Name: infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions at JoVE.com

이 연구의 자금 출처는 다음과 같습니다: 미국 국립보건원(NIH) R01AI 169537(S.R.W. 및 N.A.C.), NIH R01AI 140442(S.R.W.), VA Merit Review CX001717(N.A.C.), VA Merit Review BX005432(S.R.W. 및 N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation(S.R.W. 및 N.A.C.), T32 AI055400(CJO), T32 AI007324(AF).

비강 검체의 사용은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(프로토콜 # 800614) 및 필라델피아 VA 기관 검토 위원회(프로토콜 # 00781)의 승인을 받았습니다.
1. 비강 ALI 배양 감염
참고: 임상 검체의 획득과 비강 ALI 배양의 성장 및 분화는 이 논문의 범위를 벗어납니다. 일차 비강 상피 세포를 배양하기 위한 구체적인 방법은 이러한 배양물을 이용하여 ...

<ol>
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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium.">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).</li><li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells.">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).</li><li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air&#8722;liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract:+Promises,+challenges,+and+future+directions.">Air&#8722;liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).</li><li>Seibold, M. 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여기에 자세히 설명된 방법은 환자 유래 비강 상피 세포가 공기-액체 계면에서 성장하고 HCoV-숙주 상호 작용 연구에 적용되는 1차 상피 배양 시스템을 설명합니다. 일단 분화되면, 이러한 비강 ALI 배양은 섬모, 잔 및 기저 세포가 대표되는 이질적인 세포 집단뿐만 아니라 섬모와 점액 분비가 강력하게 박동하는 온전한 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 많은 특징을 요약합니다...

현재까지 7종의 인간 코로나바이러스(HCoV)가 확인되었으며 다양한 호흡기 질환을 유발합니다2. 일반적인 또는 계절성 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)는 일반적으로 상기도 병리와 관련이 있으며 매년 일반적인 감기 사례의 약 10%-30%를 유발합니다. 이는 일반적인 HCoV와 관련된 전형적인 임상 표현형이지만, 이러한 바이러스는 어린이, 노인 및 면역 저하자를 포함한 위험에 처한 인구 집단에서 더 심각한 하기도 질환을 유발할 수 있습니다 3,4. 중증급성호흡기증후군(SARS)-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)-CoV, SARS-CoV-2 등 3가지 병원성 HCoV가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중보건 비상사태를 일으켰습니다. 치명적 HCoV는 더 심각한 호흡기 병리와 관련이 있으며, 이는 MERS-CoV 사례와 관련된 >34%의 치사율(2012년 출현 이후 2,500건 이상의 사례에서 894명 사망)5,6으로 명확하게 설명됩니다. 또한 현재 진행 중인 COVID-19 팬데믹에서 볼 수 있듯이 치명적인 HCoV는 무증상 감염에서 치명적인 폐렴에 이르기까지 다양한 호흡기 질환을 유발한다는 점에 유의해야 합니다7.
HCoV는 다른 호흡기 병원체와 마찬가지로 호흡기로 들어가 비강 상피에 생산적인 감염을 일으킨다8. 하기도로의 전이는 구강/비강에서 폐로의 흡인과 관련이 있는 것으로 생각되며, 여기서 HCoV는 더 심각한 하기도 병리를 유발한다 9,10,11. 따라서, 코는 바이러스 진입을 위한 초기 관문 역할을 하며, 강력한 점액섬모 제거 기계와 하부 기도로의 바이러스 확산을 막기 위한 독특한 선천성 면역 기전을 통해 감염에 대한 주요 장벽이 된다12,13. 예를 들어, 비강 상피세포는 항바이러스 인터페론 및 인터페론 자극 유전자의 평균 기초 수준보다 높은 발현을 하는 것으로 보고되었으며, 이는 비강 세포가 호흡기 바이러스에 대한 조기 반응을 위해 준비될 수 있음을 나타냅니다14,15,16.
우리는 이전에 HCoV 감염이 시작되는 코에서 HCoV-숙주 상호 작용을 모델링하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 성장한 환자 유래 일차 비강 상피 세포를 활용했습니다. 비강 ALI 배양은 병원성(SARS-CoV-2 및 MERS-CoV)과 일반적인 HCoV(HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 모두에 허용되며 A549(폐 선암 세포주)16,17와 같은 기존 기도 상피 세포주에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 분화 후, 비강 ALI 배양물은 이질적인 세포 집단을 포함하며, 점액섬모 청소 기계(mucociliary clearance mechanism)와 같은 생체 내 비강 상피에서 기대되는 많은 기능을 나타낸다18. 또한 비강 세포는 하부 기도 배양 시스템(예: 인간 기관지 상피 세포, HBEC)에 비해 이점을 제공하는데, 이는 세포학적 칫솔질을 통한 비강 상피 세포 획득이 HBECs 19,20,21을 얻기 위해 기관지 내시경과 같은 기술을 사용하는 것에 비해 훨씬 덜 침습적이기 때문입니다.
이 논문은 이 비강 ALI 배양 시스템을 활용하여 비강 상피에서 HCoV-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을 설명합니다. SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E를 비교하기 위해 최근 발표된 연구에서 이러한 방법을 적용했습니다 1,16,17. 이러한 방법과 대표적인 결과는 이 비강 세포 모델에서 HCoV에 대한 연구를 강조하지만, 이 시스템은 다른 HCoV 및 기타 호흡기 병원체에 매우 잘 적응합니다. 또한, 이러한 방법은 바이러스 복제 및 세포 영양성뿐만 아니라 감염 후 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 조사하기 위해 다른 ALI 배양 시스템에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endohm-6G measurement chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9326-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW software for imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40641-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLC-MK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-7</td>
			<td>To titrate HCoV-NL63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td>
			<td>BEI Resources&#160;</td>
			<td>NR-44260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40068-MM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC5AC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAB91539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH34000000</td>
			<td>Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89990</td>
			<td>Can prep in-house or purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-52281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX135357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV &#946;- tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroCCL81 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>To titrate MERS-CoV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroE6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>To titrate SARS-CoV-2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions

SARS-CoV(2002년), MERS-CoV(2012년), SARS-CoV-2(2019년)의 세 가지 고병원성 인간 코로나바이러스(HCoV)가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중 보건 위기를 초래했습니다. 매년 4개의 추가 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)가 일반적인 감기 사례의 상당 부분을 유발하며, 이는 생리학적으로 관련된 시스템에서 이러한 바이러스를 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. HCoV는 호흡기로 들어가 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 부위인 비강 상피에 감염을 일으킵니다. 당사는 환자 유래 비강 샘플이 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되는 1차 비강 상피 배양 시스템을 사용하여 이 중요한 감시 부위에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구합니다. 이러한 배양은 존재하는 세포 유형, 섬모 기능 및 점액 생성을 포함하여 생체 내 기도의 많은 특징을 요약합니다. 치사량과 계절성 HCoV를 비교한 최근 연구를 예시1로 사용하여 HCoV 감염 후 비강 ALI 배양에서 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 바이러스 유도 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 코에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 HCoV 및 향후 등장할 가능성이 있는 기타 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 치료제의 새로운 표적을 제공할 수 있습니다.

대표적인 수치는 원고 Otter et al.1에서 찾을 수 있는 데이터에서 부분적으로 각색되었습니다. 4명 또는 6명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 4가지 HCoV(SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 중 하나에 감염되었으며, 각 바이러스에 대한 평균 정점 탈락 바이러스 역가는 그림 1A에 나와 있습니다. 이 4가지 HCoV는 모두 비강 ALI...

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Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...