Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal programma di innovazione della sinergia universitaria della provincia di Anhui (GXXT-2021-077) e dal Fondo per l'innovazione dei laureati dell'Università di scienza e tecnologia dell'Anhui (2021CX2120).

Tutte le procedure hanno seguito le linee guida della Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 8023, rivista nel 1978) e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Scuola di Medicina dell'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui.
1. Gestione e alimentazione dei topi
<ol><li>Assegnare 20 topi maschi C57BL/6 sani ai gruppi sperimentali o di veicoli in un r...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

I modelli murini di silicosi sono fondamentali per lo studio della patogenesi e del trattamento della silicosi. Questo protocollo descrive un metodo per preparare un modello di silicosi nei topi attraverso l'esposizione nasale ripetuta. Questa metodica permette di studiare le caratteristiche patologiche della silicosi indotta da diversi tempi di esposizione. I topi sono stati anestetizzati su un ventilatore e la loro frequenza respiratoria è stata monitorata. La frequenza respiratoria iniziale breve e veloce è gradualm...

I lavoratori sono inevitabilmente esposti a polvere di silice cristallina irregolare (CSD), che può essere inalata ed è più tossica in numerosi contesti occupazionali, tra cui l'estrazione mineraria, la ceramica, il vetro, la lavorazione del quarzo e il calcestruzzo 1,2. Una condizione cronica di inalazione di polvere nota come silicosi provoca fibrosi polmonare progressiva3. Secondo i dati epidemiologici, l'incidenza della silicosi è diminuita a livello globale negli ultimi decenni, ma negli ultimi anni è aumentata e colpisce i più giovani 4,5,6. Il meccanismo alla base della silicosi rappresenta una sfida significativa per la ricerca scientifica a causa della sua insidiosa insorgenza e del prolungato periodo di incubazione. Non si sa ancora come si sviluppi la silicosi. Inoltre, nessun farmaco attuale può arrestare la progressione della silicosi e invertire la fibrosi polmonare.
Gli attuali modelli murini per la silicosi prevedono l'ingestione tracheale di una sospensione mista di CSD. Ad esempio, la somministrazione di CSD nei polmoni adottando il trauma della trachea cervicale dopo l'anestesia non è conforme all'esposizione umana ripetuta alla polvere colorante7. L'impatto dell'esposizione alla polvere ambientale sulle persone può essere studiato esponendole a CSD sotto forma di aerosol, che riflette in modo più accurato le concentrazioni ambientali di questa sostanza tossica8. Tuttavia, la CSD ambientale non può essere semplicemente inalata direttamente nei polmoni a causa della struttura fisiologica unica del naso del topo9. Inoltre, l'attrezzatura associata a questa tecnologia è costosa, il che ha indotto i ricercatori a rivalutare il modello10 della silicosi murina. Inalando la sospensione di CSD attraverso una flebo nasale cinque volte in 2 settimane, è stato possibile costruire un modello dinamico di silicosi. Questo modello è coerente e sicuro pur essendo facile da usare. È importante notare che questo studio consente l'inalazione ripetuta di CSD nei topi. Il modello di silicosi murina creato attraverso questa procedura dovrebbe essere più vantaggioso per i requisiti di ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

La silicosi può essere causata dall'esposizione alla polvere di silice cristallina (CSD) respiratoria in un ambiente industriale. La fisiopatologia, lo screening e il trattamento della silicosi nell'uomo sono stati ampiamente studiati utilizzando il modello murino di silicosi. Facendo inalare ripetutamente CSD nei polmoni, i topi possono imitare i sintomi clinici della silicosi umana. Questa metodologia è pratica ed efficiente in termini di tempo e resa e non provoca lesioni meccaniche alle prime vie respiratorie dovute all'intervento chirurgico. Inoltre, questo modello può imitare con successo il processo di trasformazione acuta/cronica della silicosi. Le principali procedure sono state le seguenti. La polvere CSD sterilizzata da 1-5 μm è stata completamente macinata, sospesa in soluzione fisiologica e dispersa in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 30 minuti. I topi sottoposti ad anestesia indotta da isoflurano sono passati da una respirazione rapida superficiale ad un'aspirazione profonda e lenta per circa 2 secondi. Il topo è stato posizionato nel palmo di una mano e la punta del pollice ha toccato delicatamente il bordo del labbro della mascella del topo per raddrizzare le vie aeree. Dopo ogni espirazione, i topi hanno respirato la sospensione di silice goccia a goccia attraverso una narice, completando il processo entro 4-8 secondi. Dopo che la respirazione dei topi si è stabilizzata, il loro petto è stato accarezzato e accarezzato per evitare che il CSD inalato venisse espulso con la tosse. I topi sono stati poi riportati nella gabbia. In conclusione, questo modello è in grado di quantificare la CSD lungo il tipico passaggio fisiologico di minuscole particelle nel polmone, dal tratto respiratorio superiore ai bronchioli terminali e agli alveoli. Può anche replicare l'esposizione ricorrente dei dipendenti a causa del lavoro. Il modello può essere eseguito da una sola persona e non necessita di attrezzature costose. Simula in modo conveniente ed efficace le caratteristiche patologiche della silicosi umana con un'elevata ripetibilità.

La potenziale patogenesi della silicosi nei topi è stata studiata utilizzando il metodo proposto. Abbiamo scoperto che il peso corporeo dei topi nel gruppo sperimentale è diminuito significativamente rispetto al gruppo di controllo e che il peso corporeo si è ripreso lentamente dopo la cessazione dell'esposizione. A causa della dose ottimizzata utilizzata qui, non è stata osservata mortalità nei topi esposti alla silice in questo esperimento. La tabella di marcia tecnica del gocciolamento nasale ripetuto al CSD è m...

Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello murino di silicosi attraverso l'esposizione ripetuta a sospensioni di silice tramite una flebo nasale. Questo modello può imitare in modo efficiente, conveniente e flessibile il processo patologico della silicosi umana con elevata ripetibilità ed economia.

Un modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione ripetuta di polvere di silice cristallina

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

Nel modello di silicosi murina descritto generato dall'infusione intralaser di polvere di silice cristallina, tutte le sospensioni CSD hanno simulato più volte l'insorgenza e lo sviluppo della silicosi umana in larga misura. Questo metodo consente di risparmiare tempo e di livello, oltre che pratico ed efficace. Inoltre, non provoca lesioni meccaniche al tratto respiratorio superiore a causa dell'operazione.Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per preparare modelli di malattia di virus, batteri, eccetera. A dimostrare la procedura sarà Hangbing Cao, uno studente del mio laboratorio, esperto nella preparazione del modello murino di silicosi. Iniziare con la preparazione della polvere di silice cristallina o CSD almeno un giorno prima di somministrare le flebo nasali.Per fare ciò, macinare la silice in un mortaio di agata per mezz'ora. Per controllare la dimensione e la forma delle particelle, preparare il campione per la microscopia elettronica a scansione o SEM utilizzando un nastro conduttivo per legare le particelle di silicio. Usando un asciugacapelli, soffia via delicatamente le particelle non saldamente legate prima di procedere all'acquisizione dell'immagine.Successivamente, miscelare la silice macinata e la soluzione salina sterile a una concentrazione di 20 milligrammi per millilitro utilizzando un agitatore a ultrasuoni. Infine, agitare la sospensione CSD preparata per 10 secondi. Somministrare 50 microlitri di CSD al topo anestetizzato tramite una flebo nasale per quattro-otto secondi.Trattare il mouse di controllo con una quantità uguale di soluzione fisiologica, quindi tenere il corpo del mouse con il palmo, pizzicare la pelle sulla parte posteriore del collo con il pollice e l'indice mentre si fissano gli arti posteriori del mouse con le altre dita. Premere delicatamente l'area del battito cardiaco del mouse con l'altro dito indice da cinque a 10 volte per cinque secondi. Riscaldare il tessuto polmonare incorporato in paraffina su una piastra calda a 60 gradi Celsius per oltre quattro ore.Per decerare e idratare la sezione di paraffina, immergere il vetrino in xilene per 30 minuti due volte, quindi immergere in sequenza il vetrino per cinque minuti ciascuno in etanolo anidro al 95% 85% e al 75% e, infine, in acqua deionizzata, quindi posizionare il vetrino nel secchio per colorare l'ematossilina per 10 minuti prima di risciacquare delicatamente sotto l'acqua corrente per cinque minuti. Immergilo nel secchio per colorare l'eosina per 10 secondi. Dopo aver disidratato il campione in etanolo anidro al 75% 85% e anidro per cinque minuti ciascuno, pulire la sezione di tessuto immergendola in xilene per cinque minuti e sigillarla con circa 60 microlitri di gocce di resina neutra.Posizionare con cautela il vetrino del coperchio sulla sezione. Per la colorazione di Masson, colorare i campioni di paraffina decerati e idratati con ematossilina di Weigert al 50% appena preparata per 10 minuti, quindi dopo aver immerso il tessuto in liquefazione acida di etanolo per 10 secondi, risciacquare delicatamente il vetrino con acqua corrente per l'azzurramento dei nuclei. Successivamente, colorare il campione con gocce di soluzione colorante rossa per sette minuti e lavare con una soluzione di lavoro di acido cloridrico al 30% per un minuto.Dopo aver immerso il vetrino in alcol al 95% per 20 secondi, disidratare il campione con etanolo anidro per uno o tre secondi due volte e, come dimostrato in precedenza, pulire e sigillare il campione. Per la colorazione rosso Sirius, infiltrare la sezione decerata e idratata per un'ora con la soluzione colorante rosso Sirius, quindi colorare i nuclei cellulari per 8-10 minuti con la soluzione colorante Mayer hematoxlyn. Sciacqualo delicatamente sotto l'acqua corrente per 10 minuti prima di disidratarlo, pulirlo e sigillarlo.Infiltrare il campione di paraffina decerata e idratata con 30 millilitri di una soluzione di recupero dell'antigene EDTA da tre milligrammi per millilitro. Far bollire il campione per 20-30 minuti prima di lavarlo con acqua deionizzata e incubarlo in PBST per cinque minuti. Immergere il campione per 15 minuti con una soluzione di perossido di idrogeno allo 0,3% appena preparata e lavarlo tre volte per cinque minuti ciascuna con PBST.Permeabilizzare la membrana del campione per 15 minuti con una soluzione di Triton 100 allo 0,3% e bloccare con 30-40 microlitri di albumina sierica bovina al 5% o BSA per un'ora. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi primari NF-kappa B e CD-68 opportunamente diluiti e incubare il campione per una notte a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius in un vetrino da microscopio IHC wet box. Il giorno successivo, dopo aver trasferito il campione a temperatura ambiente per un'ora, lavarlo tre volte per cinque minuti ciascuna con PBST.Incubare il campione per un'ora in anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano anti-topo di coniglio a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno con PBST, quindi incubare il campione con il substrato DAB corrispondente all'anticorpo marcato con enzima per 5-20 minuti. Dopo aver spento la reazione con acqua deionizzata, colorare il campione per 30 secondi con l'ematossilina di Weigert.Sciacqualo sotto l'acqua corrente per un minuto, disidratalo, puliscilo e sigilla il tessuto. Prima di procedere all'analisi western blot, omogeneizzare il tessuto con la soluzione di lavoro RIPA su ghiaccio per cinque minuti utilizzando una smerigliatrice elettrica portatile. Incubare per un'ora su ghiaccio agitando e centrifugare l'omogenato a 14.800 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Raccogliere il surnatante e determinare la concentrazione proteica con un kit per il dosaggio delle proteine BCA. Aggiungere 20 microlitri di tampone di caricamento 5X al surnatante, quindi riscaldare la soluzione di conservazione delle proteine da sei microgrammi per microlitro preparata con RIPA in un bagno di metallo a 100 gradi Celsius per 20 minuti. Conservare 100 aliquote di microlitri della soluzione proteica in ciascuna provetta a meno 80 gradi Celsius.Per l'elettroforesi, diluire le aliquote a due o tre microgrammi per microlitro con lisato RIPA, quindi aggiungere 20 microgrammi di campione per pozzetto per far scorrere il gel. Trasferire la proteina su una membrana in PVDF pre-attivata con metanolo per 20 secondi utilizzando il metodo di trasferimento a umido con corrente di 400 milliampere per una o due ore. Dopo aver lavato la membrana cinque volte per cinque minuti ciascuna con soluzione PBST, bloccare con 5% BSA o latte scremato per un'ora.Immergere le strisce nella soluzione di anticorpi primari contenente NF-kappa B e beta actina diluita con il 5% di BSA. Agitare delicatamente le strisce durante la notte a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius prima di lavarle con PBST. Successivamente, incubare le strisce, prima nell'anticorpo secondario diluito per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente, e poi con uno sviluppatore a chemiluminescenza potenziato per tre minuti.Esporre la striscia a un gel imager per 20 secondi e misurare il valore di grigio della striscia per valutare il livello proteico tramite il software di sistema. Le immagini SEM di CSD hanno mostrato che le particelle erano di forma irregolare. La colorazione rossa di Sirius eseguita per misurare la deposizione di collagene ha mostrato che la progressione della fibrosi polmonare nei topi è stata significativamente accelerata dopo l'esposizione a CSD per un mese.La microscopia polarizzante ha rivelato tre diversi tipi di fibre di collagene, di cui le fibre di collagene di tipo uno mostrate in rosso sono un fattore di rischio per la silicosi, tuttavia, non è stata riscontrata alcuna fibrosi significativa nel gruppo del veicolo. Ciò è stato indicato anche dai rispettivi punteggi di fibrosi. La colorazione HE del tessuto polmonare di topo trattato con CSD ha mostrato tipici noduli di silice caratterizzati da necrosi liquefatta dopo fagocitosi di CSD al centro circondata da macrofagi in periferia.La colorazione di Masson ha anche mostrato che i noduli erano arricchiti con CSD accompagnata da fibrosi. La colorazione immunoistochimica di CD-68 ha inoltre rivelato l'ampia presenza di macrofagi nel tessuto polmonare. La microscopia a luce polarizzata ha mostrato che questi macrofagi avevano ingerito CSD, causando gravi lesioni polmonari.La colorazione immunoistochimica ha mostrato una maggiore colorazione di NF-kappa B, indicando una maggiore risposta infiammatoria nel gruppo trattato con CSD rispetto al gruppo veicolo. Il western blot rappresentativo ha anche mostrato che i topi trattati con CSD avevano una maggiore espressione di NF-kappa B nel polmone e la differenza di espressione tra i due gruppi era significativa. Per evitare l'ostruzione respiratoria e favorire il recupero respiratorio, l'area cardiaca del topo deve essere massaggiata delicatamente da cinque a 10 volte, come dimostrato dopo un periodo di cinque secondi.Questo modello può esplorare alcuni meccanismi alla base della silicosi e aiutare lo screening terapeutico dei farmaci, oltre a stabilire parametri cruciali come il dosaggio e la durata. Questa tecnologia offre un mezzo conveniente, efficace ed economico per esporre i modelli murini al particolato, indipendentemente dal fatto che si aggiungano batteri. Il monitoraggio del comportamento dei topi può aiutare a determinare i potenziali effetti dell'inalazione di particolato.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Ricerca

Medicina

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Modello murino di endometriosi chirurgicamente indotto da Auto-trapianto di tessuto uterino

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Modello murino di MCAO intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Mappatura di cerebrovascolare Reattività via gas per inalazione sfide

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Polvere secca e nebulizzata Aerosol L&#39;inalazione di prodotti farmaceutici distribuito nelle topo, utilizzando un naso-only Sistema di esposizione

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Misurazione ripetuta di attività muscolare respiratoria e ventilazione in modelli murini di malattie neuromuscolari

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Cloruro di vinile e dieta ad alto contenuto di grassi come modello di interazione tra ambiente e obesità

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...