Name: investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00
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Die Autoren danken dem Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp für die Erzeugung von AdipoSPH-Mäusen, dem Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory und dem National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) für die experimentelle Unterstützung. Wir danken für die finanzielle Unterstützung der São Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Universität Campinas für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Protokoll CEUA #5810-1/2021) durchgeführt.
1. Molekulare Klonierung
<ol><li>Design von Single-Guide-RNAs (sgRNAs)<ol><li>Entwerfen Sie sgRNAs für die CRISPR-Aktivierung mit CHOPCHOP, das bei https://chopchop.cbu.uib.no/ erhältlich ist, oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um sgRNA zu entwerfen,...

<ol>
	<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat.">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+Repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-mediated+control+of+gene+repression+and+activation.">Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming.">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species.">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bj&#246;rklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+production+everywhere:+a+simple,+fast,+and+reliable+protocol+for+in-house+aav+vector+production+based+on+chloroform+extraction.">AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction.</a> Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization.">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li><li>Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+murine+thermogenic+adipocytes.">Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).</li><li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch.">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li><li>Harms, M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+development,+function+and+therapeutic+potential.">Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).</li><li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+for+the+analysis,+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements.">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm16+determines+the+thermogenic+program+of+subcutaneous+white+adipose+tissue+in+mice.">Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).</li><li>Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipose+tissue+development+from+transgenic+animal+models.">Understanding adipose tissue development from transgenic animal models.</a> Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+an+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+issues+in+AAV-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 8, 87-104 (2018).</li><li>Deshmukh, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+comparative+mapping+of+the+secretomes+of+human+brown+and+white+adipocytes+reveals+EPDR1+as+a+novel+batokine.">Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).</li><li>Sponton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+glucose+and+lipid+homeostasis+via+PLTP+as+a+mediator+of+BAT-liver+communication.">The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication.</a> EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).</li></ol>

Eine der nützlichsten Nicht-Editing-Anwendungen der CRISPR-Technologie ist die Abfrage der Genfunktion durch die Aktivierung endogener Gene mit Hilfe von CRISPRa-Systemen6. SPH ist ein starkes CRISPRa, von dem ursprünglich beschrieben wurde, dass es die Umwandlung von Astrozyten in aktive Neuronen induziert, indem es auf mehrere neurogene Gene abzielt14. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass AdipoSPH ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Biologie von beigem ...

Beige (oder Brite) Adipozyten sind entkoppelnde Protein 1 (UCP1)-exprimierende und mitochondriale Adipozyten, die sich in Depots für weißes Fettgewebe (WAT) befinden. Beigefett entsteht aus einer Untergruppe von Adipozyten-Vorläuferzellen oder reifen weißen Adipozyten als Reaktion auf Kälteeinwirkung und andere Reize 1,2. Beige Adipozyten können UCP1-abhängig oder unabhängig Energie in Wärme umwandeln3. Unabhängig von seiner thermogenen Funktion kann beigefarbenes Fett auch auf andere Weise die Stoffwechselgesundheit verbessern, z. B. durch die Sekretion von Adipokinen und entzündungshemmende und antifibrotische Aktivitäten. Studien an Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass die Induktion von beigem Fett die Glukose- und Lipidhomöostase des ganzen Körpers verbessert3. Obwohl sich unser Wissen über die Biologie von beigem Fett in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt hat, sind die meisten seiner metabolischen Vorteile und die damit verbundenen Mechanismen immer noch nicht vollständig verstanden.
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) wurden erstmals in eukaryotischen Zellen als ein Werkzeug beschrieben, das in der Lage ist, durch die Nukleaseaktivität des Cas9-Proteins einen Doppelstrangbruch (DSB) an einer bestimmten Stelle im Genom zu erzeugen 4,5. Cas9 wird von einer synthetischen Single-Guide-RNA (sgRNA) gesteuert, um auf eine bestimmte genomische Region abzuzielen, was zu einem DNA-DSB führt. Neben der Verwendung der Nuklease Cas9 für die Editierung hat sich die CRISPR-Cas9-Technologie weiterentwickelt, um als sequenzspezifisches Genregulationswerkzeug eingesetzt zu werden6. Die Entwicklung eines katalytisch inaktiven Cas9-Proteins (dCas9) und die Assoziation von Transkriptionsmodulen, die in der Lage sind, die Genexpression zu verbessern, haben zu CRISPR-Aktivierungswerkzeugen (CRISPRa) geführt. Es sind mehrere CRISPRa-Systeme entstanden, wie z. B. VP647,8, synergistischer Aktivierungsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 und SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, das die Komponenten von SAM- und SunTag-Aktivatoren kombiniert. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die induzierte Expression neurogener Gene in N2a-Neuroblasten und primären Astrozyten mit SPH im Vergleich zu anderen CRISPRa-Systemen höher ist14, was SPH als vielversprechendes CRISPRa-Werkzeug demonstriert.
In dieser Arbeit nutzten wir eine zuvor entwickelte SPH-Maus14 , um ein bedingtes Mausmodell zu generieren, das SPH spezifisch in Adipozyten exprimiert, indem wir die Adiponektin-Cre-Linie (AdipoSPH) verwenden. Mit Hilfe eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das die gRNA trägt, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, wurde die Bräunung (Umwandlung von weiß in beige) von inguinalem WAT (iWAT) induziert, um die Expression des thermogenen Genprogramms zu erhöhen. Darüber hinaus erhöhte die in vitro Überexpression von Prdm16 den Sauerstoffverbrauch. Daher stellt dieses Protokoll ein vielseitiges SPH-Mausmodell zur Verfügung, um die Mechanismen der beigen Fettentwicklung im Fettgewebe zu erforschen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro 293T Cell Line</td>
			<td>Takarabio</td>
			<td>632273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>UFC510008</td>
			<td>100 KDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta Self-Opening Micro Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep purification kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Model 701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 10-beta/Stable&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>E. coli competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/8&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>91947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Rioqu&#237;mica</td>
			<td>510101303</td>
			<td>Antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Premier Adson Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>475-40417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M180B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK enzyme kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol Hydrochloride</td>
			<td>SEM</td>
			<td>43930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel&#160;</td>
			<td>Bausch + Lomb&#160;</td>
			<td>99620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system

Die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hat eine Revolution in der Biologie ausgelöst, und neuere Werkzeuge wurden weit über die ursprünglich beschriebene Genom-Editierung hinaus eingesetzt. Das CRISPR-Aktivierungssystem (CRISPRa) kombiniert das katalytisch inaktive Cas9 (dCas9)-Protein mit verschiedenen Transkriptionsmodulen, um eine endogene Genexpression zu induzieren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) ist eine neu entwickelte CRISPRa-Technologie, die Komponenten von synergistischen Aktivierungsmediatoren (SAMs) mit den SunTag-Aktivatoren kombiniert. Dieses System ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer Gene durch das Design einer maßgeschneiderten Single-Guide-RNA (sgRNA). In dieser Studie wurde eine zuvor entwickelte SPH-Maus verwendet, um eine bedingte Maus zu erzeugen, die SPH in Adipozyten exprimiert (Adiponektin-Cre-Linie), genannt AdipoSPH. Um einen Phänotyp von weißem bis beigem Fett (Bräunung) zu induzieren, wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das sgRNA trägt, das auf das endogene Prdm16-Gen (ein gut etablierter Transkriptionsfaktor, der mit der Entwicklung von braunem und beigem Fett in Verbindung steht) abzielt, in das weiße Leistenfettgewebe (iWAT) injiziert. Dieses Mausmodell induzierte die Expression von endogenem Prdm16 und aktivierte das thermogene Genprogramm. Darüber hinaus erhöhte die in vitro SPH-induzierte Prdm16-Überexpression den Sauerstoffverbrauch von beigen Adipozyten und phänokopierte damit die Ergebnisse eines früheren transgenen Prdm16-Mausmodells. Somit beschreibt dieses Protokoll ein vielseitiges, kostengünstiges und zeiteffektives Mausmodell zur Untersuchung der Fettgewebebiologie.

AdipoSPH-Mäuse wurden durch die Züchtung von SPH- und Adipoq-Cre-Mausstämmen entwickelt. Beide Mausstämme befanden sich in einem hybriden C57BL6J-DBA/2J-Hintergrund (nach Angaben des kommerziellen Anbieters; siehe Materialtabelle). Die SPH-Mauslinie wurde ursprünglich von Zhou et al.14 beschrieben.
In vivo beige Adipozytenentwicklung durch AdipoSPH-vermittelte Prdm16-Überexpression Um die Fähigkeit de...

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Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

Dieses Protokoll stellt die Verwendung von CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in Adipozyten (AdipoSPH) als alternative Strategie zum Adeno-assoziierten Virus (AAV) zur Untersuchung der Biologie von beigem Fett dar. Die In-vivo-Injektion von AAV-tragender sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, reicht aus, um die Entwicklung von beigem Fett zu induzieren und das thermogene Genprogramm zu verbessern.

Untersuchung der Biologie und des Stoffwechsels von beigefarbenem Fett mit dem CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivierungssystem

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

Dieses Protokoll stellt das SPH CRISPR-Aktivierungssystem als alternative Strategie zu herkömmlichen viralen Vektoren dar, um Gain-Function-Assays in Adipozyten durchzuführen. Es ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer endogener Gene von Adipozyten in der komplexen zellulären Umgebung des Fettgewebes, indem es eine maßgeschneiderte einzelne Leit-RNA unter Verwendung eines Adeno-assoziierten Virus liefert. Die herausfordernden Schritte dieses Protokolls beziehen sich auf die Klonierung der einzelnen Leit-RNA und die Produktion und Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das Fettgewebe.Entwerfen Sie zunächst eine RNA oder sgRNA mit einem einzigen Führer für die CRISPR-Aktivierung mit Chopchop oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Design der sgRNA, die auf das PRDM16-Gen abzielt, unter Verwendung der folgenden Parameter:Target als PRDM16 in einem Mus musculus unter Verwendung eines CRISPR/Cas9 und zur Aktivierung. Fügen Sie der sgRNA Überhänge hinzu, die mit der Sac1-Restriktionsstelle im Vektor-Backbone PAAVU6GRNACBHM-Kirsche übereinstimmen.5'AGCT 3' einschließen, wobei n Nukleotiden entspricht. Erhalten Sie die Reverse-Complement-Sequenz von 3'sgRNA mit dem angegebenen Werkzeug. Als nächstes werden zum Annealen von einzelsträngigen komplementären Oligonukleotiden ein Mikroliter jedes 5'- und 3'einzelsträngigen Oligonukleotids, ein Mikroliter T4-Ligasepuffer, 0,5 Mikroliter T4-Polynukleotidkinase und 6,5 Mikroliter Wasser für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern hinzugefügt.Die komplementären einzelsträngigen Oligonukleotide werden mit einem Thermocycler bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten und bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten geglüht, gefolgt von einer Herunterfahrrate von fünf Grad Celsius pro Minute. Dann werden zur Ligation von getemperten sgRNA-Oligonukleotiden 25 Nanogramm Plasmid PAAVU6GRNACBHM-Kirsche zu zwei Mikrolitern getemperten sgRNA-Oligonukleotiden, einem Mikroliter Sac1-Enzym, zwei Mikrolitern 10X T4-DNA-Ligasepuffer, einem Mikroliter T4-DNA-Ligase und Wasser zu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern hinzugefügt. Führen Sie die Ligation mit einem Thermocycler durch, indem Sie das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von einem Halten bei vier Grad Celsius.Anschließend werden die kompetenten Escherichia coli DH10B-Zellen mit vier Mikrolitern des Ligationsprodukts durch Hitzeschock bei 42 Grad Celsius für 45 Sekunden transformiert und auf einer Agarplatte mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin verteilt. Bestätigen Sie transformierte Kolonien durch Kolonie-Polymerase-Kettenreaktion oder PCR mit dem PCR-Master-Mix, wählen Sie die Kolonie und mischen Sie sie mit fünf Mikrolitern Master Mix, 0,1 Mikrolitern Universal-Primer, 0,1 Mikroliter sgRNA-Reverse-Primer und fünf Mikrolitern Wasser. Führen Sie die PCR mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 Grad Celsius für zwei Minuten durch, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 94 Grad Celsius für 20 Sekunden, Glühen für 30 Sekunden bei 60 Grad Celsius, Verlängerung bei 72 Grad Celsius für 30 Sekunden und einem letzten Dehnungsschritt bei 72 Grad Celsius für fünf Minuten.Nach der PCR wird die DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese in 0,5-fachem TAE-Puffer bei 90 Volt für 30 Minuten aufgelöst. Reichen Sie positive Proben für die Sanger-Sequenzierung mit einem universellen Primer ein. Als nächstes reinigen Sie das Plasmid von einem positiven Klon mit einem Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Legen Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage und rasieren Sie einen kleinen Bereich an den Flanken proximal der Hüftgelenke für inguinales weißes Fettgewebe oder IWAT-Injektionen mit einem Rasierer. Enthaarungscreme für fünf Minuten hinzufügen. Entfernen Sie die restliche Creme mit Wasser, um Hautverbrennungen zu vermeiden.Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie die Povidon-Jodlösung dreimal abwechselnd mit sauberer Gaze und 70%igem Alkohol auf die Haut auftragen. Machen Sie dann mit einer sterilisierten Schere einen ein bis zwei Zentimeter großen Schnitt im proximalen Bereich der Gelenke und halten Sie die Haut mit einer Pinzette offen, um das Fettdepot freizulegen. Das WAT kann beidseitig an der Haut befestigt werden und streckt sie von Anfang an vom Rücken bis zu den Hoden.Ziehen Sie das Fettdepot mit einer Pinzette vorsichtig durch den Schnitt nach oben, um sicherzustellen, dass sich die Injektion an der richtigen Stelle und in der richtigen Tiefe befindet. Füllen Sie die Mikroliterspritze mit 2,5 Mikrolitern des Adeno-assoziierten Virus oder einem AAV, das die sgRNA enthält, die auf das endogene PRDM16-Gen abzielt. Führen Sie die Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30-45 Grad in den IWAT ein.Wiederholen Sie die Injektion fünfmal an verschiedenen Stellen des Gewebes, um das gesamte IWAT-Fettpolster homogen zu infizieren. Legen Sie die Maus auf das Heizkissen, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Überwachen Sie das Tier alle 10 bis 15 Minuten, bis es sich vollständig erholt hat.Nachdem das Tier das Bewusstsein wiedererlangt hat, beobachten Sie die Profilierung des Bewegungsapparates, die linear sein sollte und keine Anzeichen von Stress oder Schmerz aufweisen sollte. Sehen Sie sich die stromalen Gefäßzellen oder SVFs, die von der Adipo-SPH-Maus IWAT stammen, für ein bis zwei Stunden in eine 6-Well-Platte mit vollständigem DMEM-Medium ein, saugen Sie das Medium an, waschen Sie die Well-Vertiefung zweimal mit PBS und ersetzen Sie sie durch frisches, vollständiges Medium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit, bis die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % erreichen.Induzieren Sie an Tag 0 die Differenzierung, indem Sie die Zellen mit dem Induktionsmedium behandeln, und ersetzen Sie nach zwei Tagen das Induktionsmedium durch das Erhaltungsmedium. Ersetzen Sie nach zwei Tagen, am vierten Tag, das Pflegemedium für 2-3 Tage durch ein frisches Pflegemedium. Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 48 Stunden, bis die Präadipozyten vollständig in Adipozyten differenziert sind.Beobachten Sie die reifen Adipozyten lichtmikroskopisch, da die differenzierten Zellen mit Lipidtröpfchen beladen zu sein scheinen. Nachdem die Zellen auf einer 6-Well-Kulturplatte mit dem vollständigen Medium gezüchtet wurden, bis die Zellen eine Konfluenz von 70-80% erreicht haben, mischen Sie 5,6 * 10 ^ 10 virales Genom pro Mikroliter AAV-tragender sgRNA PRDM16 mit zwei Millilitern vollständigem Medium und Hexadimethrinbromid. Transduzieren Sie die Zellen, indem Sie das komplette Medium ersetzen und das komplette Medium hinzufügen, das AAV enthält.Inkubieren Sie die transduzierten Zellen 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid. Teilen Sie die Zellen wie beschrieben für die Zellproliferation und -differenzierung in beige Adipozyten. Die Immunfluoreszenzbilder von IWAT von adipo SPH-Mäusen zeigten die Expression von dCas9 sowohl in der Kontroll- als auch in der PRDM16-Gruppe.Die SPH-induzierte PRDM16-Expression induzierte eindeutig eine weit verbreitete Akkumulation von multiokulären beigen Adipozyten in IWAT. Darüber hinaus zeigte die quantitative PCR eine erhöhte Expression von PRDM16 und des thermogenen Genprogramms in der PRDM16-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. In ähnlicher Weise bestätigte die in vitro Genexpressionsanalyse die erhöhte Expression des endogenen PRDM16-Gens und der thermogenen Gene in der PRDM16-Überexpressionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe.Die SPH-induzierte PRDM16-Expression führte zu einem höheren basalen und maximalen Sauerstoffverbrauch als in Kontrollzellen. Wichtig ist, dass die Daten auf eine verbesserte ungekoppelte Atmung in der PRDM16-Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe hindeuteten. Das Adipo SPH-Modell eignet sich für die Untersuchung mehrerer Gene und regulatorischer Elemente innerhalb von Adipozyten.Diese Methode eröffnet die Möglichkeit eines tieferen Verständnisses der Biologie von beigem Fett.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

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Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Forschung

Biotechnik

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Bau von CRISPR Plasmiden und Nachweis von Knockout-Effizienz in Säugetierzellen durch ein Dual Luciferase Reporter System

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