.Bu basit araç, standart laboratuvar ekipmanı kullanılarak çanaktaki kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca çeşitli kalp hastalıkları olan donörlerden elde edilen hastaya özgü hücrelerle de kullanılabilir. Başlamak için, çözülmüş insan iPSC'si, kardiyomiyositlerin esnek hidrojel substrat üzerine tohumlanmasından en az iki gün önce% 0.1 jelatin kaplı steril altı kuyucuklu plakalar üzerine kardiyomiyositleri türetilmiştir.Kültür insan iPSC, kriyo-korumadan kurtulmalarını sağlamak için 37 santigrat derecede iki ila dört gün boyunca standart kardiyomiyosit ortamında kardiyomiyositleri ve% 5 karbondioksit ile türetilmiştir. Harcanan ortamı her 48 saatte bir% 100 kardiyomiyosit ortamı ile yenileyin. Hücrelerin sağlığını değerlendirerek, canlılık ve stabil dayak sağlayarak ayrışmadan önce insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin durumunu kontrol edin.Kardiyomiyositleri, kalsiyum klorür veya magnezyum klorür olmadan DPBS kuyusu başına dört mililitre ile yıkayın. Her bir oyuğa bir mililitre oda sıcaklığı ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, steril 15 mililitrelik konik bir tüpe 10 mililitre kardiyomiyosit ortamı ekleyin.Kardiyomiyositleri altı delikli plakalardan 1.000 mikrolitrelik bir pipetle ayırın ve hücre süspansiyonunu konik tüpe ekleyin. Artık kardiyomiyositleri toplamak ve konik tüpe eklemek için kuyucukları bir mililitre taze kardiyomiyosit ortamı ile durulayın. Ardından, konik tüpün son hacmini ortamla birlikte 15 mililitreye getirin.Tüpü beş dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir mililitre işaretine kadar çıkarın. Kardiyomiyosit ortamındaki hücreleri beş mililitrelik son bir hacme kadar askıya alın ve kardiyomiyositleri manuel veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın. Daha sonra, esnek hidrojel substratlar hazırlanırken kardiyomiyosit hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika inkübe edin.Bir mikrolitrede 20 mikrolitrelik bir pipet seti, pipet uçları, steril 48 delikli cam alt plaka ve doku kültürü davlumbazında bir kronometre zamanlayıcısı hazırlayın. Hücre dışı matrisi veya ECM bazlı hidrojel substratı, tüpe hafifçe dokunarak ve hemen tekrar buzun üzerine yerleştirerek karıştırın. İlk hidrojel substratı kaplamadan hemen önce kronometre zamanlayıcısını çalıştırın ve bunu sıfır zamanı olarak işaretleyin.Pipet ucunu soğutmak için hidrojel substratın bir mikrolitresini yaklaşık üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, seyreltilmemiş hidrojel substratın yaklaşık bir mikrolitresini, pipeti 45 derecelik bir açıyla tutarak 48 delikli plakadaki her bir kuyucuğun dibine yatay olarak uygulayın. Deneyleri 40X büyütmede gerçekleştirirken substratın tanımlanmasına yardımcı olmak için tüm hidrojel substratlarını her bir kuyucukta aynı yönde plakalayın.Kapağı 48 delikli plakaya yerleştirin ve hücreleri eklemeden önce hidrojel substratların doku kültürü davlumbazındaki oda sıcaklığında sekiz ila 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçkadan sonra, kardiyomiyositleri derhal hidrojel substratlara damlatın, yaklaşık 200 mikrolitre kardiyomiyosit ortamının düşük bir orta hacminde kuyu başına yaklaşık 30.000 canlı kardiyomiyosit ile tohumlayın. Kapağı kapattıktan sonra, hücrelerin hidrojel substratına yapışmasını sağlamak için kardiyomiyositlerin davlumbazdaki oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden inkübe etmesine izin verin.Her bir oyuğa nazikçe 100 mikrolitre taze kardiyomiyosit ortamı ekleyin. Kapak kapalı plakasını iki ila dört gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite dengelemek için mikroskop ve çevresel kontrol odasını açın.Kardiyomiyosit ortamını 48 delikli plakadan çıkarın ve her bir kuyucuğu 600 mikrolitre kardiyak kontraktilite modülasyonu veya CCM tahlil ortamı ile iki kez hafifçe durulayın. Daha sonra kuyu başına 300 mikrolitre CCM tahlil ortamı ekleyin ve 48 delikli plakayı çevresel kontrol odasındaki mikroskop üzerine yerleştirin. Elektrotları yerleştirin ve hücreleri beş dakika boyunca dengeleyin.Kasılma videolarını video tabanlı mikroskopi kullanarak kaydetmek için, video kayıt yazılımını açın ve saniyede 100 kare kare hızı ayarlayın. Ardından, hiPSC-CM tek katmanının merkezine yakın bir ilgi alanı veya yatırım getirisi seçin. Daha sonra alan, 2D kardiyomiyositlerin tek katmanlarını elektriksel olarak hızlandırmak için hücreleri ticari bir darbe jeneratörü ile uyarır.Kardiyomiyositi temel nabız parametreleri ile bir hertz'de 1.5 kat eşiğe yerleştirin. Örneğin, monofazik kare dalga temposu, beş voltluk iki milisaniyelik bir uyaran darbe süresine sahip darbelerdir. Temel tempo hızını CCM'den önce en az beş vuruş için yalnızca daralma videosu olarak kaydedin.Daha sonra kardiyomiyositlerin tek katmanlı katmanını 30 milisaniye gecikmeli deneysel bir elektrik sinyali, 5.14 milisaniye faz süresine sahip iki simetrik bifazik darbe, 20.56 milisaniye toplam süre, 10 volt faz genliği ve sıfır fazlar arası aralık ile uyarın. CCM kaynaklı kasılma videosunu en az beş vuruş için kaydedin. CCM sinyalini kapatın, temel bir tempo darbesi ile uyarın ve CCM'den sonraki iyileşme döneminin en az beş atım için bir kasılma videosu kaydedin.Kasılma videolarını otomatik olarak analiz etmek ve kasılma genliği, kasılma eğimi, gevşeme eğimi, zirveye kadar geçen süre, başlangıç çizgisine kadar geçen süre% 90 ve kasılma süresi% 50 gibi temel kontraktil özellikleri ölçmek için standart bir kontraksiyon yazılımı kullanın 2D insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositler tek katmanlı sözleşmeli özellikler karakterize edildi ve kardiyomiyosit kontraktilitesinin anahtar parametreleri ölçüldü. Standart CCM stimülasyon parametrelerinin uygulanması, in vitro olarak gelişmiş kontraktil özellikler ile sonuçlandı. Hücre dışı kalsiyum konsantrasyon modülasyonunun CCM stimülasyonu olan ve olmayan insan kontraktil özellikleri üzerindeki etkileri değerlendirildi.Kasılmanın beklenen başlangıç kalsiyum bağımlılığının yanı sıra, kardiyomiyosit monokatmanı seviyesinde kalsiyum duyarlılığında CCM kaynaklı bir artış gözlendi. Ek olarak, beta androjenik sinyal yolunun farmakolojik sorgulaması, CCM'nin neden olduğu inotropik etkilerin kısmen beta adrenerjik sinyalleme ile aracılık ettiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, bu araç, CCM'nin hastalık durumları bağlamında etkisini anlamak için dilate kardiyomiyopati de dahil olmak üzere hastaya özgü hastalık kardiyomiyositlerine genişletilebilir.Burada, öncelikle insan kontraktil özelliklerini değerlendirmeye odaklanıyoruz. Bununla birlikte, bu aracı kullanarak, aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum kullanımı dahil olmak üzere diğer kardiyak uyarılma kasılma kuplajları da değerlendirilebilir. Bu, indüklenmiş pluripotent kök hücreyi teknoloji ile kardiyak cihazların değerlendirilmesi ile birleştiren ilk düzenleyici bilim aracıdır.Bu alternatif yöntem, tıbbi cihazların bir tabakta değerlendirilmesinin yolunu açar ve hayvan ve insan denek testlerine olan ihtiyacı azaltma potansiyeline sahiptir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Kontrast-bilgisayarlı Perfüzyon-sabit Örneklerinin Tomografi kullanarak İnsan Kardiyak Venöz Sistemi anatomik yeniden düzenlemesi

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Kültürler Hücre Şok Dalga Uygulama

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...