Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

Denne studien ble støttet av University Synergy Innovation Program of Anhui Province (GXXT-2021-077) og Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).

Alle prosedyrer fulgte retningslinjene i National Institutes of Health's Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH publikasjon nr. 8023, revidert 1978) og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical School of Anhui University of Science and Technology.
1. Administrere og mate mus
<ol><li>Tilordne 20 friske C57BL/6 hannmus til eksperiment- eller kjøretøygruppene i forholdet 1:1. Akklimatiser musene til det nye miljøet i 1 uke.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

Silikose musemodeller er avgjørende for å studere patogenesen og behandling av silikose. Denne protokollen beskriver en metode for å fremstille en modell av silikose hos mus gjennom gjentatt nasal eksponering. Denne metoden tillater studier av de patologiske egenskapene til silikose indusert av forskjellige eksponeringstider. Mus ble bedøvet på respirator, og respirasjonsfrekvensen ble overvåket. Den første korte, raske pustefrekvensen ble gradvis redusert og dypere over tid. Anestesien førte til at musens muskle...

Arbeidere er uunngåelig utsatt for uregelmessig krystallinsk silikastøv (CSD), som kan inhaleres og er mer giftig i mange yrkesmessige sammenhenger, inkludert gruvedrift, keramikk, glass, kvartsbehandling og betong 1,2. En kronisk støvinnåndingstilstand kjent som silikose forårsaker progressiv lungefibrose3. Ifølge epidemiologiske data har forekomsten av silikose gått ned globalt de siste tiårene, men de siste årene har den økt og påvirket yngre mennesker 4,5,6. Den underliggende mekanismen for silikose gir en betydelig utfordring for vitenskapelig forskning på grunn av sin lumske begynnelse og langvarige inkubasjonsperiode. Det er fortsatt ukjent hvordan silikose utvikler seg. Videre kan ingen nåværende medisiner stoppe utviklingen av silikose og reversere lungefibrose.
De nåværende musemodellene for silikose involverer trakeal inntak av en blandet suspensjon av CSD. For eksempel, administrering av CSD i lungene ved å vedta cervical trachea trachea traumer etter anestesi ikke i samsvar med gjentatt menneskelig eksponering for fargestoffstøv 7. Virkningen av eksponering for omgivende støv på individer kan studeres ved å utsette dem for CSD i form av aerosoler, som mer nøyaktig reflekterer miljøkonsentrasjonene av dette giftige stoffet8. Imidlertid kan miljømessig CSD ikke bare inhaleres direkte inn i lungene på grunn av den unike fysiologiske strukturen til musenesen9. Dessuten er utstyret knyttet til denne teknologien dyrt, noe som har fått forskere til å revurdere musesilikosemodellen10. Ved å inhalere CSD-suspensjon gjennom et nesedrypp fem ganger innen 2 uker, var det mulig å bygge en dynamisk modell av silikose. Denne modellen er konsistent og trygg samtidig som den er enkel å bruke. Det er viktig å merke seg at denne studien tillater gjentatt innånding av CSD hos mus. Mus silikosemodellen opprettet gjennom denne prosedyren forventes å være mer gunstig for forskningskrav.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

Silikose kan skyldes eksponering for respiratorisk krystallinsk silikastøv (CSD) i et industrielt miljø. Patofysiologien, screening og behandling av silikose hos mennesker har alle blitt grundig studert ved hjelp av musesilikosemodellen. Ved gjentatte ganger å få mus til å inhalere CSD i lungene, kan musene etterligne de kliniske symptomene på human silikose. Denne metoden er praktisk og effektiv når det gjelder tid og produksjon og forårsaker ikke mekanisk skade på øvre luftveier på grunn av kirurgi. Videre kan denne modellen med hell etterligne akutt / kronisk transformasjonsprosess av silikose. Hovedprosedyrene var som følger. Det steriliserte 1-5 μm CSD-pulveret ble fullstendig malt, suspendert i saltvann og dispergert i et ultralydsvannbad i 30 minutter. Mus under isoflurindusert anestesi skiftet fra grunn, rask pust til dyp, langsom aspirasjon i ca. 2 s. Musen ble plassert i håndflaten, og tommelspissen berørte forsiktig leppekanten av musens kjeve for å rette luftveiene. Etter hver utånding pustet musene inn silikasuspensjonen dråpe for dråpe gjennom ett nesebor, og fullførte prosessen innen 4-8 s. Etter at musens pust hadde stabilisert seg, ble brystet strøket og kjærtegnet for å forhindre at den inhalerte CSD ble hostet opp. Musene ble deretter returnert til buret. Avslutningsvis kan denne modellen kvantifisere CSD langs den typiske fysiologiske passasjen av små partikler i lungen, fra øvre luftveier til terminale bronkioler og alveoler. Det kan også gjenskape den tilbakevendende eksponeringen av ansatte på grunn av arbeid. Modellen kan utføres av en person og trenger ikke dyrt utstyr. Det simulerer praktisk og effektivt sykdomsegenskapene til human silikose med høy repeterbarhet.

Den potensielle patogenesen av silikose hos mus ble undersøkt ved hjelp av den foreslåtte metoden. Vi fant at kroppsvekten til musene i eksperimentgruppen ble redusert signifikant i forhold til kontrollgruppen, og at kroppsvekten gjenvunnet sakte etter opphør av eksponering. På grunn av den optimaliserte dosen som ble brukt her, ble det ikke observert mortalitet hos kiseleksponerte mus i dette eksperimentet. Det tekniske veikartet for gjentatt nesedrypp til CSD er vist i (figur 1). De ti...

Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Denne protokollen beskriver en metode for å etablere en musemodell av silikose gjennom gjentatt eksponering for silikasuspensjoner via et nesedrypp. Denne modellen kan effektivt, praktisk og fleksibelt etterligne den patologiske prosessen med human silikose med høy repeterbarhet og økonomi.

En silisosemusemodell etablert ved gjentatt innånding av krystallinsk silikastøv

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

I den beskrevne mussilikosemodellen generert ved intralaserinfusjon av krystallsilikastøv, simulerte all CSD-suspensjon flere ganger forekomsten og utviklingen av human silikose i stor grad. Denne metoden er tidsbesparende og nivåbesparende, så vel som praktisk og effektiv. Videre forårsaker ingen mekanisk skade på øvre luftveier på grunn av drift.Denne metoden kan også brukes til å forberede sykdomsmodeller av virus, bakterier, et cetera. Demonstrere prosedyren vil være Hangbing Cao, en master grade student fra laboratoriet mitt, dyktig i å forberede silikose musemodellen. Begynn med å forberede krystallinsk silikastøv eller CSD minst en dag før administrering av nesedryppene.For å gjøre det, slip silika i en agatmørtel i en halv time. For å kontrollere partikkelstørrelsen og formen, klargjør prøven for skanning elektronmikroskopi eller SEM ved hjelp av ledende tape for å binde silisiumpartiklene. Bruk en hårføner til å blåse forsiktig bort partiklene som ikke er godt bundet før du fortsetter å ta bildet.Bland deretter bakken silika og steril saltvann i en konsentrasjon på 20 milligram per milliliter ved hjelp av en ultralyd shaker. Til slutt, virvel den forberedte CSD-suspensjonen i 10 sekunder. Administrer 50 mikroliter CSD til den bedøvede musen via et nesedrypp i fire til åtte sekunder.Behandle kontrollmusen med like mye saltvann, og hold deretter musens kropp med håndflaten, klem huden på baksiden av nakken med tommelen og pekefingeren mens du fester musens bakre lemmer med de andre fingrene. Trykk forsiktig på musens hjertebankende område med den andre pekefingeren fem til 10 ganger i fem sekunder. Varm det parafininnebygde lungevevet på en kokeplate ved 60 grader Celsius i over fire timer.For å avvokse og hydrere parafinseksjonen, suge lysbildet i xylen i 30 minutter to ganger, dypp deretter lysbildet i fem minutter hver i vannfri 95% 85% og 75% etanol, og til slutt, i avionisert vann, legg deretter lysbildet i hematoksylinfargebøtte i 10 minutter før du skyller forsiktig under rennende vann i fem minutter. Dypp den i eosinfargebøtta i 10 sekunder. Etter å ha dehydrert prøven i 75% 85% 95% og vannfri etanol i fem minutter hver, fjern vevsseksjonen ved å senke den i xylen i fem minutter og forsegle den med ca. 60 mikroliter nøytrale harpiksdråper.Plasser dekselet forsiktig over seksjonen. For Masson-farging, flekk de avvoksede og hydrerte parafinprøvene med nytilberedte 50% Weigerts hematoksylin i 10 minutter, og etter å ha bløtlagt vevet i sur etanolflytning i 10 sekunder, skyll lysbildet forsiktig med rennende vann for kjerneblåsing. Deretter flekker prøven med dråper rødfargeløsning i syv minutter, og vask med 30% saltsyrearbeidsløsning i ett minutt.Etter å ha dyppet lysbildet i 95% alkohol i 20 sekunder, dehydrer prøven med vannfri etanol i ett til tre sekunder to ganger, og som vist før, fjern og forsegl prøven. For Sirius rødfarging, infiltrer den avvoksede og hydrerte delen i en time med Sirius rødfargeløsning, og flekk deretter cellekjernene i åtte til 10 minutter med Mayer hematokslynfargeløsning. Skyll den forsiktig under rennende vann i 10 minutter før du dehydrerer, rydder og forsegler lysbildet.Infiltrer den avvoksede og hydrerte parafinprøven med 30 milliliter av en tre milligram per milliliter EDTA-antigengjenfinningsløsning. Kok prøven i 20 til 30 minutter før du vasker den med avionisert vann og inkuberer den i PBST i fem minutter. Bløtlegg prøven i 15 minutter med nylaget 0,3% hydrogenperoksidoppløsning, og vask den tre ganger i fem minutter hver med PBST.Permeabiliser membranen av prøven i 15 minutter med 0,3% Triton 100 løsning, og blokk med 30 til 40 mikroliter 5% bovint serumalbumin eller BSA i en time. Etter å ha fjernet blokkeringsløsningen, tilsett passende fortynnede primære antistoffer NF-kappa B og CD-68, og inkuber prøven over natten ved to til åtte grader Celsius i et mikroskopglass IHC våtboks. Neste dag, etter overføring av prøven til romtemperatur i en time, vask den tre ganger i fem minutter hver med PBST.Inkubere prøven i en time i kanin anti-mus pepperrotperoksidase merket sekundære antistoffer ved romtemperatur. Etter inkubering, vask prøvene igjen tre ganger i fem minutter hver med PBST, og inkuber deretter prøven med DAB-substratet som tilsvarer enzymmerket antistoff i fem til 20 minutter. Etter å ha slukket reaksjonen med avionisert vann, motflekk prøven i 30 sekunder med Weigerts hematoksylin.Skyll det under rennende vann i ett minutt, dehydrer, fjern og forsegl vevet. Før du går videre til western blot-analyse, homogeniser vevet med RIPA arbeidsløsning på is i fem minutter ved hjelp av en håndholdt elektrisk kvern. Inkubere i en time på is med risting, og sentrifuge homogenatet ved 14.800 g i 15 minutter ved fire grader Celsius.Samle supernatanten, og bestem proteinkonsentrasjonen med et BCA-proteinanalysesett. Tilsett 20 mikroliter 5X lastebuffer til supernatanten, og varm deretter opp de seks mikrogram per mikroliter proteinlagringsløsning fremstilt med RIPA i et metallbad ved 100 grader Celsius i 20 minutter. Oppbevar 100 mikroliter aliquots av proteinoppløsningen i hvert rør ved minus 80 grader Celsius.For elektroforese, fortynn alikotene til to til tre mikrogram per mikroliter med RIPA-lysat, og tilsett deretter 20 mikrogram prøve per brønn for å kjøre gelen. Overfør proteinet til en PVDF-membran forhåndsaktivert med metanol i 20 sekunder ved bruk av våtoverføringsmetoden med 400 milliampere strøm i en til to timer. Etter å ha vasket membranen fem ganger i fem minutter hver med PBST-løsning, blokker med 5% BSA eller skummet melk i en time.Senk strimlene i den primære antistoffoppløsningen som inneholder NF-kappa B og betaaktin fortynnet med 5 % BSA. Rist strimlene forsiktig over natten ved to til åtte grader Celsius før du vasker dem med PBST. Deretter inkuberer du strimlene, først i det fortynnede sekundære antistoffet i en time ved romtemperatur med forsiktig risting, og deretter med forbedret kjemiluminescensutvikler i tre minutter.Utsett stripen for en gelavbildning i 20 sekunder og mål den grå verdien til stripen for å vurdere proteinnivået ved hjelp av systemprogramvare. SEM-bildene av CSD viste at partiklene var uregelmessig formet. Sirius rødfarging utført for å måle kollagenavsetning viste at progresjonen av lungefibrose hos mus ble signifikant akselerert ved CSD-eksponering i en måned.Polarisasjonsmikroskopi viste tre forskjellige typer kollagenfibre, hvorav type en kollagenfibre vist i rødt er en risikofaktor for silikose, men det ble ikke funnet noen signifikant fibrose i kjøretøygruppen. Dette ble også indikert av de respektive fibroseskårene. HE-farging av CSD-behandlet mus lungevev viste typiske silikaknuter karakterisert ved flytende nekrose etter fagocytose av CSD i midten omgitt av makrofager i periferien.Massonfarging viste også at knutene var beriket med CSD ledsaget av fibrose. Den immunhistokjemiske fargingen av CD-68 avslørte videre den store tilstedeværelsen av makrofager i lungevev. Polarisert lysmikroskopi viste at disse makrofagene hadde inntatt CSD, noe som forårsaket alvorlig lungeskade.Immunhistokjemifarging viste høyere NF-kappa B-farging, noe som indikerer høyere inflammatorisk respons i gruppen behandlet med CSD enn i gruppen med vehikkel. Representativ western blot viste også at CSD-behandlede mus hadde høyere NF-kappa B-uttrykk i lungen, og forskjellen i uttrykk mellom de to gruppene var signifikant. For å unngå respiratorisk obstruksjon og fremme respiratorisk utvinning, må hjertet området av musen masseres forsiktig fem til 10 ganger som demonstrert etter en fem sekunders periode.Denne modellen kan utforske noen underliggende mekanisme for silikose og hjelpe terapeutisk legemiddelscreening, sammen med å etablere viktige parametere som dosering og varighet. Denne teknologien tilbyr et praktisk, effektivt og økonomisk middel for å utsette musemodeller for partikler om dette legger til bakterier. Overvåking av musens oppførsel kan hjelpe til med å bestemme de potensielle effektene av å inhalere partikler.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Mus Modell av kirurgisk indusert Endometriose av Auto-transplantasjon av livmor Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Mouse Modell av intraluminal MCAO: Cerebral infarct Evaluering av Cresyl Violet Farging

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MR Kartlegging av cerebrovaskulær reaktivitet via Gass Innånding Utfordringer

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Pulver og forstøvet Aerosol Innånding av Pharmaceuticals Levert til Mus Ved hjelp av en nese-bare Eksponeringssystem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Gjentatt måling av respiratorisk muskelaktivitet og ventilasjon i musemodeller av neuromuskulær Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Generasjon av kronisk obstruktiv lungesykdom modell i mus ved gjentatte ozon eksponering

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Vinyl klorid og High-fat Diet som en modell av miljø og fedme interaksjon

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vurdering av akutt innånding av luftbårne partikler ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftflytende grensesnitt

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...