Name: the establishment of a murine mandibular molar extraction socket healing model
Uploaded: 2023-01-13T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av National Natural Science Foundation of China 81825005 (LY), 82201045 (F.Y.) og 82100982 (F.L.), og av Sichuan Province Science and Technology Program 2021JDRC0144 (F.L.), 2022JDRC0130 (F.Y.).

Alle dyreprosedyrer i denne studien ble gjennomgått og godkjent av den etiske komiteen ved West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2017-041). Voksne C57BL/6-mus, hentet fra en kommersiell kilde (se materialfortegnelse), ble brukt i denne studien.
1. Prekirurgisk forberedelse
<ol><li>Instrument forberedelse<ol><li>Klargjør ulike nåler av engangssprøyter (26G, 25G, 23G; se Materialfortegnelse) som skal brukes som he...

<ol>
	<li>Mamoun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+socket+etiology,+diagnosis,+and+clinical+treatment+techniques.">Dry socket etiology, diagnosis, and clinical treatment techniques.</a> Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 44 (2), 52-58 (2018).</li><li>Laraki, M., Chbicheb, S., El Wady, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolitis:+review+of+the+literature.">Alveolitis: review of the literature.</a> Odonto-Stomatologie Tropicale = Tropical Dental Journal. 35 (139), 19-25 (2012).</li><li>Soundia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteonecrosis+of+the+jaws+(ONJ)+in+mice+after+extraction+of+teeth+with+periradicular+disease.">Osteonecrosis of the jaws (ONJ) in mice after extraction of teeth with periradicular disease.</a> Bone. 90, 133-141 (2016).</li><li>Ara&#250;jo, M. G., Silva, C. O., Misawa, M., Sukekava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+socket+healing:+what+can+we+learn.">Alveolar socket healing: what can we learn.</a> Periodontology 2000. 68 (1), 122-134 (2015).</li><li>Hojo, H., Ohba, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp7+Action+in+the+skeleton:+its+mode+of+action,+functions,+and+relevance+to+skeletal+diseases.">Sp7 Action in the skeleton: its mode of action, functions, and relevance to skeletal diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5647 (2022).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+functions+of+Osterix+are+required+for+bone+growth+and+homeostasis+in+postnatal+mice.">Multiple functions of Osterix are required for bone growth and homeostasis in postnatal mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 12919-12924 (2010).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+differences+in+the+bone+healing+processes+between+tooth+extraction+socket+and+femoral+fracture.">Pathological differences in the bone healing processes between tooth extraction socket and femoral fracture.</a> Bone Reports. 16, 101522 (2022).</li><li>Vasak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+bone+apposition+to+hydrophilic+and+hydrophobic+titanium+implant+surfaces:+a+histologic+and+histomorphometric+study+in+minipigs.">Early bone apposition to hydrophilic and hydrophobic titanium implant surfaces: a histologic and histomorphometric study in minipigs.</a> Clinical Oral Implants Research. 25 (12), 1378-1385 (2014).</li><li>Ara&#250;jo, M. G., Lindhe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensional+ridge+alterations+following+tooth+extraction.+An+experimental+study+in+the+dog.">Dimensional ridge alterations following tooth extraction. An experimental study in the dog.</a> Journal of Clinical Periodontology. 32 (2), 212-218 (2005).</li><li>Kim, I. -. S., Ki, H. -. C., Lee, W., Kim, H., Park, J. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+systemically+administered+bisphosphonates+on+bony+healing+after+tooth+extraction+and+osseointegration+of+dental+implants+in+the+rabbit+maxilla.">The effect of systemically administered bisphosphonates on bony healing after tooth extraction and osseointegration of dental implants in the rabbit maxilla.</a> The International Journal of Oral &amp; Maxillofacial Implants. 28 (5), 1194-1200 (2013).</li><li>Kanyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connective+tissue+growth+factor+expressed+in+rat+alveolar+bone+regeneration+sites+after+tooth+extraction.">Connective tissue growth factor expressed in rat alveolar bone regeneration sites after tooth extraction.</a> Archives of Oral Biology. 48 (10), 723-730 (2003).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFT140+in+early+bone+healing+of+tooth+extraction+sockets.">The role of IFT140 in early bone healing of tooth extraction sockets.</a> Oral Diseases. 28 (4), 1188-1197 (2022).</li><li>Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FasL+is+required+for+osseous+healing+in+extraction+sockets+in+mice.">FasL is required for osseous healing in extraction sockets in mice.</a> Frontiers in Immunology. 12, 678873 (2021).</li><li>Avivi-Arber, L., Avivi, D., Perez, M., Arber, N., Shapira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+bone+healing+at+tooth+extraction+sites+in+CD24-deficient+mice:+A+pilot+study.">Impaired bone healing at tooth extraction sites in CD24-deficient mice: A pilot study.</a> PLoS One. 13 (2), 0191665 (2018).</li><li>Vieira, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembranous+bone+healing+process+subsequent+to+tooth+extraction+in+mice:+micro-computed+tomography,+histomorphometric+and+molecular+characterization.">Intramembranous bone healing process subsequent to tooth extraction in mice: micro-computed tomography, histomorphometric and molecular characterization.</a> PLoS One. 10 (5), 0128021 (2015).</li><li>Min, K. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+resveratrol+on+bone-healing+capacity+in+the+mouse+tooth+extraction+socket.">Effects of resveratrol on bone-healing capacity in the mouse tooth extraction socket.</a> Journal of Periodontal Research. 55 (2), 247-257 (2020).</li><li>Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+controls+of+Sonic+hedgehog+guarantee+fidelity+of+epithelial+adult+stem+cells+trajectory+in+regeneration.">Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration.</a> Science Advances. 8 (29), (2022).</li><li>Kuroshima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+noncultured+stromal+vascular+fraction+cells+of+adipose+tissue+ameliorates+osteonecrosis+of+the+jaw-like+lesions+in+mice.">Transplantation of noncultured stromal vascular fraction cells of adipose tissue ameliorates osteonecrosis of the jaw-like lesions in mice.</a> Journal of bone and Mineral Research. 33 (1), 154-166 (2018).</li><li>Ahel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+that+fracture+teeth+during+extraction+with+mandibular+premolar+and+maxillary+incisor+forceps.">Forces that fracture teeth during extraction with mandibular premolar and maxillary incisor forceps.</a> The British Journal of Oral &amp; Maxillofacial Surgery. 53 (10), 982-987 (2015).</li></ol>

Murine socket healing-modellen er en viktig metode for å avdekke de underliggende mekanismene i beinheling og regenerering, og til slutt løse kliniske utfordringer. Eksisterende studier har vist muligheten for snittekstraksjonsmodellen og den maksillære molare ekstraksjonsmodellen, mens studier ikke har brukt den første jekselmodellen13,17,18. Imidlertid er fortenner avgjørende for gnagerliv, og deres svekkelse kan være d?...

Socket healing etter tanntrekking er et vanlig klinisk scenario, noe som kan resultere i upassende komplikasjoner som socket blødning, tørr socket, eller til og med kjeve osteomyelitt under uønsket helbredelse 1,2,3. Disse komorbiditetene kan svekke livskvaliteten til pasienter og, enda verre, vitalt utfordre proteserehabilitering på grunn av massivt bentap4. Selv om stikkontakthelingsstadiene er belyst, er de utilstrekkelige til å lede klinisk behandling etter tanntrekkingskirurgi i møte med ulike prognoseutfordringer4.
Flere studier basert på dyremodeller har blitt utført for å få en bedre forståelse av de underliggende mekanismene i sokkelhelingsprosessen og avverge de ovennevnte situasjonene. Sp7 er en hovedregulator i osteoblastdifferensiering, og spiller en viktig rolle i skjelettutvikling, beinhemostase og beinregenerering 5,6. Rasjonelle socket healing modeller kan vise redundans av Sp7 posttraumatisk i bein regenerering. I tillegg, til forskjell fra tilheling av lange beinbrudd, involverer bare en enkelt osteogen prosess, intramembranøs ossifikasjon, helingsprosessen til ekstraksjonssokkelen7. Dette gjør dyretanntrekkingsmodellen optimal for å studere implantatbaserte terapier, da implantatets osseointegrasjon adlyder den samme osteogene regel8.
I flere tiår har tanntrekkingsmodellen blitt utført på rotter, kaniner og hunder, siden disse artene har store tenner som er praktiske å operere på 9,10,11. Men gitt de blomstrende kravene til genetisk modifisering og som en mer adaptiv genetisk bakgrunn for mennesker, blir mus i økende grad brukt til å etablere en tannutvinningsmodell. Fremover kunne forskere avdekke en bestemt cellepopulasjons rolle i socket-helbredelsesprosessen ved hjelp av genommodifiserte mus i stedet for å observere fenotyper bare12. Blant murine tanntrekking socket modeller, tidligere studier har vist etablering og helbredelse prosessen med murine maxillary tann og fortennen ekstraksjon sockets13,14,15,16. Imidlertid kan helbredelsesmønsteret til prognosen, og detektiv- og observasjonstidspunktene, variere på tvers av protokoller. Dette appellerer til et universelt kriterium for forskere å etablere en murine socket healing modell.
Denne studien hadde som mål å utgjøre en praktisk gjennomførbar modell for helbredelse av murine socket for de ovennevnte problemene. Mandible molarer hos mus har særegne morfologiske egenskaper sammenlignet med maksillære molarer og snitt, noe som gir unike fordeler og ulemper. Siden modellene som fokuserer på murine mandibelen for tiden er vakuumbaserte, forsøkte denne protokollen å gi en oppnådd metode for å trekke ut mandibulær første molar i mus. Vi håper denne protokollen vil opplyse grunnleggende forskere med nye ideer for å avdekke underliggende mekanismer for socket healing og indikere klinisk behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23/25/26 G needle</td>
			<td>Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus &#38; Instruments Co. LTD.</td>
			<td>SB1-074(IV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J&#160;</td>
			<td>Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China</td>
			<td>C57/B6J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Solution&#160;</td>
			<td>Beyotime&#160;</td>
			<td>Cat#C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST Scientific</td>
			<td>80106-1100-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science Co.,Ltd</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#8217;s Trichrome Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Sodium</td>
			<td>Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>2018042001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal&#160;</td>
			<td>anti-Sp7&#160;</td>
			<td>Abcam Cat# ab22552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus &#38; Instruments Co. LTD.</td>
			<td>SB2-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment of a murine mandibular molar extraction socket healing model

Denne studien introduserer utviklingen av en molær ekstraksjonsmodell i murine mandibelen for å gi en praktisk modell for å studere alveolær beinregenerering og intramembranøs ossifikasjon. C57 / J6-mus ble brukt til å trekke ut mandibulær første molar for å etablere denne modellen. De ble avlivet, og de bilaterale mandiblene høstet, henholdsvis 1 uke og 4 uker etter operasjonen. Påfølgende seriell stereoskopisk høsting, histologisk vurdering og immunfluorescensfarging ble utført for å demonstrere vellykket kirurgi. Umiddelbart etter operasjonen viste de stereoskopiske bildene en tom ekstraksjonskontakt. Hematoksylin og eosin (H&E) ved 1 uke og Masson-farging 4 uker etter operasjonen viste at området av den opprinnelige roten var henholdsvis delvis og fullstendig fylt med bentrabekler. Immunfluorescensfargingen viste at Sp7-uttrykket økte 1 uke etter operasjonen sammenlignet med homeostasesiden, noe som tyder på kraftig osteogenese i alveolær fossa. Alle disse resultatene demonstrerte en praktisk gjennomførbar modell for reparasjon av murine tanntrekking. Kommende studier som avslører mekanismene for kjevebensdefektheling eller socket healing kan vedta denne metoden.

For å belyse den praktiske bruken av denne metoden ble den høyre kjevemolare av to friske C57BL/6-mus (3 måneder gamle, begge hunnlige) ekstrahert og fulgt i henholdsvis 1 uke og 4 uker. De uskadet venstre mandiblene ble brukt som sunne kontroller. Figur 1A viser de spesifikke egenskapene til det kirurgiske apparatet, inkludert 26-23 G nåler og en tannet oftalmisk pinsett. 26 G-kanylen er spissfjernet og bøyd. 25 G kanylen bøyes ca. 25° ved målepunktet. 23 G nålene er krumtappen for...

Watch this Scientific Journal Video about The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model at JoVE.com

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Denne protokollen demonstrerer trinnvise detaljer om hvordan du trekker ut den første jekselen i musen. Det gir en alternativ metode for forskere som fokuserer på kjevebenheling og regenerering.

Etableringen av en murine mandibulær molar ekstraksjon socket healing modell

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Denne protokollen gir en murine mandibulær molar ekstraksjonsmodell som sjelden introduseres i tilgjengelige benregenereringsstudier. Utvikling av en murine mandibulær molar ekstraksjonsmodell er nødvendig som en mandible som er mer sammenlignbar og konsistent blant ulike intervensjonsgrupper. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg ikke mot terapi av noen sykdom.Det kan imidlertid hjelpe klinisk helbredelse og kjevebenregenerering i det lange området ved å bidra til å gjennomgå mekanismene som ligger til grunn for denne prosessen. Denne teknikken ble utviklet for å hjelpe studiene, og avslørte mekanismene for tilgjengelig helbredelse og regenerering. Dessverre kan denne metoden ikke brukes på andre systemer.Begynn å eliminere den distale motstanden til den bedøvede musen ved å holde molaren med pinsett medialt. Tving deretter en 23 gauge nål inn i bukkal alveolar bein av distalroten og gjengi et intervall. Deretter bytter du til en 25 gauge nål for å fortsette intervallutvidelsen.Fremgang delikat mot det periapiske området mens du sakte roterer nålen fremover og sløvt for å presse roten ut av alveolar fossa. For å eliminere mesial motstand, sett en 23 gauge nål inn i rotgaffelen og løft molaren av okklusjon. Etter å ha holdt molaren tett, ta en annen 23 gauge nål og tving den inn i den linguale mesial periodontale membranen for å skape et intervall.Bruk deretter en 25 gauge nål og roter sakte fremover og bukkalt. Hvis noen underliggende hindringer hindrer luksasjonen av jekslen, bruk en 26 gauge nål for å trenge inn i roten apex og gjenta operasjonene. Under den endelige ekstraksjonen, trekk ut tannen slik at kronen stiger over okklusjonsplanet og at to intakte røtter tydelig kan ses.Etter vellykket ekstrahering av mandibulær første molar, bruk tørr bomull for å stoppe blødningen, reposisjoner tungen, administrer analgesi, og legg musen på en konstant temperatur varmepute til den gjenoppretter fra anestesi. Tannkontakten umiddelbart fylt med blodpropp etter ekstraksjon. Helingsprosessen til stikkontakten ble observert i en uke.Noen svamplignende trabekulære bein ble dannet, men blodproppen forble. I helbredelsesprosessen ble stikkontakten fylt med svampben etter to uker, noe som indikerer fullføring av regenerering. En masterregulator i osteoblastdifferensieringer Sp7 ble mye uttrykt i benmargscellene i margen, som er bendannende front.Under homeostasetilstanden var de trabekulære beinene konsistente og sammenflytende med benmargscelleblokker drysset som øyer. En uke etter operasjonen fylte mange Sp7 uttrykksceller ekstraksjonssokkelen med nydannet trabekulært bein drysset rundt. Fire uker etter operasjonen snudde tilstanden og gikk over til i stor grad å smelte sammen til trabekulært bein.Aktiviteten til Sp7-uttrykkende celler falt til et nivå som nærmet seg homeostasetilstanden. Den kan også utføres for å demonstrere nyfødt regenereringsprosess. Denne teknikken kan hjelpe forskere til å avdekke de underliggende mekanismene for tilgjengelig helbredelses- og regenereringsprosess ved å gi en ny murinmodell.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyrer: En enkel og Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

En Morphometric og mobilnettet analysemetode for Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Den Murine kolin dårlig, Ethionine-supplert (CDE) kosthold modell av kroniske skader

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

En Murine modell av vertikal ermet Gastrectomy

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Av en klonal kultur av encellede bøye alger

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...