Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
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本研究は、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム(GXXT-2021-077)および安徽科技大学大学院イノベーション基金(2021CX2120)の支援を受けて行われました。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH Publication No. 8023、1978年改訂)のガイドラインに従い、安徽科技大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. マウスの管理と給餌
<ol><li>20匹の健康なC57BL/6雄マウスを実験群またはビヒクル群に1:1の比率で割り当てます。マウスを新しい環境に1週間順応さ...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

珪肺症マウスモデルは、珪肺症の病因と治療を研究するために重要です。このプロトコルは繰り返された鼻の露出によってマウスの珪肺症のモデルを準備するための方法を記述する。この方法は、異なる曝露時間によって誘発される珪肺症の病理学的特徴の研究を可能にする。マウスに人工呼吸器を装着し、呼吸数をモニターした。最初の短くて速い呼吸数は、時間の経過とともに徐々に遅?...

労働者は必然的に不規則な結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされ、吸入する可能性があり、鉱業、陶器、ガラス、石英加工、コンクリート1,2など、多くの職業状況でより有毒です。珪肺症として知られる慢性的な粉塵吸入状態は、進行性の肺線維症を引き起こします3。疫学データによると、珪肺症の発生率は過去数十年にわたって世界的に減少していますが、近年、増加しており、若年層に影響を与えています4,5,6。珪肺症の根本的なメカニズムは、その潜行性の発症と長期の潜伏期間のために、科学研究にとって重要な課題を提示します。珪肺症がどのように発症するかはまだ不明です。さらに、現在の薬では、珪肺症の進行を止めたり、肺線維症を逆転させたりすることはできません。
現在の珪肺症のマウスモデルでは、CSDの混合懸濁液を気管から摂取します。例えば、麻酔後に頸部気管外傷を採用してCSDを肺に投与することは、染料粉塵へのヒトの反復暴露には従わない7。周囲の粉塵への曝露が個人に与える影響は、この有毒物質の環境濃度をより正確に反映するエアロゾルの形でCSDに曝露することによって研究できます8。しかし、環境CSDは、マウスの鼻の特異な生理学的構造のために、単純に直接肺に吸入することはできない9。さらに、この技術に関連する機器は高価であるため、研究者はマウスの珪肺症モデル10を再評価しています。2週間以内に5回点鼻薬でCSD懸濁液を吸入することで、珪肺症の動的モデルを構築することができました。このモデルは、使いやすく、一貫性があり、安全です。この研究により、マウスでCSDの反復吸入が可能であることに注意することが重要です。この手順で作成されたマウス珪肺症モデルは、研究要件に対してより有益であることが期待されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

珪肺症は、産業環境で呼吸器系結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされることによって引き起こされる可能性があります。ヒトにおける珪肺症の病態生理学、スクリーニング、および治療はすべて、マウス珪肺症モデルを使用して広く研究されています。マウスにCSDを肺に繰り返し吸入させることで、マウスはヒトの珪肺症の臨床症状を模倣することができます。この方法論は、時間と出力の点で実用的かつ効率的であり、手術による上気道への機械的損傷を引き起こしません。さらに、このモデルは、珪肺症の急性/慢性形質転換プロセスをうまく模倣できます。主な手続きは、以下の通りです。滅菌した1〜5μmのCSD粉末を完全に粉砕し、生理食塩水に懸濁し、超音波水浴中に30分間分散させた。イソフルラン誘発麻酔下のマウスは、約2秒間、浅い速呼吸から深くゆっくりとした吸引に切り替わりました。マウスを手のひらに置き、親指の先をマウスの顎の唇の端にそっと触れて気道をまっすぐにしました。各呼気の後、マウスは1つの鼻孔からシリカ懸濁液を一滴ずつ吸い込み、4〜8秒以内にプロセスを完了しました。マウスの呼吸が安定した後、吸入したCSDが咳をしないように、胸を撫でたり愛撫したりしました。その後、マウスをケージに戻した。結論として、このモデルは、上気道から末端細気管支および肺胞まで、肺への微小粒子の典型的な生理学的通過に沿ってCSDを定量化することができます。また、仕事による従業員の繰り返しの曝露を再現することもできます。モデルは1人で行うことができ、高価な機器は必要ありません。ヒト珪肺症の疾患の特徴を高い再現性で便利かつ効果的にシミュレートします。

マウスにおける珪肺症の潜在的な病因は、提案された方法を使用して調査されました。その結果、実験群のマウスの体重は対照群に比べて有意に減少し、曝露中止後の体重の回復が遅いことが分かりました。ここで使用した用量が最適化されているため、この実験ではシリカに曝露したマウスでは死亡率は観察されませんでした。CSDへの反復点鼻漏の技術的ロードマップを(図...

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A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

このプロトコルは鼻の点滴によって無水ケイ酸懸濁液への反復的な露出によって珪肺症のマウス モデルを確立する方法を記述する。このモデルは、ヒト珪肺症の病理学的プロセスを効率的、便利、かつ柔軟に模倣し、高い再現性と経済性を備えています。

結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

記載されたマウス珪肺症モデルでは、結晶シリカダストのレーザー内注入によって生成された、すべてのCSD懸濁液がヒト珪肺症の発生と発症を数回シミュレートしました。この方法は、時間の節約とレベルの節約であるだけでなく、実用的で効果的です。また、手術による上気道への機械的損傷を生じさせない。この方法は、ウイルスや細菌などの疾患モデルの作成にも使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生で、珪肺症マウスモデルの準備に熟練しているHangbing Caoです。点鼻薬を投与する少なくとも1日前に、結晶性シリカダストまたはCSDを準備することから始めます。これを行うには、瑪瑙乳鉢でシリカを30分間挽きます。粒子の大きさや形状を確認するには、走査型電子顕微鏡やSEM用に導電性テープでシリコン粒子を結合させ、試料を作製します。ヘアドライヤーを使用して、しっかりと結合していない粒子をそっと吹き飛ばしてから、画像のキャプチャに進みます。次に、超音波シェーカーを使用して、粉砕シリカと滅菌生理食塩水を1ミリリットルあたり20ミリグラムの濃度で混合します。最後に、準備したCSD懸濁液を10秒間ボルテックスします。麻酔をかけたマウスに50マイクロリットルのCSDを点鼻薬で4〜8秒間投与します。対照マウスを等量の生理食塩水で処理し、マウスの体を手のひらで持ち、親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつまみ、他の指でマウスの後肢を固定します。もう片方の人差し指でマウスの心臓の鼓動部分を5〜10回、5秒間静かに押します。パラフィン包埋肺組織をホットプレート上で摂氏60度で4時間以上加熱します。パラフィン切片を脱ワックスして水和させるには、スライドをキシレンに30分間2回浸し、次にスライドを無水95%85%および75%エタノールにそれぞれ5分間順次浸し、最後に脱イオン水に浸し、スライドをヘマトキシリン染色バケツに10分間入れてから、流水で5分間穏やかにすすぎます。エオシン染色バケツに10秒間浸します。サンプルを75%85%95%と無水エタノールでそれぞれ5分間脱水した後、キシレンに5分間浸漬して組織切片を除去し、約60マイクロリットルの中性樹脂滴で密封します。カバースライドをセクションの上に慎重に置きます。Masson染色では、脱ワックスおよび水和パラフィンサンプルを新たに調製した50%Weigertヘマトキシリンで10分間染色し、次に組織を酸性エタノール液化に10秒間浸した後、流水でスライドを穏やかにすすぎ、核の青化を行います。次に、試料を赤色染色液の滴で7分間染色し、30%塩酸作動液で1分間洗浄します。スライドを95%アルコールに20秒間浸した後、無水エタノールでサンプルを1〜3秒間2回脱水し、前に示したように、サンプルを透明化して密封します。シリウスレッド染色では、シリウスレッド染色液で脱ワックスおよび水和切片に1時間浸潤し、次にメイヤーヘマトキリン染色液で細胞核を8〜10分間染色します。流水で10分間静かにすすぎ、脱水し、取り除き、スライドを密封します。脱ワックスおよび水和パラフィンサンプルに、30ミリリットル/ミリリットルの3ミリグラムのEDTA抗原賦活化溶液を浸潤します。サンプルを20〜30分間煮沸してから、脱イオン水で洗浄し、PBSTで5分間インキュベートします。調製したばかりの0.3%過酸化水素水溶液にサンプルを15分間浸し、PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。0.3%Triton 100溶液で検体の膜を15分間透過処理し、30〜40マイクロリットルの5%ウシ血清アルブミンまたはBSAで1時間ブロックします。ブロッキング溶液を除去した後、適切に希釈した一次抗体NF-κBおよびCD-68を添加し、顕微鏡スライドIHCウェットボックス内で2〜8°Cで検体を一晩インキュベートします。翌日、試料を室温に1時間移した後、PBSTで5分間ずつ3回洗浄する。サンプルをウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体中で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSTでそれぞれ5分間、3回再度洗浄し、次に、酵素標識抗体に対応するDAB基質とサンプルを5〜20分間インキュベートします。脱イオン水で反応を急冷した後、ワイゲルトヘマトキシリンでサンプルを30秒間対比染色します。流水で1分間すすぎ、脱水し、透明にし、組織を密封します。ウェスタンブロット分析に進む前に、ハンドヘルド電動グラインダーを使用して、氷上で5分間、RIPA作業溶液で組織をホモジナイズします。振とうしながら氷上で1時間インキュベートし、ホモジネートを14, 800Gで摂氏4度で15分間遠心分離する。上清を採取し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。上清に20マイクロリットルの5倍ローディングバッファーを加え、RIPAで調製した6マイクログラム/マイクロリットルのタンパク質保存溶液を100°Cの金属浴中で20分間加熱します。タンパク質溶液100マイクロリットルのアリコートを各チューブに摂氏マイナス80度で保管します。電気泳動の場合は、アリコートをRIPAライセートで1マイクロリットルあたり2〜3マイクログラムに希釈し、ウェルあたり20マイクログラムのサンプルを添加してゲルを泳動させます。400ミリアンペアの電流で1〜2時間、湿式転写法を使用して、メタノールで20秒間事前に活性化されたPVDFメンブレンにタンパク質を移します。メンブレンをPBST溶液でそれぞれ5分間5回洗浄した後、5%BSAまたはスキムミルクで1時間ブロックします。5%BSAで希釈したNF-κBとβアクチンを含む一次抗体溶液にストリップを浸します。ストリップを摂氏2〜8度で一晩静かに振ってから、PBSTで洗浄します。次に、ストリップを、希釈した二次抗体中で室温で1時間穏やかに振とうし、次に増強化学発光現像液で3分間インキュベートします。ストリップをゲルイメージャーに20秒間曝露し、ストリップのグレー値を測定して、システムソフトウェアでタンパク質レベルを評価します。CSDのSEM画像は、粒子が不規則な形状であることを示しました。コラーゲン沈着を測定するために実施したシリウスレッド染色は、マウスの肺線維症の進行が1ヶ月間のCSD曝露で有意に加速されることを示しました。偏光顕微鏡検査により、3種類のコラーゲン線維が明らかになり、そのうち赤色で示した1型コラーゲン線維は珪肺症の危険因子であるが、ビヒクル群では有意な線維化は認められなかった。これは、それぞれの線維症スコアによっても示されました。CSD処理したマウス肺組織のHE染色では、中心部のCSDが貪食された後、液化壊死を特徴とする典型的なシリカ結節が示され、周囲はマクロファージに囲まれていました。Masson染色は、結節が線維化を伴うCSDで強化されていることも示しました。CD-68の免疫組織化学染色により、肺組織にマクロファージが広く存在することがさらに明らかになりました。偏光顕微鏡検査では、これらのマクロファージがCSDを摂取し、重度の肺損傷を引き起こしていることが示されました。免疫組織染色では、より高いNF-κB染色が示され、CSD治療群ではビヒクル群よりも炎症反応が高いことが示されました。代表的なウェスタンブロットでは、CSD処理マウスは肺でのNF-κBの発現が高く、2つのグループ間の発現の差が有意であることも示されました。呼吸閉塞を回避し、呼吸の回復を促進するために、マウスの心臓領域は、5秒間後に示されているように、5〜10回穏やかにマッサージする必要があります。このモデルは、珪肺症の根本的なメカニズムを探り、治療薬のスクリーニングを支援するとともに、投与量や期間などの重要なパラメータを確立することができます。この技術は、マウスモデルを粒子状物質に曝露するための便利で効果的で経済的な手段を提供します。マウスの行動を監視することは、粒子状物質を吸い込んだ場合の潜在的な影響を判断するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

子宮組織の自動移植による外科的に誘発される子宮内膜症のマウスモデル

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

ガス吸入課題を経由して脳血管反応性のMRIのマッピング

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

乾燥粉末および医薬品の霧状エアロゾルを吸入すると、鼻のみの露光装置を用いてマウスに配信します

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

神経筋疾患のマウスモデルにおいて呼吸筋活動および換気の繰り返し測定

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

環境と肥満相互作用のモデルとしての塩化ビニルと高脂肪食

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...