Name: a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

Bu çalışma, Anhui Eyaleti Üniversite Sinerji İnovasyon Programı (GXXT-2021-077) ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Lisansüstü İnovasyon Fonu (2021CX2120) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun (NIH Yayın No. 8023, 1978'de revize edilmiştir) yönergelerini takip etti ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Fareleri yönetmek ve beslemek
<ol><li>20 sağlıklı C57BL / 6 erkek fareyi deney veya araç gruplarına 1: 1 oranında atayın. Fareleri 1 haft...

<ol>
	<li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+cancer+burden:+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace.">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li><li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+is+failing+on+silicosis.">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).</li><li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+massive+fibrosis:+An+overview+of+the+recent+literature.">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 240, 108232 (2022).</li><li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicosis.">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li><li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+workers'+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States,+1999-2016.">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li><li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians.">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li><li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury.">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation.">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).</li><li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+responses+in+C3H/HeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles.">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact.">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis.">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose.">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li><li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies.">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis.">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice.">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).</li><li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes.">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).</li><li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice.">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li></ol>

Silikoz fare modelleri, silikozun patogenezini ve tedavisini incelemek için çok önemlidir. Bu protokol, tekrarlanan nazal maruziyet yoluyla farelerde bir silikoz modeli hazırlamak için bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, farklı maruz kalma sürelerinin neden olduğu silikozun patolojik özelliklerinin incelenmesine izin verir. Fareler ventilatörde uyuşturuldu ve solunum hızları izlendi. Başlangıçtaki kısa, hızlı solunum hızı zamanla yavaş yavaş yavaşladı ve derinleşti. Anestezi, farelerin kasların...

İşçiler kaçınılmaz olarak, solunabilen ve madencilik, çömlekçilik, cam, kuvars işleme ve beton 1,2 dahil olmak üzere çok sayıda mesleki bağlamda daha toksik olan düzensiz kristal silika tozuna (CSD) maruz kalmaktadır. Silikoz olarak bilinen kronik bir toz soluma durumu, ilerleyici akciğer fibrozuna neden olur3. Epidemiyolojik verilere göre, silikoz insidansı son birkaç on yılda küresel olarak azalmaktadır, ancak son yıllarda artmakta ve gençleri etkilemektedir 4,5,6. Silikozisin altında yatan mekanizma, sinsi başlangıcı ve uzun kuluçka süresi nedeniyle bilimsel araştırmalar için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Silikozun nasıl geliştiği hala bilinmemektedir. Ayrıca, mevcut hiçbir ilaç silikoz ve ters pulmoner fibrozisin ilerlemesini durduramaz.
Silikoz için mevcut fare modelleri, karışık bir CSD süspansiyonunun trakeal alımını içerir. Örneğin, anesteziden sonra servikal trakea travmasını benimseyerek CSD'nin akciğerlere uygulanması, insanların boya tozuna tekrar tekrar maruz kalmasına uymaz7. Ortam tozuna maruz kalmanın bireyler üzerindeki etkisi, bu toksik maddenin çevresel konsantrasyonlarını daha doğru bir şekilde yansıtan aerosoller şeklinde CSD'ye maruz bırakılarak incelenebilir8. Bununla birlikte, çevresel CSD, fare burnunun benzersiz fizyolojik yapısı nedeniyle doğrudan akciğerleresolunamaz 9. Ayrıca, bu teknolojiyle ilişkili ekipman pahalıdır ve bu da araştırmacıların fare silikoz model10'u yeniden değerlendirmesine neden olmuştur. CSD süspansiyonunu 2 hafta içinde beş kez burun akıntısı yoluyla soluyarak, dinamik bir silikoz modeli oluşturmak mümkün oldu. Bu model, kullanımı kolay olmasının yanı sıra tutarlı ve güvenlidir. Bu çalışmanın farelerde CSD'nin tekrar tekrar solunmasına izin verdiğine dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürle oluşturulan fare silikoz modelinin araştırma gereksinimleri için daha faydalı olması beklenmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-05-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin neutral fixative</td>
			<td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol disinfectant</td>
			<td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>biosharp life science</td>
			<td>BL619A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB chromogenic kit</td>
			<td>NJJCBio</td>
			<td>W026-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA protein assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP substrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>P90720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Sa00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iceacetic acid</td>
			<td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome stain kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AXYMCT150CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillatory thermostatic metal bath</td>
			<td>Abson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td>
			<td>PBM-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Slicer</td>
			<td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL601A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline&#160;</td>
			<td>The First People&#39;s Hospital of Huainan City</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Beyotime Biotechnological</td>
			<td>ST505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>ALC-110.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism7.0</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RODI IOT intelligent multifunctional water purification system</td>
			<td>RSJ</td>
			<td>RODI-220BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gel preparation kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0012A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon dioxid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BCBV6865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirius red staining</td>
			<td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>181012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>ZL-04A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (0.1&#8211;10 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (100&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L)</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex&#160;mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS GeminiSEM 500</td>
			<td>Zeiss Germany</td>
			<td>SEM 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0061R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a silicosis mouse model established by repeated inhalation of crystalline silica dust

Silikoz, endüstriyel bir ortamda solunum kristali silika tozuna (CSD) maruz kalmaktan kaynaklanabilir. İnsanlarda silikozun patofizyolojisi, taranması ve tedavisi, fare silikoz modeli kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Farelerin CSD'yi tekrar tekrar akciğerlerine solumasını sağlayarak, fareler insan silikozunun klinik semptomlarını taklit edebilir. Bu metodoloji, zaman ve çıktı açısından pratik ve verimlidir ve ameliyat nedeniyle üst solunum yollarında mekanik yaralanmaya neden olmaz. Ayrıca, bu model silikozisin akut/kronik dönüşüm sürecini başarılı bir şekilde taklit edebilir. Ana prosedürler aşağıdaki gibiydi. Sterilize edilmiş 1-5 μm CSD tozu tamamen öğütüldü, tuzlu su içinde süspanse edildi ve 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosunda dağıtıldı. İzofluran kaynaklı anestezi altındaki fareler, yaklaşık 2 saniye boyunca sığ hızlı solunumdan derin, yavaş aspirasyona geçti. Fare bir avucun içine yerleştirildi ve başparmak ucu, hava yolunu düzeltmek için farenin çenesinin dudak kenarına hafifçe dokundu. Her ekshalasyondan sonra, fareler silika süspansiyonunu bir burun deliğinden damla damla soluyarak işlemi 4-8 saniye içinde tamamladılar. Farelerin solunumu stabilize olduktan sonra, solunan CSD'nin öksürmesini önlemek için göğüsleri okşandı ve okşandı. Fareler daha sonra kafese geri döndü. Sonuç olarak, bu model, üst solunum yolundan terminal bronşiyollere ve alveollere kadar küçük parçacıkların akciğere tipik fizyolojik geçişi boyunca CSD'yi ölçebilir. Ayrıca, çalışanların iş nedeniyle tekrarlayan maruziyetini de çoğaltabilir. Model bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir ve pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymaz. İnsan silikozunun hastalık özelliklerini yüksek tekrarlanabilirlik ile rahat ve etkili bir şekilde simüle eder.

Farelerde silikozun potansiyel patogenezi önerilen yöntem kullanılarak araştırıldı. Deney grubundaki farelerin vücut ağırlığının kontrol grubuna göre önemli ölçüde azaldığını ve maruziyetin kesilmesinden sonra vücut ağırlığının yavaş yavaş iyileştiğini bulduk. Burada kullanılan optimize edilmiş doz nedeniyle, bu deneyde silikaya maruz kalan farelerde mortalite gözlenmemiştir. CSD'ye tekrarlanan burun akıntısının teknik yol haritası (Şekil 1)'de gö...

Watch this Scientific Journal Video about A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust at JoVE.com

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Bu protokol, bir burun damlası yoluyla silika süspansiyonlarına tekrar tekrar maruz kalma yoluyla bir fare silikoz modeli oluşturmak için bir yöntemi açıklar. Bu model, yüksek tekrarlanabilirlik ve ekonomi ile insan silikozunun patolojik sürecini verimli, rahat ve esnek bir şekilde taklit edebilir.

Kristal silika tozunun tekrar tekrar solunmasıyla oluşturulan bir silikoz fare modeli

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

Kristal silika tozunun intra lazer infüzyonu ile oluşturulan tarif edilen fare silikoz modelinde, tüm CSD süspansiyonu birkaç kez insan silikozunun oluşumunu ve gelişimini büyük ölçüde simüle etti. Bu yöntem, pratik ve etkili olduğu kadar zaman tasarrufu ve seviye tasarrufu sağlar. Ayrıca, operasyon nedeniyle üst solunum yollarında mekanik yaralanmaya neden olmaz.Bu yöntem aynı zamanda virüs, bakteri vb. hastalık modellerini hazırlamak için de kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan ve silikoz fare modelini hazırlama konusunda yetenekli olan Hangbing Cao olacak. Burun damlalarını uygulamadan en az bir gün önce kristal silika tozunu veya CSD'yi hazırlayarak başlayın.Bunu yapmak için, silikayı bir akik harcında yarım saat öğütün. Parçacık boyutunu ve şeklini kontrol etmek için, silikon parçacıklarını bağlamak için iletken bant kullanarak numuneyi taramalı elektron mikroskobu veya SEM için hazırlayın. Bir saç kurutma makinesi kullanarak, görüntüyü yakalamaya devam etmeden önce sıkıca bağlanmamış parçacıkları nazikçe üfleyin.Daha sonra, öğütülmüş silika ve steril salini, ultrasonik bir çalkalayıcı kullanarak mililitre başına 20 miligram konsantrasyonda karıştırın. Son olarak, hazırlanan CSD süspansiyonunu 10 saniye boyunca girdaplayın. Anestezi uygulanmış fareye dört ila sekiz saniye boyunca burun damlası yoluyla 50 mikrolitre CSD uygulayın.Kontrol faresine eşit miktarda salin uygulayın, ardından farenin gövdesini avuç içi ile tutun, farenin arka bacaklarını diğer parmaklarınızla sabitlerken başparmak ve işaret parmağınızla boynun arkasındaki cildi sıkıştırın. Farenin kalp atış alanına diğer işaret parmağıyla beş saniye boyunca beş ila 10 kez hafifçe bastırın. Parafine gömülü akciğer dokusunu sıcak bir plaka üzerinde 60 santigrat derecede dört saatten fazla ısıtın.Parafin bölümünü mumdan arındırmak ve nemlendirmek için, slaytı iki kez 30 dakika ksilen içinde bekletin, ardından slaytı sırayla beş dakika boyunca susuz% 95% 85 ve% 75 etanole ve son olarak deiyonize suya batırın, ardından slaytı beş dakika boyunca akan su altında hafifçe durulamadan önce 10 dakika hematoksilen boyama kovasına koyun. Eozin boyama kovasına 10 saniye batırın. Numuneyi %75, %85, %95 ve susuz etanol içinde her biri beş dakika dehidre ettikten sonra, doku bölümünü beş dakika boyunca ksilene batırarak temizleyin ve yaklaşık 60 mikrolitre nötr reçine damlası ile kapatın.Kapak sürgüsünü dikkatlice bölümün üzerine yerleştirin. Masson boyama için, mumdan arındırılmış ve hidratlanmış parafin örneklerini taze hazırlanmış %50 Weigert'in hematoksilen ile 10 dakika boyayın, ardından dokuyu asidik etanol sıvılaştırmasına 10 saniye batırdıktan sonra, çekirdeğin mavileşmesi için slaytı akan su ile hafifçe durulayın. Daha sonra, numuneyi yedi dakika boyunca kırmızı boyama solüsyonu damlaları ile boyayın ve bir dakika boyunca% 30 hidroklorik asit çalışma solüsyonu ile yıkayın.Slaytı 20 saniye boyunca %95 alkole batırdıktan sonra, numuneyi iki kez bir ila üç saniye susuz etanol ile kurutun ve daha önce gösterildiği gibi numuneyi temizleyin ve kapatın. Sirius kırmızı boyama için, Sirius kırmızı boyama solüsyonu ile bir saat boyunca mumsuz ve hidratlı bölüme sızın, ardından hücre çekirdeklerini Mayer hematokslyn boyama solüsyonu ile sekiz ila 10 dakika boyayın. Slaytı kurutmadan, temizlemeden ve mühürlemeden önce 10 dakika akan su altında nazikçe durulayın.Mumdan arındırılmış ve hidratlanmış parafin örneğini, mililitre başına üç miligramlık 30 mililitre EDTA antijen alma çözeltisi ile sızdırın. Numuneyi deiyonize suyla yıkamadan ve PBST'de beş dakika inkübe etmeden önce 20 ila 30 dakika kaynatın. Numuneyi taze hazırlanmış% 0.3 hidrojen peroksit çözeltisi ile 15 dakika bekletin ve her biri PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.Numunenin zarını 15 dakika boyunca% 0.3 Triton 100 çözeltisi ile geçirgen hale getirin ve bir saat boyunca 30 ila 40 mikrolitre% 5 sığır serum albümini veya BSA ile bloke edin. Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, uygun şekilde seyreltilmiş primer antikorlar NF-kappa B ve CD-68'i ekleyin ve numuneyi bir mikroskop lamı IHC ıslak kutusunda gece boyunca iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi bir saat oda sıcaklığına aktardıktan sonra, her biri PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.Numuneyi oda sıcaklığında tavşan anti-fare yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikorlarda bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri her biri PBST ile beş dakika boyunca üç kez tekrar yıkayın, ardından numuneyi enzim etiketli antikora karşılık gelen DAB substratı ile beş ila 20 dakika inkübe edin. Reaksiyonu deiyonize su ile söndürdükten sonra, numuneyi 30 saniye boyunca Weigert'in hematoksilen ile karşı boyayın.Akan su altında bir dakika durulayın, kurutun, temizleyin ve dokuyu kapatın. Western blot analizine geçmeden önce, el tipi bir elektrikli öğütücü kullanarak dokuyu RIPA çalışma solüsyonu ile buz üzerinde beş dakika homojenize edin. Çalkalayarak buz üzerinde bir saat inkübe edin ve homojenatı 14.800 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.Süpernatanı toplayın ve bir BCA protein tahlil kiti ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Süpernayana 20 mikrolitre 5X yükleme tamponu ekleyin, ardından RIPA ile hazırlanan mikrolitre protein depolama çözeltisi başına altı mikrogramı metal bir banyoda 100 santigrat derecede 20 dakika ısıtın. Her tüpte eksi 80 santigrat derecede 100 mikrolitre protein çözeltisi saklayın.Elektroforez için, alikotları RIPA lizat ile mikrolitre başına iki ila üç mikrograma seyreltin, ardından jeli çalıştırmak için oyuk başına 20 mikrogram numune ekleyin. Proteini, bir ila iki saat boyunca 400 miliamper akımlı ıslak transfer yöntemini kullanarak 20 saniye boyunca metanol ile önceden aktive edilmiş bir PVDF membranına aktarın. Membranı her biri PBST solüsyonu ile beş dakika boyunca beş kez yıkadıktan sonra,% 5 BSA veya yağsız süt ile bir saat boyunca bloke edin.Şeritleri, NF-kappa B ve %5 BSA ile seyreltilmiş beta aktin içeren birincil antikor çözeltisine daldırın. Şeritleri PBST ile yıkamadan önce gece boyunca iki ila sekiz santigrat derecede hafifçe çalkalayın. Daha sonra, şeritleri, önce seyreltilmiş ikincil antikorda oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak ve daha sonra üç dakika boyunca gelişmiş kemilüminesans geliştiricisi ile inkübe edin.Şeridi 20 saniye boyunca bir jel görüntüleyiciye maruz bırakın ve sistem yazılımı tarafından protein seviyesini değerlendirmek için şeridin gri değerini ölçün. CSD'nin SEM görüntüleri, parçacıkların düzensiz şekilli olduğunu gösterdi. Kollajen birikimini ölçmek için yapılan Sirius kırmızı boyama, farelerde pulmoner fibrozun ilerlemesinin bir ay boyunca CSD'ye maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde hızlandığını gösterdi.Polarize mikroskopi, kırmızı ile gösterilen birinci tip kollajen liflerinin silikozis için bir risk faktörü olduğu üç farklı kollajen lifi ortaya çıkardı, ancak araç grubunda önemli bir fibrozis bulunmadı. Bu aynı zamanda ilgili fibroz skorları ile de gösterildi. CSD ile tedavi edilen fare akciğer dokusunun HE boyaması, periferde makrofajlarla çevrili merkezde CSD'nin fagositozundan sonra sıvılaştırılmış nekroz ile karakterize tipik silika nodülleri gösterdi.Masson boyaması ayrıca nodüllerin fibrozis ile birlikte CSD ile zenginleştiğini gösterdi. CD-68'in immünohistokimya boyaması ayrıca akciğer dokusunda makrofajların geniş varlığını ortaya koydu. Polarize ışık mikroskobu, bu makrofajların CSD'yi yuttuğunu ve ciddi akciğer hasarına neden olduğunu gösterdi.İmmünohistokimya boyamasında daha yüksek NF-kappa B boyaması görüldü, bu da CSD ile tedavi edilen grupta araç grubuna göre daha yüksek inflamatuar yanıtı gösterdi. Temsili western blot ayrıca CSD ile tedavi edilen farelerin akciğerde daha yüksek NF-kappa B ekspresyonuna sahip olduğunu ve iki grup arasındaki ekspresyon farkının önemli olduğunu gösterdi. Solunum tıkanıklığını önlemek ve solunum iyileşmesini desteklemek için, farenin kalp bölgesine beş saniyelik bir süreden sonra gösterildiği gibi beş ila 10 kez hafifçe masaj yapılmalıdır.Bu model, silikozun altında yatan bazı mekanizmaları keşfedebilir ve dozaj ve süre gibi önemli parametrelerin oluşturulmasının yanı sıra terapötik ilaç taramasına yardımcı olabilir. Bu teknoloji, fare modellerini bakteri ekleyip eklemediğine bakılmaksızın partikül maddeye maruz bırakmak için uygun, etkili ve ekonomik bir yol sunar. Farelerin davranışlarının izlenmesi, partikül maddenin solunmasının potansiyel etkilerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Uterus Doku Otomatik nakli Cerrahi indüklenen Endometriozis Fare Modeli

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Intraluminar MCAO Mouse Model: kresil Violet Boyama tarafından Serebral İnfarktı Değerlendirilmesi

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

Gaz Soluma Zorluklar yoluyla Serebrovasküler Reaktivitesinin MRG Haritalama

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Kuru Toz ve Eczacılık Nebulize Aerosol Soluma bir Burun sadece Pozlama Sistemi Kullanarak Fare teslim

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Nöromusküler Hastalığının Fare Modelinde Solunum Kas Aktivitesi ve Havalandırma tekrarlanan ölçüm

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı manken tekrarlanan ozon maruz farelerde nesil

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Çevre ve Obezite Etkileşimi Modeli Olarak Vinil Klorür ve Yüksek Yağlı Diyet

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...