Name: investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدعم الذي تلقوه من مركز متعدد التخصصات للبحوث البيولوجية في العلوم الطبية (Cemib) ، Unicamp ، لتوليد الفئران AdipoSPH ، ومختبر Inmmunometabolism وإشارات الخلية ، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا على الضوئيات المطبقة على بيولوجيا الخلية (INFABIC) على كل الدعم التجريبي. نشكر الدعم المالي من مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP): 2019/15025-5 ؛ 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

تم إجراء الدراسات على الحيوانات وفقا لدليل جامعة كامبيناس لرعاية واستخدام المختبر (بروتوكول CEUA # 5810-1 / 2021).
1. الاستنساخ الجزيئي
<ol><li>تصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs)<ol><li>صمم sgRNAs لتنشيط كريسبر باستخدام CHOP ، المتوفرة في https://chopchop.cbu.uib.no/ ، أو أي أداة أخرى منا...

<ol>
	<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat.">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+Repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-mediated+control+of+gene+repression+and+activation.">Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming.">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species.">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bj&#246;rklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+production+everywhere:+a+simple,+fast,+and+reliable+protocol+for+in-house+aav+vector+production+based+on+chloroform+extraction.">AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction.</a> Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization.">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li><li>Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+murine+thermogenic+adipocytes.">Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).</li><li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch.">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li><li>Harms, M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+development,+function+and+therapeutic+potential.">Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).</li><li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+for+the+analysis,+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements.">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm16+determines+the+thermogenic+program+of+subcutaneous+white+adipose+tissue+in+mice.">Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).</li><li>Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipose+tissue+development+from+transgenic+animal+models.">Understanding adipose tissue development from transgenic animal models.</a> Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+an+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+issues+in+AAV-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 8, 87-104 (2018).</li><li>Deshmukh, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+comparative+mapping+of+the+secretomes+of+human+brown+and+white+adipocytes+reveals+EPDR1+as+a+novel+batokine.">Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).</li><li>Sponton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+glucose+and+lipid+homeostasis+via+PLTP+as+a+mediator+of+BAT-liver+communication.">The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication.</a> EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).</li></ol>

أحد أكثر التطبيقات غير التحريرية المفيدة لتقنية كريسبر هو استجواب وظيفة الجينات من خلال تنشيط الجينات الداخلية باستخدام أنظمة كريسبر6. SPH هو كريسبرا قوي تم وصفه في الأصل للحث على تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية نشطة من خلال استهداف العديد من الجينات العصبية14</...

الخلايا الشحمية البيج (أو البريتي) هي خلايا دهنية تفصل عن البروتين 1 (UCP1) والخلايا الشحمية الغنية بالميتوكوندريا الموجودة داخل مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). تظهر الدهون البيج من مجموعة فرعية من أسلاف الخلايا الشحمية أو الخلايا الشحمية البيضاء الناضجة استجابة للتعرض للبرد والمحفزات الأخرى 1,2. يمكن للخلايا الشحمية البيج تحويل الطاقة إلى حرارة بطريقة تعتمد على UCP1 أو مستقلة3. بغض النظر عن وظيفتها الحرارية ، يمكن للدهون البيج أيضا تحسين صحة التمثيل الغذائي بوسائل أخرى ، مثل إفراز الأديبوكينات والأنشطة المضادة للالتهابات والمضادة للتليف. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران والبشر أن تحريض الدهون البيج يحسن توازن الجلوكوز والدهون في الجسمبالكامل 3. ومع ذلك ، على الرغم من أن معرفتنا ببيولوجيا الدهون البيج قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة ، إلا أن معظم فوائدها الأيضية والآليات ذات الصلة لا تزال غير مفهومة تماما.
تم وصف التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) لأول مرة في الخلايا حقيقية النواة كأداة قادرة على توليد فاصل مزدوج الخيوط (DSB) في موقع معين في الجينوم من خلال نشاط النيوكلياز لبروتين Cas9 4,5. يتم توجيه Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه الاصطناعي (sgRNA) لاستهداف منطقة جينومية معينة ، مما يؤدي إلى DSB الحمض النووي. بالإضافة إلى استخدام النيوكلياز Cas9 لأغراض التحرير ، تطورت تقنية CRISPR-Cas9 لاستخدامها كأداة لتنظيم الجينات الخاصة بالتسلسل6. أدى تطوير بروتين Cas9 غير نشط تحفيزيا (dCas9) وربط وحدات النسخ القادرة على تعزيز التعبير الجيني إلى ظهور أدوات تنشيط كريسبر (CRISPRa). ظهرت العديد من أنظمة CRISPRa ، مثل VP647,8 ، وسيط التنشيط التآزري (SAM) 9 ، SunTag10,11 ، VPR12,13 ، و SunTag-p65-HSF1 (SPH) 14 ، والتي تجمع بين مكونات منشطات SAM و SunTag. لقد ثبت مؤخرا أن التعبير المستحث للجينات العصبية في الخلايا العصبية N2a والخلايا النجمية الأولية أعلى باستخدام SPH مقارنة بأنظمة CRISPRa الأخرى14 ، مما يدل على SPH كأداة CRISPRa واعدة.
هنا ، استفدنا من ماوس SPH14 الذي تم تطويره مسبقا لإنشاء نموذج فأر شرطي يعبر عن SPH على وجه التحديد في الخلايا الشحمية باستخدام سلالة adiponectin Cre (AdipoSPH). باستخدام فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل gRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي ، تم تحفيز اللون البني (التحويل الأبيض إلى البيج) من WAT الإربي (iWAT) لزيادة التعبير عن برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، في المختبر Prdm16 التعبير المفرط عزز استهلاك الأكسجين. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نموذج ماوس SPH متعدد الاستخدامات لاستكشاف آليات تطور الدهون البيج داخل الأنسجة الدهنية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro 293T Cell Line</td>
			<td>Takarabio</td>
			<td>632273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>UFC510008</td>
			<td>100 KDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta Self-Opening Micro Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep purification kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Model 701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 10-beta/Stable&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>E. coli competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/8&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>91947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Rioqu&#237;mica</td>
			<td>510101303</td>
			<td>Antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Premier Adson Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>475-40417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M180B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK enzyme kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol Hydrochloride</td>
			<td>SEM</td>
			<td>43930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel&#160;</td>
			<td>Bausch + Lomb&#160;</td>
			<td>99620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system

وقد أدت تقنية التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (كريسبر) إلى ثورة في علم الأحياء، وتم تطبيق الأدوات الحديثة إلى ما هو أبعد من التحرير الجيني الموصوف أصلا. يجمع نظام تنشيط كريسبر (CRISPRa) بين بروتين Cas9 (dCas9) غير النشط تحفيزيا مع وحدات نسخ مميزة للحث على التعبير الجيني الداخلي. SunTag-p65-HSF1 (SPH) هي تقنية CRISPRa تم تطويرها مؤخرا تجمع بين مكونات وسطاء التنشيط التآزري (SAMs) مع منشطات SunTag. يسمح هذا النظام بالإفراط في التعبير عن الجينات المفردة أو المتعددة من خلال تصميم RNA أحادي التوجيه مخصص (sgRNA). في هذه الدراسة ، تم استخدام فأر SPH تم تطويره مسبقا لتوليد فأر شرطي يعبر عن SPH في الخلايا الشحمية (سلالة adiponectin Cre) ، المسماة AdipoSPH. للحث على النمط الظاهري للدهون البيضاء إلى البيج (البني) ، تم حقن فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل sgRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي (عامل نسخ راسخ يتعلق بتطور الدهون البنية والبيج) في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT). حفز نموذج الفأر هذا التعبير عن Prdm16 الداخلي المنشأ ونشط برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، أدى التعبير المفرط ل Prdm16 الناجم عن SPH في المختبر إلى تعزيز استهلاك الأكسجين للخلايا الشحمية البيج ، مما أدى إلى نسخ نتائج نموذج الفئران المعدلة وراثيا Prdm16 السابق. وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول نموذج ماوس متعدد الاستخدامات وفعال من حيث التكلفة وفعال من حيث الوقت للتحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية.

تم تطوير فئران AdipoSPH عن طريق تربية سلالات الفئران SPH و Adipoq-Cre. كانت كلتا سلالتي الماوس في خلفية C57BL6J-DBA / 2J هجينة (وفقا للمورد التجاري ؛ انظر جدول المواد). تم وصف سلالة فأر SPH في الأصل بواسطة Zhou et al.14.
في الجسم الحي تطور الخلايا الشحمية البيج...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System at JoVE.com

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

يقدم هذا البروتوكول استخدام CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) في الخلايا الشحمية (AdipoSPH) كاستراتيجية بديلة للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) للتحقيق في بيولوجيا الدهون البيج. الحقن في الجسم الحي من sgRNA الحامل ل AAV الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي يكفي للحث على نمو الدهون البيج وتعزيز برنامج الجينات الحرارية.

فحص بيولوجيا الدهون البيج والتمثيل الغذائي باستخدام نظام تنشيط CRISPR SunTag-p65-HSF1

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

يقدم هذا البروتوكول نظام تنشيط SPH CRISPR كاستراتيجية بديلة للنواقل الفيروسية التقليدية لأداء فحوصات وظيفة الكسب في الخلايا الشحمية. يسمح بالإفراط في التعبير عن الجينات الداخلية للخلايا الشحمية المفردة أو المتعددة داخل البيئة الخلوية المعقدة للأنسجة الدهنية عن طريق تقديم الحمض النووي الريبي الموجه الفردي المخصص باستخدام فيروس مرتبط بالأدينو. ترتبط الخطوات الصعبة لهذا البروتوكول باستنساخ الحمض النووي الريبي الموجه الوحيد وإنتاج وحقن الفيروس المرتبط بالغدي في الأنسجة الدهنية.للبدء ، صمم دليل واحد RNA أو sgRNA لتنشيط CRISPR باستخدام chopchop أو أي أداة أخرى مناسبة. صمم sgRNA الذي يستهدف جين PRDM16 باستخدام المعلمات التالية: الهدف ك PRDM16 في Mus musculus باستخدام CRISPR / Cas9 وللتنشيط. أضف الأجزاء المتدلية إلى sgRNA لتتناسب مع موقع تقييد Sac1 في العمود الفقري المتجه PAAVU6GRNACBHM الكرز.تشمل 5'AGCT 3'حيث n يتوافق مع النيوكليوتيدات. احصل على تسلسل مكمل عكسي ل 3'sgRNA باستخدام الأداة المشار إليها. بعد ذلك ، لتلدين قليل النوكليوتيدات التكميلية المفردة التي تقطعت بها السبل ، أضف ميكرولترا واحدا من كل قليل النوكليوتيد 5'و 3's تقطعت بهم السبل ، وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت T4 ligase ، و 0.5 ميكرولتر من كيناز T4 polynucleotide ، و 6.5 ميكرولتر من الماء لحجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.قم بتلدين قليل النيوكليوتيدات المفردة التي تقطعت بها السبل باستخدام جهاز تدوير حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، متبوعا بمعدل انخفاض يبلغ خمس درجات مئوية في الدقيقة. ثم لربط قليل النوكليوتيدات sgRNA الملدن ، أضف 25 نانوجرام من كرز البلازميد PAAVU6GRNACBHM إلى ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات sgRNA الملدن ، وميكرولتر واحد من إنزيم Sac1 ، وميكرولتر من 10X T4 DNA ligase buffer ، وميكرولتر واحد من T4 DNA ligase والماء إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر. باستخدام جهاز تدوير حراري ، قم بإجراء الربط عن طريق احتضان خليط التفاعل لمدة 15 دورة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق متبوعا بالتثبيت عند أربع درجات سلزية.بعد ذلك ، قم بتحويل خلايا Escherichia coli DH10B المختصة بأربعة ميكرولتر من منتج الربط عن طريق الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية وانتشرت على صفيحة أجار تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين. قم بتأكيد المستعمرات المحولة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة أو تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام PCR Master Mix ، واختر المستعمرة واخلطها مع خمسة ميكرولترات من Master Mix ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العالمي ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي sgRNA وخمسة ميكرولتر من الماء. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تمسخ أولي عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 35 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، والتلدين لمدة 30 ثانية عند 60 درجة مئوية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وخطوة استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بحل الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز في 0.5X TAE Buffer عند 90 فولت لمدة 30 دقيقة. إرسال عينات إيجابية لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي العالمي. بعد ذلك ، قم بتنقية البلازميد من استنساخ إيجابي باستخدام مجموعة تنقية البلازميد باتباع تعليمات الشركة المصنعة.ضع الفأر المخدر في وضع الاستلقاء واحلق منطقة صغيرة على الأجنحة القريبة من مفاصل الورك للأنسجة الدهنية البيضاء الأربية أو حقن IWAT باستخدام ماكينة حلاقة. أضف كريم مزيل الشعر لمدة خمس دقائق. إزالة كريم المتبقية بالماء لتجنب حروق الجلد.تطهير الجلد باستخدام ثلاث جولات بالتناوب من تطبيق محلول اليود البوفيدون على الجلد مع الشاش النظيف والكحول 70 ٪. بعد ذلك ، قم بعمل شق من سنتيمتر إلى سنتيمترين بمقص معقم في المنطقة القريبة من المفاصل وأمسك الجلد مفتوحا باستخدام ملقط لفضح مستودع الدهون. يمكن ربط WAT بالجلد على كلا الجانبين وتمديده من البداية من الخلف ونحو الخصيتين.باستخدام الملقط ، اسحب مستودع الدهون برفق لأعلى من خلال الشق للتأكد من أن الحقن في المكان والعمق الصحيحين. املأ حقنة الميكرولتر ب 2.5 ميكرولتر من الفيروس المرتبط بالغدي أو AAV الذي يحتوي على sgRNA الذي يستهدف جين PRDM16 الداخلي. أدخل الإبرة بعناية بزاوية 30-45 درجة في IWAT.كرر الحقن خمس مرات في مواقع مختلفة من الأنسجة لإصابة وسادة الدهون IWAT بأكملها بشكل متجانس. ضع الماوس على وسادة التدفئة حتى يتم استعادة الوعي. راقب الحيوان كل 10 إلى 15 دقيقة حتى يتعافى تماما.بعد أن يستعيد الحيوان وعيه ، لاحظ التنميط القاطر ، والذي يجب أن يكون خطيا وليس له أي علامات على الضيق أو الألم. شاهد الخلايا الوعائية اللحمية أو SVF المشتقة من فأر adipo SPH IWAT في لوحة ذات 6 آبار تحتوي على وسط DMEM كامل لمدة ساعة إلى ساعتين ، ونضح الوسط ، واغسل البئر مرتين باستخدام PBS ، واستبدله بوسط جديد وكامل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70-80٪.في اليوم 0 ، حث التمايز عن طريق معالجة الخلايا بوسط الحث وبعد يومين استبدل وسط الحث بوسط الصيانة. مرة أخرى بعد يومين ، في اليوم الرابع ، استبدل وسيط الصيانة بوسيط صيانة جديد لمدة 2-3 أيام. قم بتغيير وسيط الصيانة كل 48 ساعة حتى يتم تمييز الخلايا preadipocytes بالكامل إلى خلايا دهنية.راقب الخلايا الشحمية الناضجة باستخدام الفحص المجهري الضوئي حيث تبدو الخلايا المتمايزة محملة بقطرات الدهون. بعد زراعة الخلايا على صفيحة استزراع 6 آبار مع الوسط الكامل حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70-80٪ ، امزج 5.6 * 10 ^ 10 جينوم فيروسي لكل ميكرولتر من sgRNA PRDM16 الحامل ل AAV مع ملليلتر من بروميد الوسيط الكامل وهيكساديثرين. قم بتحويل الخلايا عن طريق استبدال الوسط الكامل وإضافة الوسط الكامل الذي يحتوي على AAV.احتضان الخلايا المحولة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية 95٪ رطوبة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. انقسام ورؤية الخلايا كما هو موصوف لتكاثر الخلايا والتمايز إلى الخلايا الشحمية البيج. أظهرت صور التألق المناعي من IWAT لفئران adipo SPH التعبير عن dCas9 في كل من المجموعة الضابطة و PRDM16.من الواضح أن تعبير PRDM16 الناجم عن SPH قد أدى إلى تراكم واسع النطاق للخلايا الشحمية البيج متعددة العيون في IWAT. علاوة على ذلك ، كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي عن زيادة التعبير عن PRDM16 وبرنامج الجينات الحرارية في مجموعة PRDM16 مقارنة بالسيطرة. وبالمثل ، أكد تحليل التعبير الجيني في المختبر زيادة التعبير عن جين PRDM16 الداخلي والجينات الحرارية في مجموعة التعبير المفرط PRDM16 مقارنة بالسيطرة.أدى تعبير PRDM16 الناجم عن SPH إلى استهلاك أكسجين قاعدي وأقصى من ذلك الموجود في الخلايا الضابطة. الأهم من ذلك ، أشارت البيانات إلى تعزيز التنفس غير المنفصل في مجموعة PRDM16 مقارنة بالمجموعة الضابطة. نموذج Adipo SPH مناسب للتحقيق في جينات متعددة وعناصر تنظيمية داخل الخلايا الشحمية.تفتح هذه الطريقة إمكانية فهم أعمق لبيولوجيا الدهون البيج.

investigation-beige-fat-biology-metabolism-using-crispr-suntag-p65

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

A detailed understanding of the complexity and relative variability within the human cardiac venous system is crucial for the development of cardiac devices that require access to these vessels. For example, cardiac venous anatomy is known to be one of the key limitations for the proper delivery of cardiac resynchronization therapy (CRT)1 Therefore, the development of a database of anatomical parameters for human cardiac venous systems can aid in the design of CRT delivery devices to overcome such a limitation. In this research project, the anatomical parameters were obtained from 3D reconstructions of the venous system using contrast-computed tomography (CT) imaging and modeling software (Materialise, Leuven, Belgium). The following parameters were assessed for each vein: arc length, tortuousity, branching angle, distance to the coronary sinus ostium, and vessel diameter.
	CRT is a potential treatment for patients with electromechanical dyssynchrony. Approximately 10-20% of heart failure patients may benefit from CRT2. Electromechanical dyssynchrony implies that parts of the myocardium activate and contract earlier or later than the normal conduction pathway of the heart. In CRT, dyssynchronous areas of the myocardium are treated with electrical stimulation. CRT pacing typically involves pacing leads that stimulate the right atrium (RA), right ventricle (RV), and left ventricle (LV) to produce more resynchronized rhythms. The LV lead is typically implanted within a cardiac vein, with the aim to overlay it within the site of latest myocardial activation. 
	We believe that the models obtained and the analyses thereof will promote the anatomical education for patients, students, clinicians, and medical device designers. The methodologies employed here can also be utilized to study other anatomical features of our human heart specimens, such as the coronary arteries. To further encourage the educational value of this research, we have shared the venous models on our free access website: <a href="http://www.vhlab.umn.edu/atlas" target="_blank">www.vhlab.umn.edu/atlas</a>.

The objective of this research is to recreate and then access the anatomy of the human cardiac venous system using 3D reconstructions generated from contrast-computed tomography scans.

إعادة بناء تشريحية من الجهاز الوريدي للقلب البشري باستخدام التباين-المقطعي العينات الإرواء ثابت

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180&#176; Curved Artery Test Section

The arterial network in the human vasculature comprises of ubiquitously present blood vessels with complex geometries (branches, curvatures and tortuosity). Secondary flow structures are vortical flow patterns that occur in curved arteries due to the combined action of centrifugal forces, adverse pressure gradients and inflow characteristics. Such flow morphologies are greatly affected by pulsatility and multiple harmonics of physiological inflow conditions and vary greatly in size-strength-shape characteristics compared to non-physiological (steady and oscillatory) flows 1 - 7.
Secondary flow structures may ultimately influence the wall shear stress and exposure time of blood-borne particles toward progression of atherosclerosis, restenosis, sensitization of platelets and thrombosis 4 - 6, 8 - 13. Therefore, the ability to detect and characterize these structures under laboratory-controlled conditions is precursor to further clinical investigations.
A common surgical treatment to atherosclerosis is stent implantation, to open up stenosed arteries for unobstructed blood flow. But the concomitant flow perturbations due to stent installations result in multi-scale secondary flow morphologies 4 - 6. Progressively higher order complexities such as asymmetry and loss in coherence can be induced by ensuing stent failures vis-&#224;-vis those under unperturbed flows 5. These stent failures have been classified as &#34;Types I-to-IV&#34; based on failure considerations and clinical severity 14.
This study presents a protocol for the experimental investigation of the complex secondary flow structures due to complete transverse stent fracture and linear displacement of fractured parts (&#34;Type IV&#34;) in a curved artery model. The experimental method involves the implementation of particle image velocimetry (2C-2D PIV) techniques with an archetypal carotid artery inflow waveform, a refractive index matched blood-analog working fluid for phase-averaged measurements 15 - 18. Quantitative identification of secondary flow structures was achieved using concepts of flow physics, critical point theory and a novel wavelet transform algorithm applied to experimental PIV data 5, 6, 19 - 26.

Stent implants in stenosed arterial curvatures are prone to "Type IV" failures involving the complete transverse fracture of stents and linear displacement of the fractured parts. We present a protocol for detection of secondary flow (vortical) structures in a curved artery model, downstream of clinically relevant "Type IV" stent failures.

التحقيق التجريبي للهياكل تدفق الثانوية المصب من الفشل نموذج النوع الرابع الدعامة في قسم اختبار 180 درجة الشريان منحني

The arterial network in the human vasculature comprises of ubiquitously present blood vessels with complex geometries (branches, curvatures and ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

تدعمه سقالة زرع الجزر في سادة الدهون البربخ من الفئران السكري

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

القسطرة الخفيفة داخل القلب للإشعال الجانبي لرصد الأيض الخلوي باستخدام مطياف الامتصاص عبر الجدارية لقلوب الثدييات المنصهرة

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system has facilitated advanced genetic modification of Saccharomyces cerevisiae, a model organism and workhorse in industrial biotechnology. CRISPR-associated protein 12a (Cas12a), an RNA-guided endonuclease with features distinguishable from Cas9 is applied in this work, further extending the molecular toolbox for genome editing purposes. A benefit of the CRISPR/Cas12a system is that it can be used in multiplex genome editing with multiple guide RNAs expressed from a single transcriptional unit (single CRISPR RNA (crRNA) array). We present a protocol for multiplex integration of multiple heterologous genes into independent loci of the S. cerevisiae genome using the CRISPR/Cas12a system with multiple crRNAs expressed from a single crRNA array construct. The proposed method exploits the ability of S. cerevisiae to perform in vivo recombination of DNA fragments to assemble the single crRNA array into a plasmid that can be used for transformant selection, as well as the assembly of donor DNA sequences that integrate into the genome at intended positions. Cas12a is pre-expressed constitutively, facilitating cleavage of the S.&#160;cerevisiae genome at the intended positions upon expression of the single crRNA array. The protocol includes the design and construction of a single crRNA array and donor DNA expression cassettes, and exploits an integration approach making use of unique 50-bp DNA connectors sequences and separate integration flank DNA sequences, which simplifies experimental design through standardization and modularization and extends the range of applications. Finally, we demonstrate a straightforward technique for creating yeast pixel art with an acoustic liquid handler using differently colored carotenoid producing yeast strains that were constructed.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

The CRISPR/Cas12a system in combination with a single crRNA array enables efficient multiplex editing of the S.&#160;cerevisiae genome at multiple loci simultaneously. This is demonstrated by constructing carotenoid producing yeast strains which are subsequently used to create yeast pixel art.

كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير من Saccharomyces سيريفيسياي وخلق الخميرة بكسل الفن

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

بناء من CRISPR Plasmids والكشف عن كفاءة خروج المغلوب في خلايا الثدييات من خلال نظام مراسل Luciferase مزدوجة

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, multiple ligaments, and approximately 20 muscles. Unfortunately, shoulder pathologies (e.g., rotator cuff tears, joint dislocations, arthritis) are common, resulting in substantial pain, disability, and decreased quality of life. The specific etiology for many of these pathologic conditions is not fully understood, but it is generally accepted that shoulder pathology is often associated with altered joint motion. Unfortunately, measuring shoulder motion with the necessary level of accuracy to investigate motion-based hypotheses is not trivial. However, radiographic-based motion measurement techniques have provided the advancement necessary to investigate motion-based hypotheses and provide a mechanistic understanding of shoulder function. Thus, the purpose of this article is to describe the approaches for measuring shoulder motion using a custom biplanar videoradiography system. The specific objectives of this article are to describe the protocols to acquire biplanar videoradiographic images of the shoulder complex, acquire CT scans, develop 3D bone models, locate anatomical landmarks, track the position and orientation of the humerus, scapula, and torso from the biplanar radiographic images, and calculate the kinematic outcome measures. In addition, the article will describe special considerations unique to the shoulder when measuring joint kinematics using this approach.

Biplane videoradiography can quantify shoulder kinematics with a high degree of accuracy. The protocol described herein was specifically designed to track the scapula, humerus, and the ribs during planar humeral elevation, and outlines the procedures for data collection, processing, and analysis. Unique considerations for data collection are also described.

قياس 3D في الجسم الحي الكتف الحركية باستخدام ثنائية الكواكب فيديو راديوجرافي

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...