Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

Denna studie stöddes av University Synergy Innovation Program i Anhui-provinsen (GXXT-2021-077) och Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).

Alla procedurer följde riktlinjerna i National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 8023, reviderad 1978) och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Medical School of Anhui University of Science and Technology.
1. Hantera och mata möss
<ol><li>Tilldela 20 friska C57BL/6-hanmöss till experiment- eller vehikelgrupperna i förhållandet 1:1. Acklimatisera mössen till den nya miljön under 1 vecka...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

Silikosmusmodeller är avgörande för att studera patogenesen och behandlingen av silikos. Detta protokoll beskriver en metod för att förbereda en modell av silikos hos möss genom upprepad nasal exponering. Denna metod gör det möjligt att studera de patologiska egenskaperna hos silikos som induceras av olika exponeringstider. Mössen sövdes i respirator och deras andningsfrekvens övervakades. Den initiala korta, snabba andningsfrekvensen avtog och fördjupades gradvis med tiden. Narkosen fick mössens muskler att...

Arbetstagare utsätts oundvikligen för oregelbundet kristallint kvartsdamm (CSD), som kan andas in och är giftigare i många yrkessammanhang, inklusive gruvdrift, keramik, glas, kvartsbearbetning och betong 1,2. Ett kroniskt damminandningstillstånd som kallas silikos orsakar progressiv lungfibros3. Enligt epidemiologiska data har förekomsten av silikos minskat globalt under de senaste decennierna, men under de senaste åren har den ökat och drabbat yngre människor 4,5,6. Den underliggande mekanismen för silikos utgör en betydande utmaning för vetenskaplig forskning på grund av dess smygande debut och utdragna inkubationstid. Det är fortfarande okänt hur silikos utvecklas. Dessutom finns det inga nuvarande mediciner som kan stoppa utvecklingen av silikos och reversera lungfibros.
De nuvarande musmodellerna för silikos involverar trakealt intag av en blandad suspension av CSD. Att till exempel administrera CSD i lungorna genom att anta cervikalt luftstrupstrauma efter anestesi överensstämmer inte med upprepad mänsklig exponering för färgdamm7. Effekterna av exponering för omgivande damm på individer kan studeras genom att utsätta dem för CSD i form av aerosoler, vilket mer exakt återspeglar miljökoncentrationerna av detta giftiga ämne8. Omgivnings-CSD kan dock inte bara andas in direkt i lungorna på grund av den unika fysiologiska strukturen hos musnäsan9. Dessutom är utrustningen som är förknippad med denna teknik dyr, vilket har fått forskare att omvärdera mussilikosmodellen10. Genom att inhalera CSD-suspension genom ett näsdropp fem gånger inom 2 veckor var det möjligt att bygga en dynamisk modell av silikos. Denna modell är konsekvent och säker samtidigt som den är lätt att använda. Det är viktigt att notera att denna studie tillåter upprepad inandning av CSD hos möss. Mussilikosmodellen som skapats genom denna procedur förväntas vara mer fördelaktig för forskningskraven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

Silikos kan orsakas av exponering för andningskristallint kvartsdamm (CSD) i en industriell miljö. Patofysiologin, screeningen och behandlingen av silikos hos människor har alla studerats utförligt med hjälp av mussilikosmodellen. Genom att upprepade gånger få möss att andas in CSD i lungorna kan mössen efterlikna de kliniska symtomen på human silikos. Denna metod är praktisk och effektiv när det gäller tid och produktion och orsakar inte mekanisk skada på de övre luftvägarna på grund av operation. Dessutom kan denna modell framgångsrikt efterlikna akut/kronisk transformationsprocess av silikos. De viktigaste förfarandena var följande. Det steriliserade 1-5 μm CSD-pulvret maldes helt, suspenderades i saltlösning och dispergerades i ett ultraljudsvattenbad i 30 minuter. Möss under isofluraninducerad anestesi övergick från ytlig snabb andning till djup, långsam aspiration i cirka 2 sekunder. Musen placerades i en handflata och tumspetsen rörde försiktigt vid läppkanten på musens käke för att räta ut luftvägarna. Efter varje utandning andades mössen in kiseldioxidsuspensionen droppe för droppe genom ena näsborren, vilket slutförde processen inom 4-8 sekunder. Efter att mössens andning hade stabiliserats smektes och smektes deras bröstkorg för att förhindra att den inandade CSD:n hostades upp. Mössen sattes sedan tillbaka i buren. Sammanfattningsvis kan denna modell kvantifiera CSD längs den typiska fysiologiska passagen av små partiklar in i lungan, från de övre luftvägarna till de terminala bronkiolerna och alveolerna. Det kan också replikera den återkommande exponeringen av anställda på grund av arbete. Modellen kan utföras av en person och behöver ingen dyr utrustning. Den simulerar bekvämt och effektivt sjukdomsegenskaperna hos human silikos med hög repeterbarhet.

Den potentiella patogenesen av silikos hos möss undersöktes med hjälp av den föreslagna metoden. Vi fann att kroppsvikten hos mössen i experimentgruppen minskade signifikant i förhållande till kontrollgruppen och att kroppsvikten återhämtade sig långsamt efter att exponeringen upphört. På grund av den optimerade dosen som används här observerades ingen dödlighet hos möss som exponerats för kiseldioxid i detta experiment. Den tekniska färdplanen för upprepat näsdropp till CSD visas i (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Detta protokoll beskriver en metod för att etablera en musmodell av silikos genom upprepad exponering för kiseldioxidsuspensioner via ett näsdropp. Denna modell kan effektivt, bekvämt och flexibelt efterlikna den patologiska processen för human silikos med hög repeterbarhet och ekonomi.

En silikosmusmodell som fastställts genom upprepad inandning av kristallint kvartsdamm

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

I den beskrivna mussilikosmodellen genererad genom intralaserinfusion av kristallkiseldioxiddamm, simulerade alla CSD-suspensioner flera gånger förekomsten och utvecklingen av human silikos i stor utsträckning. Denna metod är tidsbesparande och nivåbesparande, samt praktisk och effektiv. Orsakar inte heller någon mekanisk skada på de övre luftvägarna på grund av operationen.Denna metod kan också användas för att framställa sjukdomsmodeller av virus, bakterier och så vidare. En av dem som demonstrerar proceduren är Hangbing Cao, en masterstudent från mitt laboratorium, som är skicklig på att förbereda silikosmusmodellen. Börja med att förbereda kristallint kvartsdamm eller CSD minst en dag innan du administrerar näsdropparna.För att göra det, mal kiseldioxid i en agatmortel i en halvtimme. För att kontrollera partikelstorlek och form, förbered provet för svepelektronmikroskopi eller SEM med ledande tejp för att binda kiselpartiklarna. Använd en hårtork och blås försiktigt bort partiklarna som inte är ordentligt bundna innan du fortsätter att ta bilden.Blanda sedan den malda kiseldioxiden och steril saltlösning i en koncentration av 20 milligram per milliliter med hjälp av en ultraljudsshaker. Till sist, virvla den förberedda CSD-suspensionen i 10 sekunder. Administrera 50 mikroliter CSD till den sövda musen via näsdropp i fyra till åtta sekunder.Behandla kontrollmusen med lika mycket saltlösning, håll sedan musens kropp med handflatan, nyp huden på baksidan av nacken med tummen och pekfingret samtidigt som du fixerar musens bakben med de andra fingrarna. Tryck försiktigt på musens hjärtslagsområde med det andra pekfingret fem till 10 gånger i fem sekunder. Värm den paraffininbäddade lungvävnaden på en värmeplatta vid 60 grader Celsius i över fyra timmar.För att avvaxa och återfukta paraffinsektionen, blötlägg objektglaset i xylen i 30 minuter två gånger, doppa sedan objektglaset sekventiellt i fem minuter vardera i vattenfri 95 % 85 % och 75 % etanol, och slutligen i avjoniserat vatten, placera sedan objektglaset i hematoxylinfärgningshinken i 10 minuter innan du sköljer försiktigt under rinnande vatten i fem minuter. Doppa den i eosinfärgningshinken i 10 sekunder. Efter att ha dehydrerat provet i 75%85%95% och vattenfri etanol i fem minuter vardera, rensa vävnadssektionen genom att sänka ner den i xylen i fem minuter och försegla den med cirka 60 mikroliter neutrala hartsdroppar.Placera försiktigt locksliden över sektionen. För Masson-färgning, färga de avvaxade och hydratiserade paraffinproverna med nypreparerat 50 % Weigerts hematoxylin i 10 minuter, och skölj sedan glaset försiktigt med rinnande vatten för att se om cellkärnorna blir blånande efter att ha blötlagts i sur etanolförvätskning i 10 sekunder. Färga sedan provet med droppar röd färgningslösning i sju minuter och tvätta med 30 % saltsyraarbetslösning i en minut.Efter att ha doppat objektglaset i 95 % alkohol i 20 sekunder, torka provet med vattenfri etanol i en till tre sekunder två gånger, och som visats tidigare, rensa och försegla provet. För Sirius rödfärgning, infiltrera den avvaxade och hydratiserade delen i en timme med Sirius röd färgningslösning, färga sedan cellkärnorna i åtta till 10 minuter med Mayer hematoxlyn färgningslösning. Skölj den försiktigt under rinnande vatten i 10 minuter innan du torkar, rensar och förseglar objektglaset.Infiltrera det avvaxade och hydratiserade paraffinprovet med 30 ml av en EDTA-antigenlösning på tre milligram per milliliter. Koka provet i 20 till 30 minuter innan du tvättar det med avjoniserat vatten och inkuberar det i PBST i fem minuter. Blötlägg provet i 15 minuter med nyberedd 0,3 % väteperoxidlösning och tvätta det tre gånger i fem minuter vardera med PBST.Permeabilisera provets membran i 15 minuter med 0,3% Triton 100-lösning och blockera med 30 till 40 mikroliter 5% bovint serumalbumin eller BSA i en timme. Efter att ha avlägsnat den blockerande lösningen, tillsätt lämpligt utspädda primära antikroppar NF-kappa B och CD-68 och inkubera provet över natten vid två till åtta grader Celsius i en våt låda med IHC-mikroskop. Nästa dag, efter att ha överfört provet till rumstemperatur i en timme, tvätta det tre gånger i fem minuter vardera med PBST.Inkubera provet i en timme i kanin-antimus pepparrotsperoxidasmärkt sekundärt antikroppar vid rumstemperatur. Efter inkubationen, tvätta proverna igen tre gånger i fem minuter vardera med PBST, inkubera sedan provet med DAB-substratet som motsvarar enzymet märkt antikropp i fem till 20 minuter. Efter att ha släckt reaktionen med avjoniserat vatten, motfärga provet i 30 sekunder med Weigerts hematoxylin.Skölj den under rinnande vatten i en minut, torka ut, rensa och försegla vävnaden. Innan du går vidare till western blot-analys, homogenisera vävnaden med RIPA arbetslösning på is i fem minuter med hjälp av en handhållen elektrisk kvarn. Inkubera i en timme på is med skakning och centrifugera homogenatet vid 14 800 g i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Samla in supernatanten och bestäm proteinkoncentrationen med ett BCA-proteinanalyskit. Tillsätt 20 mikroliter 5X laddningsbuffert till supernatanten och värm sedan de sex mikrogram per mikroliter proteinlagringslösning som beretts med RIPA i ett metallbad vid 100 grader Celsius i 20 minuter. Förvara 100 mikroliter alikvoter av proteinlösningen i varje rör vid minus 80 grader Celsius.För elektrofores, späd alikvoter till två till tre mikrogram per mikroliter med RIPA-lysat och tillsätt sedan 20 mikrogram prov per brunn för att köra gelen. Överför proteinet till ett PVDF-membran som föraktiverats med metanol i 20 sekunder med våtöverföringsmetoden med 400 milliampere ström i en till två timmar. Efter att ha tvättat membranet fem gånger i fem minuter vardera med PBST-lösning, blockera med 5% BSA eller skummjölk i en timme.Sänk ner remsorna i den primära antikroppslösningen som innehåller NF-kappa B och betaaktin utspätt med 5 % BSA. Skaka remsorna försiktigt över natten vid två till åtta grader Celsius innan du tvättar dem med PBST. Inkubera sedan remsorna, först i den utspädda sekundära antikroppen i en timme vid rumstemperatur med försiktig skakning och sedan med förstärkt kemiluminiscensframkallare i tre minuter.Exponera remsan för en gelkamera i 20 sekunder och mät remsans gråvärde för att bedöma proteinnivån med systemprogramvara. SEM-bilderna från CSD visade att partiklarna var oregelbundet formade. Sirius rödfärgning utförd för att mäta kollagendeposition visade att progressionen av lungfibros hos möss påskyndades signifikant vid CSD-exponering under en månad.Polariserande mikroskopi avslöjade tre olika typer av kollagenfibrer, varav kollagenfibrer av typ ett som visas i rött är en riskfaktor för silikos, dock hittades ingen signifikant fibros i vehikelgruppen. Detta indikerades också av respektive fibrospoäng. HE-färgning av CSD-behandlad lungvävnad från möss visade typiska kiseldioxidknölar som karakteriseras av flytande nekros efter fagocytos av CSD i mitten omgiven av makrofager i periferin.Masson färgning visade också att knölarna var berikade med CSD åtföljd av fibros. Den immunhistokemiska färgningen av CD-68 avslöjade vidare den stora förekomsten av makrofager i lungvävnad. Polariserad ljusmikroskopi visade att dessa makrofager hade fått i sig CSD, vilket orsakade allvarliga lungskador.Immunhistokemisk färgning visade högre NF-kappa B-färgning, vilket indikerar högre inflammatoriskt svar i den CSD-behandlade gruppen än i vehikelgruppen. Representativ western blot visade också att de CSD-behandlade mössen hade högre NF-kappa B-uttryck i lungan, och skillnaden i uttryck mellan de två grupperna var signifikant. För att undvika andningsobstruktion och främja andningsåterhämtning måste musens hjärtområde försiktigt masseras fem till 10 gånger efter en femsekundersperiod.Denna modell kan utforska vissa underliggande mekanismer för silikos och underlätta terapeutisk läkemedelsscreening, tillsammans med att fastställa viktiga parametrar som dosering och varaktighet. Denna teknik erbjuder ett bekvämt, effektivt och ekonomiskt sätt att exponera musmodeller för partiklar oavsett om detta tillför bakterier. Övervakning av mösss beteende kan hjälpa till att bestämma de potentiella effekterna av inandning av partiklar.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

En musmodell av I livmodern Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Musmodell av kirurgiskt inducerad Endometrios av Auto-transplantation av uterus Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Musmodell av Intraluminal MCAO: cerebral infarkt Utvärdering av kresylviolett färgning

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Kartläggning av Cerebrovaskulär reaktivitet via Gas Inandning Utmaningar

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Pulver och nebuliserad Aerosol Inandning av läkemedel levereras till möss med användning av en näsa endast Exponeringssystem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Upprepade mätningar av andningsmuskelaktivitet och Ventilation i musmodeller av neuromuskulära sjukdomar

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Generation av en kronisk obstruktiv lungsjukdom modell hos möss av upprepade ozonexponering

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Vinylklorid och fettrik diet som en modell av miljö och fetma interaktion

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Bedömning av den akuta inandning toxicitet luftburna partiklar genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid air-liquid interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...