Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af University Synergy Innovation Program i Anhui-provinsen (GXXT-2021-077) og Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).

Alle procedurer fulgte retningslinjerne i National Institutes of Health's Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publikation nr. 8023, revideret 1978) og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical School of Anhui University of Science and Technology.
1. Håndtering og fodring af mus
<ol><li>Tildel 20 raske C57BL/6 hanmus til forsøgs- eller vehikelgrupperne i forholdet 1:1. Akklimatisere musene til det nye miljø i 1 uge.</li>
	<li>Gi...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

Silikose musemodeller er afgørende for at studere patogenese og behandling af silikose. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af en model af silikose hos mus gennem gentagen nasal eksponering. Denne metode muliggør undersøgelse af de patologiske egenskaber ved silikose induceret af forskellige eksponeringstider. Mus blev bedøvet på en ventilator, og deres respirationsfrekvens blev overvåget. Den indledende korte, hurtige vejrtrækning blev gradvist langsommere og dybere over tid. Anæstesien fik musen...

Arbejdstagere udsættes uundgåeligt for uregelmæssigt krystallinsk silikatstøv (CSD), som kan indåndes og er mere giftigt i mange erhvervsmæssige sammenhænge, herunder minedrift, keramik, glas, kvartsforarbejdning og beton 1,2. En kronisk støvindåndingstilstand kendt som silikose forårsager progressiv lungefibrose3. Ifølge epidemiologiske data har forekomsten af silikose været faldende globalt i løbet af de sidste par årtier, men i de senere år har den været stigende og påvirker yngre mennesker 4,5,6. Den underliggende mekanisme for silikose udgør en betydelig udfordring for videnskabelig forskning på grund af dens lumske begyndelse og langvarige inkubationstid. Det er stadig ukendt, hvordan silikose udvikler sig. Desuden kan ingen nuværende medicin stoppe udviklingen af silikose og omvendt lungefibrose.
De nuværende musemodeller for silikose involverer trakealindtagelse af en blandet suspension af CSD. For eksempel overholder administration af CSD i lungerne ved at vedtage cervikal luftrørstraumet efter anæstesi ikke gentagen menneskelig eksponering for farvestøv7. Virkningerne af eksponering for omgivende støv for enkeltpersoner kan undersøges ved at udsætte dem for CSD i form af aerosoler, som mere nøjagtigt afspejler miljøkoncentrationerne af dette giftige stof8. Imidlertid kan miljø-CSD ikke bare inhaleres direkte i lungerne på grund af den unikke fysiologiske struktur af musenæsen9. Desuden er udstyret forbundet med denne teknologi dyrt, hvilket har fået forskere til at revurdere mussilikosemodellenmodel 10. Ved at inhalere CSD-suspension gennem et næsedrop fem gange inden for 2 uger var det muligt at opbygge en dynamisk model af silikose. Denne model er konsistent og sikker, samtidig med at den er nem at bruge. Det er vigtigt at bemærke, at denne undersøgelse giver mulighed for gentagen indånding af CSD hos mus. Den musesilikosemodel, der oprettes gennem denne procedure, forventes at være mere gavnlig for forskningskravene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

Silikose kan skyldes udsættelse for respiratorisk krystallinsk silicastøv (CSD) i et industrielt miljø. Patofysiologi, screening og behandling af silikose hos mennesker er alle blevet grundigt undersøgt ved hjælp af musesilikosemodellen. Ved gentagne gange at få mus til at inhalere CSD i lungerne kan musene efterligne de kliniske symptomer på human silikose. Denne metode er praktisk og effektiv med hensyn til tid og output og forårsager ikke mekanisk skade på det øvre luftveje på grund af kirurgi. Desuden kan denne model med succes efterligne akut/kronisk transformationsproces af silikose. De vigtigste procedurer var følgende: Det steriliserede 1-5 μm CSD-pulver blev fuldt malet, suspenderet i saltvand og dispergeret i et ultralydsvandbad i 30 minutter. Mus under isofluran-induceret anæstesi skiftede fra lav hurtig vejrtrækning til dyb, langsom aspiration i ca. 2 s. Musen blev placeret i håndfladen, og tommelfingerspidsen rørte forsigtigt læbekanten af musens kæbe for at rette luftvejene. Efter hver udånding indåndede musene silicasuspensionen dråbe for dråbe gennem et næsebor og afsluttede processen inden for 4-8 s. Efter at musenes vejrtrækning var stabiliseret, blev deres bryst aet og kærtegnet for at forhindre, at den inhalerede CSD blev hostet op. Musene blev derefter returneret til buret. Afslutningsvis kan denne model kvantificere CSD langs den typiske fysiologiske passage af små partikler ind i lungen, fra det øvre luftveje til de terminale bronchioler og alveoler. Det kan også replikere medarbejdernes tilbagevendende eksponering på grund af arbejde. Modellen kan udføres af en person og behøver ikke dyrt udstyr. Det simulerer bekvemt og effektivt sygdomsegenskaberne ved human silikose med høj repeterbarhed.

Den potentielle patogenese af silikose hos mus blev undersøgt ved anvendelse af den foreslåede metode. Vi fandt, at kropsvægten hos musene i forsøgsgruppen faldt signifikant i forhold til kontrolgruppen, og at kropsvægten langsomt kom sig efter ophør af eksponering. På grund af den optimerede dosis, der anvendes her, blev der ikke observeret dødelighed hos silicaeksponerede mus i dette eksperiment. Den tekniske køreplan for gentagen næsedryp til CSD er vist i (figur 1). De tidliger...

Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Denne protokol beskriver en metode til etablering af en musemodel af silikose gennem gentagen eksponering for silicasuspensioner via et næsedrop. Denne model kan effektivt, bekvemt og fleksibelt efterligne den patologiske proces af human silikose med høj repeterbarhed og økonomi.

En silikosemodel med mus etableret ved gentagen indånding af krystallinsk silikatstøv

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

I den beskrevne musesilikosemodel genereret ved intralaserinfusion af krystalsilicastøv simulerede al CSD-suspension flere gange forekomsten og udviklingen af human silikose i vid udstrækning. Denne metode er tidsbesparende og niveaubesparende, såvel som praktisk og effektiv. Endvidere forårsager ingen mekanisk skade på det øvre luftveje på grund af drift.Denne metode kan også bruges til at forberede sygdomsmodeller af vira, bakterier osv. Hangbing Cao, en kandidatstuderende fra mit laboratorium, der er dygtig til at forberede silikosemusemodellen, demonstrerer proceduren. Begynd med at forberede det krystallinske silikatstøv eller CSD mindst en dag før administration af næsedråberne.For at gøre det skal du male silica i en agatmørtel i en halv time. For at kontrollere partikelstørrelse og form skal du forberede prøven til scanning elektronmikroskopi eller SEM ved hjælp af ledende tape til at binde siliciumpartiklerne. Brug en hårtørrer til forsigtigt at blæse partiklerne væk, der ikke er fast bundet, før du fortsætter med at tage billedet.Bland derefter jorden silica og sterilt saltvand i en koncentration på 20 milligram pr. Milliliter ved hjælp af en ultralydsryster. Endelig hvirvel den forberedte CSD-suspension i 10 sekunder. Administrer 50 mikroliter CSD til den bedøvede mus via et næsedrop i fire til otte sekunder.Behandl kontrolmusen med en lige stor mængde saltvand, hold derefter musens krop med håndfladen, klem huden på bagsiden af nakken med tommelfingeren og pegefingeren, mens du fastgør musens bagben med de andre fingre. Tryk musens hjertebankende område forsigtigt med den anden pegefinger fem til 10 gange i fem sekunder. Opvarm paraffinindlejret lungevæv på en kogeplade ved 60 grader Celsius i over fire timer.For at afvokse og hydrere paraffinsektionen blødlægges objektglasset i xylen i 30 minutter to gange, dyppes derefter sekventielt i glasset i fem minutter hver i vandfri 95% 85% og 75% ethanol og til sidst i deioniseret vand, og læg derefter objektglasset i hæmatoxylinfarvningspanden i 10 minutter, før du skyller forsigtigt under rindende vand i fem minutter. Dyp det i eosin-farvningspanden i 10 sekunder. Efter dehydrering af prøven i 75% 85% 95% og vandfri ethanol i fem minutter hver, ryddes vævssektionen ved at nedsænke den i xylen i fem minutter og forsegles med ca. 60 mikroliter neutrale harpiksdråber.Placer forsigtigt dækslet glide over sektionen. Til Masson-farvning plettes de afvoksede og hydrerede paraffinprøver med frisklavet 50% Weigerts hæmatoxylin i 10 minutter, og efter iblødsætning af vævet i sur ethanolvæske i 10 sekunder skylles glideren forsigtigt med rindende vand til kerneblåning. Plet derefter prøven med dråber rød farvningsopløsning i syv minutter, og vask med 30% saltsyrearbejdsopløsning i et minut.Efter at have dyppet objektglasset i 95% alkohol i 20 sekunder, dehydreres prøven med vandfri ethanol i et til tre sekunder to gange, og som vist før, ryddes og forsegles prøven. Til Sirius rød farvning infiltreres den afvoksede og hydrerede sektion i en time med Sirius rød farvningsopløsning, og pletter derefter cellekernerne i otte til 10 minutter med Mayer hematoxlyn farvningsopløsning. Skyl det forsigtigt under rindende vand i 10 minutter, før du dehydrerer, rydder og forsegler diaset.Infiltrer den afvoksede og hydrerede paraffinprøve med 30 ml af en tre milligram pr. milliliter EDTA-antigenhentningsopløsning. Kog prøven i 20 til 30 minutter, før den vaskes med deioniseret vand og inkuberes i PBST i fem minutter. Prøven lægges i blød i 15 minutter med frisklavet 0,3% hydrogenperoxidopløsning, og den vaskes tre gange i fem minutter hver med PBST.Permeabiliser membranen i prøven i 15 minutter med 0,3% Triton 100-opløsning og bloker med 30 til 40 mikroliter 5% bovin serumalbumin eller BSA i en time. Efter fjernelse af blokeringsopløsningen tilsættes passende fortyndede primære antistoffer NF-kappa B og CD-68, og prøven inkuberes natten over ved to til otte grader Celsius i en mikroskopglas IHC-vådboks. Næste dag, efter overførsel af prøven til stuetemperatur i en time, vaskes den tre gange i fem minutter hver med PBST.Inkuber prøven i en time i kanin anti-mus peberrodsperoxidase mærket sekundære antistoffer ved stuetemperatur. Efter inkubation vaskes prøverne igen tre gange i fem minutter hver med PBST, hvorefter prøven inkuberes med DAB-substratet svarende til det enzymmærkede antistof i fem til 20 minutter. Efter at have slukket reaktionen med deioniseret vand, modpletter prøven i 30 sekunder med Weigerts hæmatoxylin.Skyl det under rindende vand i et minut, dehydrer, ryd og forsegl vævet. Før du fortsætter til western blot-analyse, homogeniseres vævet med RIPA-arbejdsløsning på is i fem minutter ved hjælp af en håndholdt elektrisk kværn. Inkuber i en time på is med omrystning, og centrifuger homogenatet ved 14.800 G i 15 minutter ved fire grader Celsius.Supernatanten opsamles, og proteinkoncentrationen bestemmes med et BCA-proteinanalysesæt. Der tilsættes 20 mikroliter 5X stødbuffer til supernatanten, og derefter opvarmes de seks mikrogram pr. mikroliter proteinoplagringsopløsning, der er tilberedt med RIPA, i et metalbad ved 100 grader Celsius i 20 minutter. Opbevar 100 mikroliter alikvoter af proteinopløsningen i hvert rør ved minus 80 grader Celsius.Til elektroforese fortyndes delprøverne til to til tre mikrogram pr. mikroliter med RIPA-lysat, og der tilsættes derefter 20 mikrogram prøve pr. hul for at køre gelen. Overfør proteinet til en PVDF-membran, der er foraktiveret med methanol i 20 sekunder ved hjælp af vådoverførselsmetoden med 400 milliampere strøm i en til to timer. Efter vask af membranen fem gange i fem minutter hver med PBST-opløsning, bloker med 5% BSA eller skummetmælk i en time.Nedsænk strimlerne i den primære antistofopløsning indeholdende NF-kappa B og beta-actin fortyndet med 5% BSA. Ryst strimlerne forsigtigt natten over ved to til otte grader Celsius, før du vasker dem med PBST. Derefter inkuberes strimlerne, først i det fortyndede sekundære antistof i en time ved stuetemperatur med forsigtig omrystning og derefter med forbedret kemiluminescensudvikler i tre minutter.Udsæt strimlen for et gelbillede i 20 sekunder, og mål den grå værdi af strimlen for at vurdere proteinniveauet ved hjælp af systemsoftware. SEM-billederne af CSD viste, at partiklerne var uregelmæssigt formede. Sirius røde farvning udført for at måle kollagenaflejring viste, at progressionen af lungefibrose hos mus blev signifikant accelereret ved CSD-eksponering i en måned.Polariserende mikroskopi afslørede tre forskellige typer kollagenfibre, hvoraf type et kollagenfibre vist i rødt er en risikofaktor for silikose, men der blev ikke fundet nogen signifikant fibrose i køretøjsgruppen. Dette blev også indikeret af de respektive fibrose scores. HE-farvning af CSD-behandlet muselungevæv viste typiske silicaknuder karakteriseret ved flydende nekrose efter fagocytose af CSD i midten omgivet af makrofager i periferien.Massonfarvning viste også, at knuderne var beriget med CSD ledsaget af fibrose. Den immunhistokemiske farvning af CD-68 afslørede yderligere den brede tilstedeværelse af makrofager i lungevæv. Polariseret lysmikroskopi viste, at disse makrofager havde indtaget CSD og forårsaget alvorlig lungeskade.Immunhistokemisk farvning viste højere NF-kappa B-farvning, hvilket indikerer højere inflammatorisk respons i den CSD-behandlede gruppe end i vehikelgruppen. Repræsentativ western blot viste også, at de CSD-behandlede mus havde højere NF-kappa B-ekspression i lungen, og forskellen i ekspression mellem de to grupper var signifikant. For at undgå respiratorisk obstruktion og fremme respiratorisk genopretning skal musens hjerteområde forsigtigt masseres fem til 10 gange som demonstreret efter en periode på fem sekunder.Denne model kan udforske nogle underliggende mekanismer for silikose og hjælpe terapeutisk lægemiddelscreening sammen med etablering af afgørende parametre som dosering og varighed. Denne teknologi tilbyder et praktisk, effektivt og økonomisk middel til at udsætte musemodeller for partikler, uanset om dette tilføjer bakterier. Overvågning af musadfærd kan hjælpe med at bestemme de potentielle virkninger af indånding af partikler.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Musemodel af kirurgisk induceret Endometriose af Auto-transplantation af uterin væv

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Kortlægning af cerebrovaskulær Reaktivitet via Gas Indånding Udfordringer

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Tørt pulver og forstøvet Aerosol Indånding af Pharmaceuticals tildelt til mus Ved hjælp af en næse-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Gentagen Måling af åndedrætsorganer muskel aktivitet og ventilation i musemodeller af Neuromuskulær sygdom

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Generation af en kronisk obstruktiv lungesygdom Model i mus ved gentagne ozon eksponering

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Vinyl klorid og højt fedtindhold kost som en model for miljø og fedme interaktion

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vurdering af de luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding ved at udsætte dyrkede humane lungeceller ved luftflydende interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...