Name: investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System at JoVE.com

Författarna tackar stödet från Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, för generering av AdipoSPH-möss, Inmmunometabolism och Cell Signaling Laboratory och National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) för allt experimentellt stöd. Vi tackar det ekonomiska stödet från Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Djurstudier utfördes i enlighet med University of Campinas Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (protokoll CEUA #5810-1/2021).
1. Molekylär kloning
<ol><li>Design av enkelstyrda RNA (sgRNA)<ol><li>Designa sgRNA för CRISPR-aktivering med CHOPCHOP, tillgänglig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller något annat lämpligt verktyg. Använd följande parametrar för att designa sgRNA som riktar sig mot Prdm16-genen: Mål: Prdm16; I: Mus musculus; Användning: Cri...

<ol>
	<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat.">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+Repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-mediated+control+of+gene+repression+and+activation.">Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming.">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species.">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bj&#246;rklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+production+everywhere:+a+simple,+fast,+and+reliable+protocol+for+in-house+aav+vector+production+based+on+chloroform+extraction.">AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction.</a> Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization.">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li><li>Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+murine+thermogenic+adipocytes.">Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).</li><li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch.">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li><li>Harms, M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+development,+function+and+therapeutic+potential.">Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).</li><li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+for+the+analysis,+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements.">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm16+determines+the+thermogenic+program+of+subcutaneous+white+adipose+tissue+in+mice.">Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).</li><li>Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipose+tissue+development+from+transgenic+animal+models.">Understanding adipose tissue development from transgenic animal models.</a> Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+an+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+issues+in+AAV-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 8, 87-104 (2018).</li><li>Deshmukh, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+comparative+mapping+of+the+secretomes+of+human+brown+and+white+adipocytes+reveals+EPDR1+as+a+novel+batokine.">Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).</li><li>Sponton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+glucose+and+lipid+homeostasis+via+PLTP+as+a+mediator+of+BAT-liver+communication.">The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication.</a> EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).</li></ol>

En av de mest användbara icke-redigeringstillämpningarna av CRISPR-tekniken är frågan om genfunktion genom aktivering av endogena gener med hjälp av CRISPRa-system6. SPH är en kraftfull CRISPRa som ursprungligen beskrevs för att inducera omvandlingen av astrocyter till aktiva neuroner genom att rikta in sig på flera neurogena gener14. I denna studie visade sig AdipoSPH vara ett lämpligt verktyg för att undersöka beige fettbiologi genom att aktivera uttrycket av e...

Beige (eller brite) adipocyter är frikopplingsprotein 1 (UCP1) -uttryckande och mitokondriella rika adipocyter som finns i vita fettvävnad (WAT) depåer. Beige fett kommer från en undergrupp av adipocytprogenitorer eller mogna vita adipocyter som svar på kall exponering och andra stimuli 1,2. Beige adipocyter kan omvandla energi till värme på ett UCP1-beroende eller oberoende sätt3. Oavsett dess termogena funktion kan beigefett också förbättra metabolisk hälsa på andra sätt, såsom utsöndring av adipokiner och antiinflammatoriska och antifibrotiska aktiviteter. Studier på möss och människor har visat att induktion av beige fett förbättrar hela kroppen glukos och lipid homeostas3. Men även om vår kunskap om beige fettbiologi har utvecklats snabbt de senaste åren, är de flesta av dess metaboliska fördelar och relaterade mekanismer fortfarande inte helt förstådda.
Klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR) beskrevs först i eukaryota celler som ett verktyg som kan generera en dubbelsträngbrytning (DSB) på en specifik plats i genomet genom nukleasaktiviteten hos Cas9-proteinet 4,5. Cas9 styrs av ett syntetiskt enkelstyrt RNA (sgRNA) för att rikta in sig på en specifik genomisk region, vilket leder till en DNA DSB. Förutom att använda nukleaset Cas9 för redigeringsändamål har CRISPR-Cas9-tekniken utvecklats till att användas som ett sekvensspecifikt genregleringsverktyg6. Utvecklingen av ett katalytiskt inaktivt Cas9-protein (dCas9) och associeringen av transkriptionsmoduler som kan förbättra genuttrycket har gett upphov till CRISPR-aktiveringsverktyg (CRISPRa). Flera CRISPRa-system har uppstått, såsom VP647,8, synergistisk aktiveringsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 och SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, som kombinerar komponenterna i SAM- och SunTag-aktivatorer. Det har nyligen visats att det inducerade uttrycket av neurogena gener i N2a-neuroblaster och primära astrocyter är högre med SPH jämfört med andra CRISPRa-system14, vilket visar SPH som ett lovande CRISPRa-verktyg.
Här utnyttjade vi en tidigare utvecklad SPH-mus14 för att generera en villkorlig musmodell som uttrycker SPH specifikt i adipocyter med hjälp av adiponektin Cre-linjen (AdipoSPH). Med hjälp av ett adenoassocierat virus (AAV) som bär gRNA som riktar sig mot den endogena Prdm16-genen, inducerades brunfärgning (vit till beige omvandling) av inguinal WAT (iWAT) för att öka uttrycket av det termogena genprogrammet. Dessutom ökade in vitro Prdm16 överuttryck syreförbrukningen. Därför tillhandahåller detta protokoll en mångsidig SPH-musmodell för att utforska mekanismerna för beige fettutveckling i fettvävnad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro 293T Cell Line</td>
			<td>Takarabio</td>
			<td>632273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>UFC510008</td>
			<td>100 KDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta Self-Opening Micro Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep purification kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Model 701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 10-beta/Stable&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>E. coli competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/8&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>91947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Rioqu&#237;mica</td>
			<td>510101303</td>
			<td>Antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Premier Adson Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>475-40417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M180B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK enzyme kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol Hydrochloride</td>
			<td>SEM</td>
			<td>43930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel&#160;</td>
			<td>Bausch + Lomb&#160;</td>
			<td>99620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system

Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -teknik har lett till en revolution inom biologin, och nya verktyg har tillämpats långt bortom den ursprungligen beskrivna genredigeringen. CRISPR-aktiveringssystemet (CRISPRa) kombinerar det katalytiskt inaktiva Cas9 (dCas9) proteinet med distinkta transkriptionsmoduler för att inducera endogent genuttryck. SunTag-p65-HSF1 (SPH) är en nyutvecklad CRISPRa-teknik som kombinerar komponenter från synergistiska aktiveringsmediatorer (SAM) med SunTag-aktivatorerna. Detta system möjliggör överuttryck av enstaka eller flera gener genom att designa ett anpassat enkelstyrt RNA (sgRNA). I denna studie användes en tidigare utvecklad SPH-mus för att generera en villkorlig mus som uttrycker SPH i adipocyter (adiponectin Cre-härstamning), benämnd AdipoSPH. För att inducera en vit-till-beige fettfenotyp injicerades ett adenoassocierat virus (AAV) som bär sgRNA riktat mot den endogena Prdm16-genen (en väletablerad transkriptionsfaktor relaterad till brun och beige fettutveckling) i den inguinala vita fettvävnaden (iWAT). Denna musmodell inducerade uttrycket av endogent Prdm16 och aktiverade det termogena genprogrammet. Dessutom förbättrade SPH-inducerat Prdm16-överuttryck in vitro syreförbrukningen av beige adipocyter, vilket fenokopierade resultaten från en tidigare Prdm16-transgen musmodell. Således beskriver detta protokoll en mångsidig, kostnadseffektiv och tidseffektiv musmodell för att undersöka fettvävnadsbiologi.

AdipoSPH möss utvecklades genom uppfödning av SPH och Adipoq-Cre musstammar. Båda musstammarna var i en hybrid C57BL6J-DBA / 2J-bakgrund (enligt den kommersiella leverantören; se materialförteckning). SPH-muslinjen beskrevs ursprungligen av Zhou et al.14.
In vivo beige adipocytutveckling genom AdipoSPH-medierad Prdm16 överuttryck För att utvärdera kapaciteten hos modellen som beskrivs i denna studie ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System at JoVE.com

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

Detta protokoll presenterar användningen av CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) i adipocyter (AdipoSPH) som en alternativ strategi till adenoassocierat virus (AAV) för att undersöka beige fettbiologi. In vivo-injektion av AAV-bärande sgRNA riktad mot den endogena Prdm16-genen är tillräcklig för att inducera beige fettutveckling och förbättra det termogena genprogrammet.

Undersökning av beige fettbiologi och metabolism med hjälp av aktiveringssystemet CRISPR SunTag-p65-HSF1

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

Detta protokoll presenterar SPH CRISPR-aktiveringssystemet som en alternativ strategi till konventionella virala vektorer för att utföra förstärkningsfunktionsanalyser i adipocyter. Det möjliggör överuttryck av enstaka eller flera endogena gener för adipocyter inom den komplexa cellulära miljön i fettvävnad genom att leverera ett anpassat enkelstyrt RNA med användning av ett adenoassocierat virus. De utmanande stegen i detta protokoll är relaterade till kloning av det enda guide-RNA och produktion och injektion av adenoassocierat virus i fettvävnaden.Börja med att designa enkelstyrt RNA eller sgRNA för CRISPR-aktivering med chopchop eller något annat lämpligt verktyg. Designa sgRNA som riktar sig mot PRDM16-genen med hjälp av följande parametrar: Mål som PRDM16 i en Mus-muskulus med hjälp av en CRISPR / Cas9 och för som aktivering. Lägg till överhäng till sgRNA för att matcha Sac1-restriktionsstället i vektorns ryggrad PAAVU6GRNACBHM körsbär.Inkludera 5'AGCT3'där n motsvarar nukleotider. Erhåll 3'sgRNA omvänd komplementsekvens med det angivna verktyget. Därefter, för glödgning av enkelsträngade fria oligonukleotider, tillsätt en mikroliter av varje 5'och 3'enkelsträngad oligonukleotid, en mikroliter T4-ligasbuffert, 0,5 mikroliter T4-polynukleotidkinas och 6,5 mikroliter vatten för en slutlig reaktionsvolym på 10 mikroliter.Anneal de kostnadsfria enkelsträngade oligonukleotiderna med hjälp av en termocykler vid 37 grader Celsius i 30 minuter och 95 grader Celsius i fem minuter, följt av en nedrampningshastighet på fem grader Celsius per minut. Därefter tillsätt 25 nanogram plasmid PAAVU6GRNACBHM körsbär till två mikroliter glödgade sgRNA-oligonukleotider för ligering av glödgade sgRNA-oligonukleotider, en mikroliter Sac1-enzym, två mikroliter 10X T4 DNA-ligasbuffert, en mikroliter T4 DNA-ligas och vatten till en slutlig reaktionsvolym på 10 mikroliter. Använd en termocykler och utför ligering genom att inkubera reaktionsblandningen i 15 cykler vid 37 grader Celsius i fem minuter och 25 grader Celsius i fem minuter följt av att hålla vid fyra grader Celsius.Omvandla sedan de kompetenta Escherichia coli DH10B-cellerna med fyra mikroliter av ligeringsprodukten genom värmechock vid 42 grader Celsius i 45 sekunder och sprid på en agarplatta innehållande 10 mikrogram per milliliter Ampicillin. Bekräfta transformerade kolonier med Colony Polymerase Chain Reaction eller PCR med PCR Master Mix, välj kolonin och blanda den med fem mikroliter Master Mix, 0,1 mikroliter universell primer, 0,1 mikroliter sgRNA omvänd primer och fem mikroliter vatten. Kör PCR med initial denaturering vid 94 grader Celsius i två minuter, följt av 35 denatureringscykler vid 94 grader Celsius i 20 sekunder, glödgning i 30 sekunder vid 60 grader Celsius, förlängning vid 72 grader Celsius i 30 sekunder och ett slutligt töjningssteg vid 72 grader Celsius i fem minuter.Efter PCR, lös DNA med agarosgelelektrofores i 0,5X TAE-buffert vid 90 volt i 30 minuter. Skicka in positiva prover för Sanger Sequencing med universell primer. Rengör sedan plasmiden från en positiv klon med hjälp av ett plasmidreningssats enligt tillverkarens instruktioner.Placera den bedövade musen i ryggläge och raka ett litet område på flankerna proximalt till höftlederna för inguinal vit fettvävnad eller IWAT-injektioner med en rakapparat. Tillsätt hårborttagningskräm i fem minuter. Ta bort kvarvarande kräm med vatten för att undvika hudbrännskador.Desinficera huden med tre alternerande rundor för att applicera povidonjodlösningen på huden med ren gasväv och 70% alkohol. Gör sedan ett snitt på en till två centimeter med steriliserad sax i det proximala området i lederna och håll huden öppen med pincett för att exponera fettdepån. WAT kan fästas på huden på båda sidor och förlänga den från början från baksidan och mot testiklarna.Dra försiktigt fettdepån uppåt genom snittet med pincett för att säkerställa att injektionen är på rätt plats och djup. Fyll mikrolitersprutan med 2,5 mikroliter av adenoassocierat virus eller en AAV innehållande sgRNA som riktar sig mot den endogena PRDM16-genen. För försiktigt in nålen i 30–45 graders vinkel i IWAT.Upprepa injektionen fem gånger på olika platser i vävnaden för att homogent infektera hela IWAT-fettkudden. Placera musen på värmedynan tills medvetandet återfått. Övervaka djuret var 10 till 15 minuter tills det återhämtar sig helt.När djuret återfår medvetandet observera lokomotivprofileringen, som ska vara linjär och inte ha några tecken på nöd eller smärta. Se stroma-kärlcellerna eller SVF: erna härledda från adipo SPH-mus IWAT i en 6-brunnsplatta som innehåller komplett DMEM-medium i en till två timmar, aspirera mediet, tvätta brunnen två gånger med PBS och ersätt den med färskt, komplett medium. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 95% luftfuktighet tills cellerna når 70-80% sammanflöde.Vid dag 0, inducera differentiering genom att behandla cellerna med induktionsmediet och efter två dagar ersätta induktionsmediet med underhållsmediet. Återigen efter två dagar, på dag fyra, byt ut underhållsmediet mot ett nytt underhållsmedium i 2-3 dagar. Byt underhållsmedium var 48: e timme tills preadipocyterna är helt differentierade till adipocyter.Observera de mogna adipocyterna med hjälp av ljusmikroskopi eftersom de differentierade cellerna verkar vara laddade med lipiddroppar. Efter att ha odlat cellerna på en 6-brunnsodlingsplatta med hela mediet tills cellerna når 70-80% sammanflöde, blanda 5,6 * 10 ^ 10 viralt genom per mikroliter AAV-bärande sgRNA PRDM16 med två milliliter komplett medium och hexadimetrinbromid. Transducera cellerna genom att ersätta hela mediet och tillsätta hela mediet innehållande AAV.Inkubera de transducerade cellerna i 12 timmar vid 37 grader Celsius, 95% luftfuktighet och 5% koldioxid. Dela och se cellerna som beskrivs för cellproliferation och differentiering i beige adipocyter. Immunofluorescensbilderna från IWAT av adipo SPH-möss visade uttrycket av dCas9 i både kontroll- och PRDM16-grupperna.SPH-inducerat PRDM16-uttryck inducerade tydligt en utbredd ackumulering av multiokulära beige adipocyter till IWAT. Dessutom avslöjade kvantitativ PCR ett ökat uttryck av PRDM16 och det termogena genprogrammet i PRDM16-gruppen jämfört med kontrollen. På liknande sätt bekräftade genuttrycksanalys in vitro det ökade uttrycket av den endogena PRDM16-genen och termogena gener i PRDM16-överuttrycksgruppen jämfört med kontrollgruppen.Det SPH-inducerade PRDM16-uttrycket resulterade i högre basal och maximal syreförbrukning än i kontrollceller. Viktigt är att data indikerade förbättrad okopplad andning i PRDM16-gruppen jämfört med den i kontrollgruppen. Adipo SPH-modellen är lämplig för att undersöka flera gener och reglerande element i adipocyter.Denna metod öppnar möjligheten till en djupare förståelse av beige fettbiologi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; identifiering med elektrokemiska sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiska Rekonstruktioner av Human Cardiac vensystemet med Contrast-datortomografi av Perfusion-fasta prover

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180&#176; Curved Artery Test Section

Experimentell undersökning av sekundärflöde strukturer nedströms en modell av typ IV Stent Misslyckande i en 180 ° Böjd Artery testsektionen

The arterial network in the human vasculature comprises of ubiquitously present blood vessels with complex geometries (branches, curvatures and ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Byggnadsstödd transplantation av islen i epididymisk fettmatta av diabetiska möss

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Använda Syntetisk biologi ingenjör levande celler som har gränssnitt programmerbara material

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-kardiell sido bränning ljus kateter för övervakning cellulär metabolism med transmural Absorbansspektroskopi av parfymera däggdjurs hjärtan

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering av Saccharomyces cerevisiae och skapandet av jäst pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Byggandet av CRISPR Plasmids och detektion av Knockout Effektivitet i däggdjursceller genom en Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

Biaxial basal ton och passiv testning av murina reproduktionssystemet med hjälp av en Tryckmyograph

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...