Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het University Synergy Innovation Program van de provincie Anhui (GXXT-2021-077) en het Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).

Alle procedures volgden de richtlijnen van de National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publicatie nr. 8023, herzien in 1978) en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical School van de Anhui University of Science and Technology.
1. Muizen beheren en voeren
<ol><li>Wijs 20 gezonde C57BL/6 mannelijke muizen toe aan de experimentele of voertuiggroepen in een verhouding van 1:1. Laat de muize...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

Silicose muismodellen zijn cruciaal voor het bestuderen van de pathogenese en behandeling van silicose. Dit protocol beschrijft een methode voor het opstellen van een model van silicose bij muizen door herhaalde nasale blootstelling. Deze methode maakt het mogelijk om de pathologische kenmerken van silicose geïnduceerd door verschillende blootstellingstijden te bestuderen. Muizen werden verdoofd aan een beademingsapparaat en hun ademhalingsfrequentie werd gecontroleerd. De aanvankelijke korte, snelle ademhaling vertraag...

Werknemers worden onvermijdelijk blootgesteld aan onregelmatig kristallijn silicastof (CSD), dat kan worden ingeademd en giftiger is in tal van beroepscontexten, waaronder mijnbouw, aardewerk, glas, kwartsverwerking en beton 1,2. Een chronische aandoening bij het inademen van stof, bekend als silicose, veroorzaakt progressieve longfibrose3. Volgens epidemiologische gegevens is de incidentie van silicose de afgelopen decennia wereldwijd afgenomen, maar de laatste jaren neemt het toe en treft het jongere mensen 4,5,6. Het onderliggende mechanisme van silicose vormt een grote uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek vanwege het sluipende begin en de langdurige incubatietijd. Het is nog onbekend hoe silicose ontstaat. Bovendien kan geen enkel huidig medicijn de progressie van silicose en omgekeerde longfibrose stoppen.
De huidige muismodellen voor silicose omvatten tracheale inname van een gemengde suspensie van CSD. Bijvoorbeeld, het toedienen van CSD in de longen door het cervicale luchtpijptrauma na anesthesie over te nemen, voldoet niet aan herhaalde menselijke blootstelling aan kleurstof. Het effect van blootstelling aan omgevingsstof op personen kan worden bestudeerd door hen bloot te stellen aan koolzuurhoudende stoffen in de vorm van aerosolen, die de concentraties van deze giftige stof in het milieu nauwkeuriger weergeven8. CSD uit de omgeving kan echter niet zomaar rechtstreeks in de longen worden ingeademd vanwege de unieke fysiologische structuur van de muizenneus9. Bovendien is de apparatuur die aan deze technologie is gekoppeld duur, wat ertoe heeft geleid dat onderzoekers het muizensilicosemodel10 opnieuw hebben geëvalueerd. Door binnen 2 weken vijf keer CSD-suspensie via een neusinfuus te inhaleren, was het mogelijk om een dynamisch model van silicose op te bouwen. Dit model is consistent en veilig en toch gebruiksvriendelijk. Het is belangrijk op te merken dat deze studie herhaalde inhalatie van CSD bij muizen mogelijk maakt. Het silicosemodel voor muizen dat via deze procedure wordt gemaakt, zal naar verwachting gunstiger zijn voor onderzoeksvereisten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

Silicose kan worden veroorzaakt door blootstelling aan respiratoir kristallijn silicastof (CSD) in een industriële omgeving. De pathofysiologie, screening en behandeling van silicose bij mensen zijn allemaal uitgebreid bestudeerd met behulp van het muissilicosemodel. Door muizen herhaaldelijk CSD in hun longen te laten inhaleren, kunnen de muizen de klinische symptomen van menselijke silicose nabootsen. Deze methodologie is praktisch en efficiënt in termen van tijd en output en veroorzaakt geen mechanisch letsel aan de bovenste luchtwegen als gevolg van een operatie. Bovendien kan dit model met succes het acute/chronische transformatieproces van silicose nabootsen. De belangrijkste procedures waren als volgt. Het gesteriliseerde CSD-poeder van 1-5 μm werd volledig gemalen, gesuspendeerd in zoutoplossing en gedurende 30 minuten in een ultrasoon waterbad gedispergeerd. Muizen onder isofluraan-geïnduceerde anesthesie schakelden gedurende ongeveer 2 seconden over van oppervlakkige snelle ademhaling naar diepe, langzame aspiratie. De muis werd in de palm van een hand geplaatst en de duimtop raakte zachtjes de liprand van de kaak van de muis om de luchtweg recht te trekken. Na elke uitademing ademden de muizen de silicasuspensie druppel voor druppel in door één neusgat, waardoor het proces binnen 4-8 s werd voltooid. Nadat de ademhaling van de muizen was gestabiliseerd, werd hun borst gestreeld en gestreeld om te voorkomen dat de geïnhaleerde CSD zou worden opgehoest. De muizen werden vervolgens teruggebracht naar de kooi. Concluderend kan dit model CSD kwantificeren langs de typische fysiologische doorgang van kleine deeltjes in de longen, van de bovenste luchtwegen naar de terminale bronchiolen en longblaasjes. Het kan ook de terugkerende blootstelling van werknemers als gevolg van het werk nabootsen. Het model kan door één persoon worden uitgevoerd en heeft geen dure apparatuur nodig. Het simuleert handig en effectief de ziektekenmerken van menselijke silicose met een hoge herhaalbaarheid.

De potentiële pathogenese van silicose bij muizen werd onderzocht met behulp van de voorgestelde methode. We ontdekten dat het lichaamsgewicht van de muizen in de experimentele groep significant afnam ten opzichte van de controlegroep en dat het lichaamsgewicht langzaam herstelde na stopzetting van de blootstelling. Vanwege de geoptimaliseerde dosis die hier werd gebruikt, werd in dit experiment geen sterfte waargenomen bij aan silica blootgestelde muizen. Het technische stappenplan van herhaalde neusdruppel naar CSD wo...

Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Dit protocol beschrijft een methode voor het opstellen van een muismodel van silicose door herhaalde blootstelling aan silicasuspensies via een neusinfuus. Dit model kan efficiënt, gemakkelijk en flexibel het pathologische proces van menselijke silicose nabootsen met een hoge herhaalbaarheid en economie.

Een silicosemuismodel dat tot stand komt door herhaalde inademing van kristallijn silicastof

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

In het beschreven silicosemodel van muizen dat wordt gegenereerd door intralaserinfusie van kristalsilicastof, simuleerden alle CSD-suspensie meerdere keren het optreden en de ontwikkeling van menselijke silicose in grote mate. Deze methode is tijdbesparend en niveaubesparend, maar ook praktisch en effectief. Veroorzaakt verder geen mechanisch letsel aan de bovenste luchtwegen als gevolg van de operatie.Deze methode zou ook kunnen worden gebruikt om ziektemodellen van virussen, bacteriën, et cetera te maken. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hangbing Cao, een masterstudent uit mijn laboratorium, die bekwaam is in het voorbereiden van het silicose-muismodel. Begin met het bereiden van het kristallijne silicastof of CSD ten minste één dag voordat u de neusdruppels toedient.Maal hiervoor silica een half uur in een agaatvijzel. Om de deeltjesgrootte en -vorm te controleren, bereidt u het monster voor op scanning-elektronenmicroscopie of SEM met behulp van geleidende tape om de siliciumdeeltjes te binden. Blaas met een föhn voorzichtig de deeltjes weg die niet stevig zijn gehecht voordat u doorgaat met het vastleggen van het beeld.Meng vervolgens het gemalen silica en de steriele zoutoplossing in een concentratie van 20 milligram per milliliter met behulp van een ultrasone shaker. Draai ten slotte de voorbereide CSD-suspensie gedurende 10 seconden in een draaikolk. Dien 50 microliter CSD toe aan de verdoofde muis via een neusinfuus gedurende vier tot acht seconden.Behandel de controlemuis met een gelijke hoeveelheid zoutoplossing, houd vervolgens het lichaam van de muis vast met de handpalm, knijp met de duim en wijsvinger in de huid aan de achterkant van de nek terwijl u de achterpoten van de muis met de andere vingers vastzet. Druk vijf tot 10 seconden lang vijf tot tien keer zachtjes met de andere wijsvinger op het kloppende hartgebied van de muis. Verwarm het in paraffine ingebedde longweefsel op een kookplaat bij 60 graden Celsius gedurende meer dan vier uur.Om het paraffinegedeelte van was te ontdoen en te hydrateren, laat u het glaasje twee keer 30 minuten in xyleen weken, dompelt u het glaasje vervolgens achtereenvolgens vijf minuten in watervrij 95%85% en 75% ethanol, en ten slotte in gedeïoniseerd water, en plaatst u het glaasje vervolgens 10 minuten in de hematoxylinekleuringsemmer voordat u het gedurende vijf minuten voorzichtig afspoelt onder stromend water. Dompel het 10 seconden in de eosinekleuringsemmer. Na het uitdrogen van het monster in 75%85%95% en watervrije ethanol gedurende elk vijf minuten, maakt u het weefselgedeelte vrij door het vijf minuten onder te dompelen in xyleen en sluit u het af met ongeveer 60 microliter neutrale harsdruppels.Plaats de afdekschuif voorzichtig over het gedeelte. Voor het kleuren van Masson kleurt u de ontwaxte en gehydrateerde paraffinemonsters gedurende 10 minuten met vers bereide 50%Weigert's hematoxyline, en spoelt u het objectglaasje na 10 seconden weken in zure ethanolvloeibaarheid voorzichtig af met stromend water voor blauwvorming van de kernen. Kleurt het monster vervolgens gedurende zeven minuten met druppels rode kleuroplossing en was het gedurende één minuut met 30% zoutzuurwerkoplossing.Nadat u het objectglaasje gedurende 20 seconden in 95% alcohol hebt ondergedompeld, droogt u het monster twee keer één tot drie seconden uit met watervrije ethanol en maakt u, zoals eerder aangetoond, het monster helder en verzegeld. Voor Sirius-roodkleuring infiltreert u het van was ontdeed en gehydrateerde gedeelte gedurende een uur met Sirius-roodkleuringsoplossing en kleurt u vervolgens de celkernen gedurende acht tot 10 minuten met Mayer hematoxlyn-kleuringsoplossing. Spoel het voorzichtig af onder stromend water gedurende 10 minuten voordat u het glaasje uitdroogt, opruimt en verzegelt.Infiltreer het ontwaxte en gehydrateerde paraffinemonster met 30 milliliter van een EDTA-antigeenoplossing van drie milligram per milliliter. Kook het monster 20 tot 30 minuten voordat u het wast met gedeïoniseerd water en het gedurende vijf minuten in PBST incubeert. Week het monster gedurende 15 minuten met vers bereide 0,3% waterstofperoxide-oplossing en was het driemaal gedurende vijf minuten met PBST.Permeabiliseer het membraan van het monster gedurende 15 minuten met 0,3%Triton 100-oplossing en blokkeer met 30 tot 40 microliter 5%runderserumalbumine of BSA gedurende een uur. Voeg na het verwijderen van de blokkerende oplossing op de juiste manier verdunde primaire antilichamen NF-kappa B en CD-68 toe en incubeer het monster een nacht bij twee tot acht graden Celsius in een IHC-natte doos met microscoopglaasje. De volgende dag, nadat u het monster gedurende een uur op kamertemperatuur hebt gebracht, wast u het drie keer gedurende vijf minuten met PBST.Incubeer het monster gedurende een uur in konijn anti-muis mierikswortelperoxidase gelabeld secundaire antilichamen bij kamertemperatuur. Was de monsters na incubatie opnieuw drie keer gedurende vijf minuten elk met PBST en incubeer het monster vervolgens gedurende vijf tot 20 minuten met het DAB-substraat dat overeenkomt met het enzymgelabelde antilichaam. Na het blussen van de reactie met gedeïoniseerd water, het monster gedurende 30 seconden tegenkleuren met Weigert's hematoxyline.Spoel het een minuut onder stromend water, dehydrateer, verwijder en sluit het weefsel af. Voordat u overgaat tot de analyse van de western blot, homogeniseert u het weefsel met de RIPA werkoplossing op ijs gedurende vijf minuten met behulp van een draagbare elektrische molen. Incubeer gedurende een uur op ijs met schudden en centrifugeer het homogenaat bij 14.800 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Verzamel de supernatant en bepaal de eiwitconcentratie met een BCA-eiwittestkit. Voeg 20 microliter 5X laadbuffer toe aan de supernatant en verwarm vervolgens de met RIPA bereide eiwitopslagoplossing van zes microgram per microliter gedurende 20 minuten in een metalen bad bij 100 graden Celsius. Bewaar 100 microliter aliquots van de eiwitoplossing in elke buis bij min 80 graden Celsius.Voor elektroforese verdunt u de aliquots tot twee tot drie microgram per microliter met RIPA lysaat en voegt u vervolgens 20 microgram monster per putje toe om de gel te laten lopen. Breng het eiwit gedurende 20 seconden over naar een PVDF-membraan dat vooraf is geactiveerd met methanol met behulp van de natte overdrachtsmethode met een stroom van 400 milliampère gedurende één tot twee uur. Na het vijf keer wassen van het membraan gedurende vijf minuten met PBST-oplossing, blokkeert u gedurende een uur met 5% BSA of magere melk.Dompel de strips onder in de primaire antilichaamoplossing die NF-kappa B en bèta-actine bevat, verdund met 5% BSA. Schud de strips een nacht zachtjes bij twee tot acht graden Celsius voordat u ze wast met PBST. Incubeer vervolgens de strips, eerst in het verdunde secundaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur met zacht schudden, en vervolgens met verbeterde chemiluminescentieontwikkelaar gedurende drie minuten.Stel de strip gedurende 20 seconden bloot aan een gelimager en meet de grijswaarde van de strip om het eiwitniveau te beoordelen met behulp van systeemsoftware. De SEM-beelden van CSD toonden aan dat de deeltjes onregelmatig gevormd waren. Sirius-roodkleuring uitgevoerd om collageenafzetting te meten, toonde aan dat de progressie van longfibrose bij muizen aanzienlijk werd versneld na blootstelling aan CSD gedurende één maand.Polariserende microscopie onthulde drie verschillende soorten collageenvezels, waarvan type één collageenvezels in rood een risicofactor zijn voor silicose, maar er werd geen significante fibrose gevonden in de voertuiggroep. Dit werd ook aangegeven door de respectievelijke fibrosescores. HE-kleuring van met CSD behandeld longweefsel van muizen toonde typische silicaknobbeltjes die worden gekenmerkt door vloeibare necrose na fagocytose van CSD in het centrum, omringd door macrofagen in de periferie.Masson-kleuring toonde ook aan dat de knobbeltjes verrijkt waren met CSD die gepaard ging met fibrose. De immunohistochemische kleuring van CD-68 onthulde verder de brede aanwezigheid van macrofagen in longweefsel. Gepolariseerde lichtmicroscopie toonde aan dat deze macrofagen CSD hadden ingeslikt, wat ernstig longletsel veroorzaakte.Immunohistochemische kleuring toonde een hogere NF-kappa B-kleuring, wat wijst op een hogere ontstekingsreactie in de met CSD behandelde groep dan in de mediumgroep. Representatieve western blot toonde ook aan dat de met CSD behandelde muizen een hogere NF-kappa B-expressie in de longen hadden, en het verschil in expressie tussen de twee groepen was significant. Om obstructie van de luchtwegen te voorkomen en het herstel van de ademhaling te bevorderen, moet het hartgebied van de muis vijf tot tien keer zachtjes worden gemasseerd, zoals aangetoond na een periode van vijf seconden.Dit model kan een onderliggend mechanisme van silicose onderzoeken en helpen bij het screenen van therapeutische geneesmiddelen, samen met het vaststellen van cruciale parameters zoals dosering en duur. Deze technologie biedt een handige, effectieve en economische manier om muismodellen bloot te stellen aan fijnstof, ongeacht of dit bacteriën toevoegt. Het monitoren van het gedrag van muizen kan helpen bij het bepalen van de mogelijke effecten van het inademen van fijnstof.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Een muis model van de In Utero Transplantatie

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Muismodel van chirurgisch geïnduceerde Endometriose door Auto-transplantatie van baarmoeder weefsel

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Muis Model van Intraluminale mCaO: herseninfarct Evaluatie door cresyl Violet Staining

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Mapping van cerebrovasculaire reactiviteit via Gas Inademing Uitdagingen

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Droge poeder en Nebulized aërosolinhalatie van farmaceutische producten geleverd aan muizen met behulp van een neus-only Belichtingssysteem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Herhaalde Meting van Respiratory spieractiviteit en Ventilatie in muismodellen van neuromusculaire aandoening

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Vinyl chloride en vetarm dieet als een model van de interactie van de omgeving en obesitas

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Beoordeling van de acute inademingstoxiciteit van deeltjes in de lucht door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...