Name: infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions at JoVE.com

Diese Studie hat die folgenden Finanzierungsquellen: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. und N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. und N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. und N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Die Verwendung von Nasenproben wurde vom University of Pennsylvania Institutional Review Board (Protokoll # 800614) und dem Philadelphia VA Institutional Review Board (Protokoll # 00781) genehmigt.
1. Infektion von nasalen ALI-Kulturen
ANMERKUNG: Die Gewinnung klinischer Proben sowie das Wachstum und die Differenzierung von nasalen ALI-Kulturen liegen außerhalb des Rahmens dieser Arbeit. Spezifische Methoden zur Kultivierung primärer nasaler Epithel...

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	<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+primary+nasal+epithelial+cells+differentiates+among+lethal+and+seasonal+human+coronaviruses.">Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).</li><li>Fehr, A., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses:+An+overview+of+their+replication+and+pathogenesis.">Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).</li><li>Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. 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European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update">https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update</a> (2022)</li><li>Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+clinical+features+of+patients+with+2019+novel+coronavirus+SARS-CoV-2:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+upper+airway+innate+immunity.">New insights into upper airway innate immunity.</a> American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).</li><li>Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+function+of+airway+epithelial+cells+in+inflammatory+lung+disease.">The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease.</a> European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).</li><li>Hatton, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+induction+of+type+I+and+III+interferons+mediates+nasal+epithelial+cell+permissiveness+to+SARS-CoV-2.">Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2.</a> Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).</li><li>Sungnak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+factors+are+highly+expressed+in+nasal+epithelial+cells+together+with+innate+immune+genes.">SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes.</a> Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).</li><li>Comar, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aflatoxins+reduce+respiratory+mucosal+ciliary+function.">Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function.</a> Scientific Reports. 6, 33221 (2016).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis.">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+Using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).</li><li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance.">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).</li><li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance.">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li><li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin.">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia.">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).</li><li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium.">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).</li><li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells.">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).</li><li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air&#8722;liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract:+Promises,+challenges,+and+future+directions.">Air&#8722;liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).</li><li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium.">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding,+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13.">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden beschreiben ein primäres Epithelkultursystem, in dem von Patienten stammende Nasenepithelzellen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet und zur Untersuchung von HCoV-Wirt-Interaktionen eingesetzt werden. Nach der Differenzierung rekapitulieren diese nasalen ALI-Kulturen viele Merkmale des in vivo Nasenepithels, einschließlich einer heterogenen Zellpopulation mit Flimmer-, Kelch- und Basalzellen sowie einer intakten mukoziliären Funktion mit robust schlagenden Zilien...

Bisher wurden sieben humane Coronaviren (HCoVs) identifiziert, die eine Reihe von Atemwegserkrankungen verursachen2. Die häufigen oder saisonalen HCoVs (HCoV-NL63, -229E, -OC43 und -HKU1) sind typischerweise mit der Pathologie der oberen Atemwege assoziiert und verursachen jährlich schätzungsweise 10 % bis 30 % der Erkältungsfälle. Obwohl dies der typische klinische Phänotyp ist, der mit den häufigen HCoVs assoziiert ist, können diese Viren in Risikopopulationen, einschließlich Kindern, älteren Erwachsenen und immungeschwächten Personen, signifikantere Erkrankungen der unteren Atemwege verursachen 3,4. In den letzten 20 Jahren sind drei pathogene HCoVs aufgetaucht und haben erhebliche Notlagen im Bereich der öffentlichen Gesundheit verursacht, darunter das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)-CoV, das Atemwegssyndrom des Nahen Ostens (MERS)-CoV und SARS-CoV-2. Tödliche HCoVs sind mit schwereren Atemwegserkrankungen assoziiert, was durch die Sterblichkeitsrate von >34 % im Zusammenhang mit MERS-CoV-Fällen (894 Todesfälle bei über 2.500 Fällen seit dem Auftreten im Jahr 2012) deutlich wird5,6. Es ist wichtig zu beachten, dass die tödlichen HCoVs auch eine Reihe von Atemwegserkrankungen verursachen, von asymptomatischen Infektionen bis hin zu tödlichen Lungenentzündungen, wie bei der anhaltenden COVID-19-Pandemiezu sehen ist 7.
HCoVs gelangen wie andere respiratorische Erreger in die Atemwege und etablieren eine produktive Infektion im Nasenepithel8. Es wird angenommen, dass die Ausbreitung in die unteren Atemwege mit der Aspiration von der Mund-/Nasenhöhle in die Lunge verbunden ist, wo HCoVs eine bedeutendere Pathologie der unteren Atemwege verursachen 9,10,11. Somit dient die Nase als Ausgangspforte für den Viruseintritt und ist mit ihrer robusten mukoziliären Clearance-Maschinerie und einzigartigen angeborenen Immunmechanismen, die darauf abzielen, eine weitere Ausbreitung des Virus in die unteren Atemwege zu verhindern, die primäre Barriere für Infektionen12,13. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Nasenepithelzellen überdurchschnittlich hohe basale Konzentrationen von antiviralen Interferonen und Interferon-stimulierten Genen exprimieren, was darauf hindeutet, dass Nasenzellen auf frühe Reaktionen auf Atemwegsviren vorbereitet sein könnten14,15,16.
Wir haben zuvor von Patienten stammende primäre Nasenepithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gezüchtet wurden, verwendet, um HCoV-Wirt-Interaktionen in der Nase zu modellieren, wo HCoV-Infektionen beginnen. Nasale ALI-Kulturen sind sowohl für pathogene (SARS-CoV-2 und MERS-CoV) als auch für gängige HCoVs (HCoV-NL63 und HCoV-229E) permissiv und bieten verschiedene Vorteile gegenüber herkömmlichen Atemwegsepithelzelllinien wie A549 (eine Lungenadenokarzinom-Zelllinie)16,17. Nach der Differenzierung enthalten nasale ALI-Kulturen eine heterogene zelluläre Population und weisen viele der Funktionen auf, die vom in vivo Nasenepithel erwartet werden, wie z. B. die mukoziliäre Clearance-Maschinerie18. Nasenzellen bieten auch Vorteile gegenüber Kultursystemen der unteren Atemwege (z. B. humane Bronchialepithelzellen, HBECs), da die Gewinnung von Nasenepithelzellen durch zytologisches Zähneputzen im Vergleich zur Verwendung von Techniken wie der Bronchoskopie zur Erzielung von HBECs deutlich weniger invasiv ist 19,20,21.
In dieser Arbeit werden Methoden zur Nutzung dieses nasalen ALI-Kultursystems zur Charakterisierung von HCoV-Wirt-Interaktionen im Nasenepithel beschrieben. Wir haben diese Methoden in kürzlich veröffentlichten Arbeiten angewendet, um SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 und HCoV-229E 1,16,17 zu vergleichen. Obwohl diese Methoden und repräsentativen Ergebnisse die Untersuchung von HCoVs in diesem nasalen Zellmodell hervorheben, ist das System in hohem Maße anpassungsfähig an andere HCoVs sowie andere respiratorische Krankheitserreger. Darüber hinaus können diese Methoden breiter auf andere ALI-Kultursysteme angewendet werden, um die virale Replikation und den zellulären Tropismus sowie die Zytotoxizität und die Induktion des angeborenen Immunsystems nach einer Infektion zu untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endohm-6G measurement chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9326-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW software for imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40641-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLC-MK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-7</td>
			<td>To titrate HCoV-NL63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td>
			<td>BEI Resources&#160;</td>
			<td>NR-44260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40068-MM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC5AC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAB91539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH34000000</td>
			<td>Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89990</td>
			<td>Can prep in-house or purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-52281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX135357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV &#946;- tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroCCL81 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>To titrate MERS-CoV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroE6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>To titrate SARS-CoV-2</td>
		</tr>
	</tbody>
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infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions

Drei hochpathogene humane Coronaviren (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) und SARS-CoV-2 (2019) - sind aufgetaucht und haben in den letzten 20 Jahren erhebliche Krisen im Bereich der öffentlichen Gesundheit verursacht. Vier weitere HCoVs verursachen jedes Jahr einen signifikanten Anteil an Erkältungsfällen (HCoV-NL63, -229E, -OC43 und -HKU1), was die Bedeutung der Untersuchung dieser Viren in physiologisch relevanten Systemen unterstreicht. HCoVs dringen in die Atemwege ein und infizieren sich im Nasenepithel, dem primären Ort, an dem alle respiratorischen Krankheitserreger auftreten. Wir verwenden ein primäres nasales Epithelkultursystem, bei dem von Patienten stammende Nasenproben an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gezüchtet werden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen an diesem wichtigen Sentinel-Ort zu untersuchen. Diese Kulturen rekapitulieren viele Merkmale der In-vivo-Atemwege , einschließlich der vorhandenen Zelltypen, der Ziliarfunktion und der Schleimproduktion. Wir beschreiben Methoden zur Charakterisierung der viralen Replikation, des Wirtszelltropismus, der virusinduzierten Zytotoxizität und der Induktion des angeborenen Immunsystems in nasalen ALI-Kulturen nach HCoV-Infektion, wobei wir aktuelle Arbeiten zum Vergleich von letalen und saisonalen HCoVs als Beispiel verwenden1. Ein besseres Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen in der Nase hat das Potenzial, neue Angriffspunkte für antivirale Therapeutika gegen HCoVs und andere Atemwegsviren zu liefern, die wahrscheinlich in Zukunft auftauchen werden.

Die repräsentativen Abbildungen sind teilweise aus Daten adaptiert, die im Manuskript Otter et al.1 zu finden sind. Nasale ALI-Kulturen, die von vier oder sechs Spendern stammten, wurden gemäß den oben beschriebenen Protokollen mit einem von vier HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 und HCoV-229E) infiziert, und die durchschnittlichen apikal ausgeschiedenen Virustiter für jedes Virus sind in Abbildung 1A dargestellt. Während sich alle vier HCoVs produktiv in na...

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Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Das Nasenepithel ist die primäre Barrierestelle, auf die alle respiratorischen Krankheitserreger treffen. In dieser Arbeit skizzieren wir Methoden zur Verwendung von primären nasalen Epithelzellen, die als Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) gezüchtet wurden, um menschliche Coronavirus-Wirt-Interaktionen in einem physiologisch relevanten System zu charakterisieren.

Infektion von primären nasalen Epithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden, zur Charakterisierung menschlicher Coronavirus-Wirt-Interaktionen

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...