Name: infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions at JoVE.com

Este estudio cuenta con las siguientes fuentes de financiamiento: Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01AI 169537 (S.R.W. y N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. y N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. y N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

El uso de muestras nasales fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania (protocolo # 800614) y la Junta de Revisión Institucional de VA de Filadelfia (protocolo # 00781).
1. Infección de cultivos nasales de ALI
NOTA: La adquisición de muestras clínicas, así como el crecimiento y la diferenciación de cultivos nasales de ALI, están fuera del alcance de este trabajo. Los métodos específicos para el cultiv...

<ol>
	<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+primary+nasal+epithelial+cells+differentiates+among+lethal+and+seasonal+human+coronaviruses.">Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).</li><li>Fehr, A., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses:+An+overview+of+their+replication+and+pathogenesis.">Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).</li><li>Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+clinical+presentations+of+the+four+human+coronaviruses+229E,+HKU1,+NL63,+and+OC43+detected+over+3+years+using+a+novel+multiplex+real-time+PCR+method.">Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).</li><li>Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+the+seven+pathogenic+human+coronaviruses.">An overview on the seven pathogenic human coronaviruses.</a> Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).</li><li>MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update">https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update</a> (2022)</li><li>Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+clinical+features+of+patients+with+2019+novel+coronavirus+SARS-CoV-2:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li><li>Farzal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+simulated+nebulized+and+spray+particle+deposition+in+chronic+rhinosinusitis+patients.">Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).</li><li>Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral-lung+axis:+The+impact+of+oral+health+on+lung+health.">The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health.</a> Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+reverse+genetics+reveals+a+variable+infection+gradient+in+the+respiratory+tract.">SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract.</a> Cell. 182, 429-446 (2020).</li><li>Hariri, B. M., Cohen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+upper+airway+innate+immunity.">New insights into upper airway innate immunity.</a> American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).</li><li>Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+function+of+airway+epithelial+cells+in+inflammatory+lung+disease.">The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease.</a> European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).</li><li>Hatton, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+induction+of+type+I+and+III+interferons+mediates+nasal+epithelial+cell+permissiveness+to+SARS-CoV-2.">Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2.</a> Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).</li><li>Sungnak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+factors+are+highly+expressed+in+nasal+epithelial+cells+together+with+innate+immune+genes.">SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes.</a> Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).</li><li>Comar, C. 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S., Ennis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+obtained+from+patients+with+COPD.">Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD.</a> PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).</li><li>Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+to+assess+in+vitro+immune+responses+to+respiratory+virus+infection+in+pregnant+women+with+asthma.">Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma.</a> Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aflatoxins+reduce+respiratory+mucosal+ciliary+function.">Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function.</a> Scientific Reports. 6, 33221 (2016).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis.">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+Using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).</li><li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance.">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).</li><li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance.">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li><li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin.">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia.">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).</li><li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium.">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).</li><li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells.">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).</li><li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air&#8722;liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract:+Promises,+challenges,+and+future+directions.">Air&#8722;liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).</li><li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium.">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding,+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13.">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).</li></ol>

Los métodos que se detallan aquí describen un sistema de cultivo epitelial primario en el que las células epiteliales nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido y se aplican al estudio de las interacciones HCoV-huésped. Una vez diferenciados, estos cultivos nasales de ALI recapitulan muchas características del epitelio nasal in vivo , incluida una población celular heterogénea con células ciliadas, caliciformes y basales representadas, así como una función mucociliar intac...

Hasta la fecha se han identificado siete coronavirus humanos (HCoV) que causan una serie de enfermedades respiratorias2. Los HCoV comunes o estacionales (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1) generalmente se asocian con patología del tracto respiratorio superior y causan aproximadamente entre el 10% y el 30% de los casos de resfriado común anualmente. Aunque este es el fenotipo clínico típico asociado con los HCoV comunes, estos virus pueden causar una enfermedad más significativa del tracto respiratorio inferior en poblaciones de riesgo, incluidos niños, adultos mayores e inmunodeprimidos 3,4. En los últimos 20 años han surgido tres HCoV patógenos que han causado importantes emergencias de salud pública, entre ellos el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV y el SARS-CoV-2. Los HCoV letales se asocian con una patología más grave de las vías respiratorias, lo que queda claramente ilustrado por la tasa de letalidad del >34% asociada a los casos de MERS-CoV (894 muertes en más de 2.500 casos desde su aparición en 2012)5,6. Es importante tener en cuenta que los HCoV letales también causan una serie de enfermedades de las vías respiratorias, desde infecciones asintomáticas hasta neumonía letal, como se ha visto con la actual pandemia de COVID-197.
Los HCoV, al igual que otros patógenos respiratorios, entran en el tracto respiratorio y establecen una infección productiva en el epitelio nasal8. Se cree que la diseminación a la vía aérea inferior está asociada con la aspiración desde la cavidad oral/nasal hasta el pulmón, donde los HCoV causan una patología más significativa del tracto respiratorio inferior 9,10,11. Por lo tanto, la nariz sirve como el portal inicial para la entrada viral y es la principal barrera para la infección con su robusta maquinaria de eliminación mucociliar y mecanismos inmunológicos innatos únicos destinados a prevenir una mayor propagación viral a las vías respiratorias inferiores12,13. Por ejemplo, se ha reportado que las células epiteliales nasales expresan niveles basales más altos que el promedio de interferones antivirales y genes estimulados por interferón, lo que indica que las células nasales pueden estar preparadas para respuestas tempranas a virus respiratorios14,15,16.
Anteriormente hemos utilizado células epiteliales nasales primarias derivadas de pacientes cultivadas en una interfaz aire-líquido (ALI) para modelar las interacciones entre el HCoV y el huésped en la nariz, donde comienzan las infecciones por HCoV. Los cultivos nasales de ALI son permisivos tanto para los HCoV patógenos (SARS-CoV-2 y MERS-CoV) como para los comunes (HCoV-NL63 y HCoV-229E) y ofrecen varias ventajas sobre las líneas celulares epiteliales tradicionales de las vías respiratorias, como A549 (una línea celular de adenocarcinoma de pulmón)16,17. Después de la diferenciación, los cultivos nasales de ALI contienen una población celular heterogénea y exhiben muchas de las funciones esperadas del epitelio nasal in vivo, como la maquinaria de depuración mucociliar18. Las células nasales también ofrecen ventajas sobre los sistemas de cultivo de la vía aérea inferior (como las células epiteliales bronquiales humanas, HBEC), ya que la adquisición de células epiteliales nasales a través del cepillado citológico es significativamente menos invasiva en comparación con el uso de técnicas como la broncoscopia para la obtención de HBEC 19,20,21.
En este artículo se describen los métodos para utilizar este sistema de cultivo nasal de ALI para caracterizar las interacciones HCoV-huésped en el epitelio nasal. Hemos aplicado estos métodos en trabajos publicados recientemente para comparar SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E 1,16,17. Aunque estos métodos y resultados representativos enfatizan el estudio de los HCoV en este modelo de células nasales, el sistema es altamente adaptable a otros HCoV, así como a otros patógenos respiratorios. Además, estos métodos pueden aplicarse de forma más amplia a otros sistemas de cultivo de ALI para investigar la replicación viral y el tropismo celular, así como la citotoxicidad y la inducción inmunitaria innata tras la infección.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endohm-6G measurement chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9326-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW software for imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40641-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLC-MK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-7</td>
			<td>To titrate HCoV-NL63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td>
			<td>BEI Resources&#160;</td>
			<td>NR-44260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40068-MM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC5AC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAB91539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH34000000</td>
			<td>Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89990</td>
			<td>Can prep in-house or purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-52281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX135357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV &#946;- tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroCCL81 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>To titrate MERS-CoV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroE6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>To titrate SARS-CoV-2</td>
		</tr>
	</tbody>
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infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions

En los últimos 20 años han surgido tres coronavirus humanos altamente patógenos —el SARS-CoV (2002), el MERS-CoV (2012) y el SARS-CoV-2 (2019)— que han causado importantes crisis de salud pública. Cuatro HCoV adicionales causan una parte significativa de los casos de resfriado común cada año (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1), lo que destaca la importancia de estudiar estos virus en sistemas fisiológicamente relevantes. Los HCoV ingresan al tracto respiratorio y establecen la infección en el epitelio nasal, el sitio principal que encuentran todos los patógenos respiratorios. Utilizamos un sistema de cultivo epitelial nasal primario en el que las muestras nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido (ALI) para estudiar las interacciones huésped-patógeno en este importante sitio centinela. Estos cultivos recapitulan muchas características de la vía aérea in vivo , incluidos los tipos de células presentes, la función ciliar y la producción de moco. Describimos métodos para caracterizar la replicación viral, el tropismo de la célula huésped, la citotoxicidad inducida por virus y la inducción inmune innata en cultivos nasales de ALI después de la infección por HCoV, utilizando como ejemplo trabajos recientes que comparan HCoV letales y estacionales1. Una mayor comprensión de las interacciones huésped-patógeno en la nariz tiene el potencial de proporcionar nuevos objetivos para la terapéutica antiviral contra los HCoV y otros virus respiratorios que probablemente surjan en el futuro.

Las figuras representativas están parcialmente adaptadas de los datos que se pueden encontrar en el manuscrito Otter et al.1. Los cultivos nasales de ALI derivados de cuatro o seis donantes se infectaron con uno de los cuatro HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E) de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente, y los títulos virales promedio de diseminación apical para cada virus se representan en la Figura 1A. Si bien estos cuatro HCoV se replic...

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Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

El epitelio nasal es el principal sitio de barrera que encuentran todos los patógenos respiratorios. Aquí, describimos métodos para utilizar células epiteliales nasales primarias cultivadas como cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped en un sistema fisiológicamente relevante.

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...